雪貂感染流感病毒H3N2动物模型的建立

目的建立甲型流感病毒H3N2感染的雪貂动物模型。方法按实验要求筛选出流感抗体反应阴性的雪貂,经兽用氯胺酮轻度麻醉后进行滴鼻感染H3N2流感病毒株A/Brisbane/10/07,设立两个稀释度106和107 TCID50,每个稀释度接种3只雪貂,感染后第5天安乐处死。感染前采集鼻甲骨活检,感染后1～5 d鼻甲骨活检检测病毒载量,每天记录雪貂一般临床变化。处死时取雪貂肺、肝、脾、小肠、脑组织作病毒滴度检测,肺组织做病理检查。结果 106和107TCID50的H3N2病毒分别感染雪貂,没有雪貂死亡。雪貂感染后都出现一过性的体温升高,体重的下降,流涕、打喷嚏等症状。在鼻甲骨活检物中可测到病毒载量,肠组织可分离到病毒。肺组织以轻度性间质性肺炎为主要病理变化。结论雪貂感染H3N2病毒株A/Brisbane/10/07后,临床表现、病毒学、分子生物学、病理学方面的检测都可以证实雪貂感染H3N2病毒动物模型已建立,其中106 TCID50病毒滴度的是一个建立感染动物模型比较合适的剂量。     

同时检测新甲型H1N1及人季节性H1N1和H3N2流感病毒的单管多重荧光定量PCR方法

本研究设计的一种4重荧光定量RT-PCR检测方法,以A型流感病毒各亚型的血凝素基因(HA)为检测靶标,实现了同时检测新甲型H1N1流感病毒、人季节性H1N1流感病毒和人季节性H3N2流感病毒。本法使用人细胞RNA酶P基因作为内参,以判断标本来源和实施质量控制。利用不同来源和亚型的流感病毒验证了该方法的特异性;利用连续稀释的新甲型H1N1流感病毒HA全基因体外转录物进行灵敏度分析。结果表明该方法灵敏度高,可检测低至20个拷贝的RNA;特异性强,每对引物只检测出对应的病毒,无交叉反应;并且成功地验证性检验了34份新甲型H1N1流感病毒阳性临床标本和20份人季节性H1N1和H3N2流感病毒及人乙型(HB)流感病毒阳性临床标本。因此,该多重荧光定量RT-PCR法是一种可同时检测2009年新甲型流感病毒及季节性流感病毒的有效方法。     

甲型H1N1流感病毒核酸荧光定量RT-PCR检测技术

目的:建立基于TaqMan荧光探针技术的甲型H1N1流感病毒实时定量RT-PCR方法。方法:分析H1N1流感病毒基因特性,根据新发甲型H1N1流感病毒突变基因片段设计检测引物和TaqMan荧光探针,建立荧光定量RT-PCR检测体系,体外转录制备RNA标准品,进行特异性、敏感性、重复性及盲样检测评价实验。结果:可特异性有效检测新发甲型H1N1流感病毒核酸,与H1～H16流感病毒基因无交叉反应;对RNA标准品的检测敏感性达103拷贝/μL;重复性实验中,阳性标准品Ct值变异系数(CV)10%,阴性标准品检测结果均呈阴性;12份盲样检测结果特异性好。结论:该荧光定量RT-PCR方法可作为甲型H1N1流感防控的病原快速诊断技术。     

季节性流感病毒H1N1实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立一种快速定量检测季节性流感病毒H1N1核酸的实时荧光定量PCR检测方法及试剂盒。方法选择季节性流感病毒H1N1的保守基因NP基因作为检测靶目标,应用Clustal W软件进行序列同源性比对分析,筛选出季节性流感病毒H1N1特异性的保守序列作为引物候选区域,然后应用Primer Express及PrimerPremier 5.0软件包对候选引物进行进一步配对及筛选,得到最优特异性检测引物。同时,由病毒全长cDNA扩增出NP基因,琼脂糖凝胶电泳检测NP基因的扩增情况并对目的条带进行切胶回收及纯化,对回收后的NP全长基因进行核酸浓度测定,并换算成拷贝数,作为定量标准品。结果应用ABI公司的Power SYBR Green PCR MasterMix及StepOne实时荧光定量PCR仪,该检测系统灵敏度可达102 copies/μL,不同梯度标准品间线性关系（R2）达0.999,斜率为-0.3433,扩增效率为95.572%,所有标准品均在83.2℃出现尖且窄的特异性熔解峰。结论利用该检测系统可以快速定量检测季节性流感病毒H1N1,灵敏度高,可用作基础及临床实验室对季节性流感病毒H1N1感染的辅助诊断方法和临床效果的监测手段,对实验操作者要求相对较低,具有实际的应用价值。     

荧光定量RT-PCR检测甲型H1N1病毒核酸的临床意义

目的观察荧光定量RT-PCR技术在检测甲型H1N1病毒核酸的临床意义。方法对135例经确诊为甲型H1N1的感染患者的咽式子采用荧光定量PCR技术检测H1N1病毒核酸,同时对40例健康体检者的咽式子做为对照组一同进行甲型H1N1病毒核酸检测。结果 135例确诊为甲型H1N1的患者经荧光定量PCR检测阳性129例,符合率为96.99%。40例健康体检者结果全阴性。结论荧光定量PCR检测甲型H1N1病毒核酸具有快速、特异性高等特点,在采用此方法诊断甲型H1N1时,阳性即可确诊,阴性者要结合临床。     

ELISA法检测H3N2亚型流感病毒Vero细胞适应株

目的:流感病毒Vero细胞适应株A/Yunnan/1/2005va(H3N2)是一株以Vero细胞为培养基质能高产的病毒株,可用于制备以Vero细胞为基质的流感病毒裂解灭活疫苗;通过在低温下连续传代培养,可选育出流感病毒Vero细胞冷适应株,用于制备Vero细胞流感病毒减毒活疫苗为了便于对Vero细胞冷适应株的进一步研究,建立一个检测该病毒株的ELISA方法.方法:以流感病毒Vero细胞适应株A/Yunnan/1/2005Va (H3N2)的纯化抗原为免疫原制备羊抗A/Yunnan/1/2005Va (H3N2)和鸡抗A/Yunnan/1/2005Va (H3N2)的抗血清.将抗血清先后经硫酸铵沉淀法和Protein G亲和层析柱纯化后,以纯化的羊抗A/Yunnan/1/2005Va(H3N2) IgG为包被抗体,鸡抗A/Yunnan/1/2005Va(H3N2) IgG为第二抗体,测定包被抗体、第二抗体和酶标抗体最佳工作浓度,建立双抗体夹心ELISA检测方法.结果:羊抗A/Yunnan/1/2005Va (H3N2) IgG的最佳工作浓度为5μg/mL,鸡抗A/Yunnan/1/2005Va(H3N2) IgG的最适浓度为10 μg/mL,酶标抗体最佳稀释倍数为1∶4000.对已知的阳性样品,经双抗体夹心ELISA法测定的病毒滴度比血凝方法测定病毒滴度灵敏度高.结论:通过测定包被抗体、第二抗体和酶标抗体最佳工作浓度,建立了双抗体夹心ELISA检测流感病毒Vero细胞适应株病毒含量的方法.该方法操作简单、方便快速、敏感性高,可应用于Vero细胞冷适应株选育时对流感病毒Vero细胞适应株A/Yunnan/1/2005va(H3N2)的检测,对于研制Vero细胞流感减毒活疫苗有重要意义.     

一例混合感染中H3N2和H7N9流感病毒的分子遗传特性

【目的】揭示一例混合感染中H3N2和N7N9流感病毒的分子遗传特性。【方法】通过荧光定量PCR法对标本进行流感病毒分型检测。通过二代测序技术对病毒分离物进行全基因组测序分析。【结果】2013年4月在南京市检测到一例人季节性H3N2流感病毒和禽流感H7N9病毒混合感染,混合病毒分别命名为A/Nanjing/M1/2013 (H3N2) (M1-H3N2)和A/Nanjing/M2/2013 (H7N9) (M2-H7N9)。分离株M2-H7N9 HA蛋白的Q226L位点和PB2蛋白E627K位点发生突变,增强了病毒对人体的感染能力。【结论】报道了一起人混合感染H3N2和N7N9流感病毒病例,提示人可能成为流感病毒基因“混合器”,应高度关注H7N9病毒与人季节性流感病毒的基因重配现象。     

1996-2004年中国福建省甲3亚型流感病毒（H3N2）的分子进化

对1996～2004年甲3亚型流感病毒的HA1基因在中国南方福建省的变异特点与流行特征进行研究．对25株（其中11株基因序列来自GenBank）甲3亚型流感病毒HA1基因进行种系发生学分析．研究表明在约8个流感流行季节中,HA1基因在不断进行着点突变,期间可能发生了4次抗原性漂移．氨基酸突变的位点主要位于HA1分子抗原决定簇A～E内及附近和某些受体结合位点．其中,抗原位点B,A和受体结合位点226位的突变对于抗原漂移至关重要,但随着流感病毒的进化,抗原位点和与抗原漂移有关的关键密码子也会发生改变．因此,在亚洲南部监测甲3亚型流感病毒HA1基因阳性选择密码子的突变是很重要的．     

流感病毒H3N2血凝素基因和神经氨酸酶基因在大肠杆菌中的表达

克隆、表达和鉴定流感病毒H3N2 HA,NA基因序列,为制备抗体和基因工程疫苗打下基础。在成功克隆流感病毒H3N2全长HA、NA基因并测序的基础上,将部分基因序列克隆到表达载体pET32a(+)上,全基因序列克隆到表达载体pGEX4T-1上,构建了重组表达质粒pET32a(+)/HA(截短),pET32a(+)/NA(截短),pGEX4T-1/HA,转化大肠杆菌BL21/Rosetta,IPTG诱导表达,利用Ni2+亲和层析柱和GSTrap 4B亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western blotting和ELISA方法检测其抗原性。结果显示,重组蛋白在大肠杆菌中可以高效表达,SDS-PAGE显示其相对分子质量与预计大小一致。ELISA和Western blotting试验证实,重组蛋白具有良好的抗原性。成功克隆和表达了流感病毒H3N2 HA、NA基因序列,可为流感病毒H3N2诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究提供参考。     

表达量高、血凝活性好的H3N2流感病毒血凝素（HA）蛋白疫苗的筛选研究

摘要 目的：筛选表达量高、血凝活性好的H3N2流感病毒血凝素（HA）重组蛋白。方法：以A/MINNESOTA/41/2019（H3N2）毒株的HA为基础,将HA胞外区N端融合GP67信号肽,C端融合三聚化基序,分别构建HA胞外区全长及近膜区截短2个氨基酸的HA重组杆状病毒,并构建相应的不含三聚化基序的HA重组杆状病毒;经昆虫细胞表达,Western blot鉴定,亲和层析纯化后分析重组蛋白的血凝效价及稳定性。结果：四种HA重组蛋白均获得有效表达,其中HA胞外区全长融合三聚化基序的重组蛋白（HA-T）表达水平最高,经Strep tag亲和层析获得高度纯化,产量高达30 mg/L,Ethylene glycolbis交联分析显示为稳定的HA三聚体形式,血凝活性分析显示HA-T的活性最高,血凝效价为29,动态光散射显示HA-T在4℃放置3个月性质稳定。结论：HA-T表达量高、稳定性好、血凝活性高且易于纯化,研究结果为流感重组蛋白疫苗的研发策略提供了参考。     

不同荧光定量PCR分析方法检测大鼠脑缺血再灌注损伤中Caspase-3基因的表达研究

目的:应用实时荧光PCR检测大鼠脑缺血/再灌注损伤组织中的Caspase-3基因表达变化,并比较了相对定量与绝对定量分析方法的技术优劣.方法:相对定量实验中,以β-actin基因作为内参,采用Delta-delta Ct法计算目的基因表达变化.而在绝对定量实验中,构建了含Caspase-3基因的重组质粒,以该重组质粒作...     

SYBR green实时荧光定量PCR检测微小RNA21的方法建立及在食管鳞癌中的应用

目的:建立SYBR green实时荧光定量PCR检测微小RNA miR-21的技术平台及应用。方法:设计微小RNA21和U6的的颈环结构反转录引物和PCR扩增引物,以U6为内参利用SYBR green实时荧光定量PCR法检测小鼠各器官中的微小RNA21的含量。提取16例食管鳞癌患者的肿瘤组织及其近旁组织中的总RNA,检测其微小RNA21表达水平。结果:SYBR green实时荧光定量PCR检测U6和微小RNA21含量的熔解曲线单一,PCR产物特异。在Balb/c小鼠的4种器官中,肝脏、脾脏、肾脏分别为脑组织的8.71、5.38、3.47倍。16对食管鳞癌患者的样本中,14例微小RNA21的拷贝数高于其近旁组织约10.58倍(p0.01)。结论:此研究成功建立了SYBR green荧光定量PCR法检测小鼠和人微小RNA-21含量的技术平台,为进一步阐述miR-21在食管鳞癌的发生中的作用提供了新方向。     

2010?2011年全球季节性H3N2流感病毒表面蛋白基因的分子遗传特性分析

[目的]分析2010年1月至2011年9月间全球季节性H3N2流感病毒血凝素(Hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)基因的演变和分子特征,为流感病毒的防制提供分子信息依据.[方法]搜集期间季节性H3N2流感病毒HA和NA基因的完整核苷酸序列,分别绘制两基因编码序列的进化树;推导出相应的氨基酸序列,统计不同毒株间氨基酸位点差异并分析重要功能位点的变化.[结果]在136条完整的片段4和131条片段6中,2条HA和l条NA序列源自猪群流感病毒,剩余的序列根据进化特征可被分为两群.相比疫苗毒株,发生在HA和NA蛋白抗原位点的平均差异数分别为5.33和2.01个,3个毒株分别在HA宿主受体结合位点和二硫键及NA耐药位点出现突变,多数毒株的糖基化位点增多.江苏毒株和广东毒株分别属于群l和群2,且两省毒株间在HA蛋白抗原位点的差异数从7到13个不等.[结论]2010年1月至2011年9月间的全球季节性H3N2病毒主要呈现两种基因进化特征.因抗原性差异对疫苗开发具有指导作用,而多数毒株的抗原性检测信息仍然未知,但从抗原位点和糖基化位点的变异情况来看,多数毒株的抗原性可能已经变化,为判断是否形成新的流行株,应开展进一步的抗原性检测;并且各地区卫生行政部门应根据耐药位点的变化,制定相应的抗病毒治疗措施.     

奥司他韦对我国A(H3N2)亚型流感病毒红细胞凝集和抑制试验的影响

比较加入神经氨酸酶抑制剂奥司他韦(Oseltamivir)对我国A(H3N2)亚型流感病毒红细胞凝集(Hemagglutination,HA)和凝集抑制(Hemagglutinin inhibition,HI)试验结果的影响,以期获得病毒更真实的HA和抗原性变异分析结果。选择2014年10月-2015年5月在中国大陆分离的395株A(H3N2)亚型流感病毒,在HA及HI试验中加入神经氨酸酶抑制剂Oseltamivir,对实验结果进行比较分析,根据HA试验,挑选其中部分毒株进行基因组测序,比较NA氨基酸位点变异情况。在HA试验中加入神经氨酸酶抑制剂Oseltamivir后,44.8%的毒株HA滴度未改变;43.8%的毒株HA滴度下降,仅有11.4%的毒株HA滴度升高。加入Oseltamivir后,与A/TX/50/2012鸡胚株抗原性类似的毒株的比例高于未加入Oseltamivir时,与A/SZ/9715293/13细胞株抗原性类似的毒株的比例低于未加入Oseltamivir时类似株的比例,统计学分析有显著性差异。以A/TX/50/2012细胞分离株和A/SZ/9715293/133鸡胚分离株作为参考病毒,Oseltamivir对实验结果的影响无显著性差异。挑选19株A(H3N2)亚型流感毒株进行基因组测序,进行NA蛋白氨基酸位点分析,与A/TX/50/2012鸡胚分离株相比加入20nM Oseltamivir后,滴度降低超过4倍的5株毒株,没有共同氨基酸位点变异,但A/山东莱城/119/2015流感毒株有D151G氨基酸位点突变;A/吉林铁西/1194/2015流感毒株有V412I和T434A氨基酸位点变异。加入20nM Oseltamivir后,滴度降低为2~4倍的毒株,具有I26T、G93S、V149I、N234D、T267K、S416G等位点突变。在对我国近年流行的A(H3N2)亚型流感病毒进行血凝滴度和抗原性分析中,加入Oseltamivir可获得更为真实的HA和HI结果,分析病毒的变异情况,评价疫苗的匹配性。