树鼩在医学实验研究中的新进展

树鼩的许多生物学特性近似于人类,人们利用树鼩成功建立了多种人类病毒感染的动物模型,并在肿瘤、内分泌、神经、视觉等方面有相当广泛和深入的应用和研究。本文概述了树鼩在医学实验研究中的新进展。     

树鼩实验感染基孔肯雅病毒的研究

选用3株基孔肯雅病毒人工感染成年树鼩,进行了病毒血症、抗体动态变化、内脏组织病理改变和病毒在宿主体内定位的研究。结果表明,感染树鼩能产生2～6天的病毒血症。血凝抑制(Hi)抗体第6天产生,第30～50天达高峰:中和(NT)抗体在第10天产生,第30～40天达高峰,二者相关性非常显著(P<0.01)。补体结合(CF)抗体第14天产生,第40～50天为高峰,以后逐渐下降。第8～12天能在其脑、肺、肝、脾和肾等组织查到病毒,经病理检查这些内脏组织呈炎性改变和出血倾向,表明该病毒能侵袭树鼩各主要脏器。试验认为树鼩对基孔肯雅病毒敏感。     

实验动物树鼩和人类疾病的树鼩模型研究概述

动物模型在生物医学领域(如回答人体各种重大生物学问题、解析人类疾病机理和新药研发等方面)已经做出了不可替代的巨大贡献。转化医学存在的问题使得树鼩(Tupaia belangeri chinensis)实验动物重新得到重视;人类疾病的树鼩模型也再次受到越来越多的关注。该文综述了国内外特别是近年来我国树鼩研究进展,包括树鼩基础生物学及动物模型方面取得的成绩,并分析了该领域目前存在的困难和问题,探讨了未来的一些研究方向。     

树鼩资源的开发利用与标准化研究——我国实验动物资源建设发展战略探讨

树鼩（Tupaia belangeri）作为人类疾病动物模型,被应用于人类医学实验研究的多个领域,如各种类型的病毒性肝炎模型,流感病毒、登革热病毒、轮状病毒、疱疹病毒模型,糖尿病、胆结石、癌症病模型。但是,目前我国用于实验研究的树鼩几乎全都来自野外,对它们的微生物学、寄生虫学、遗传学、环境学等质量标准没有进行控制,它们本身携带的许多病原体会对实验结果的准确性造成影响,这既不符合国家对实验动物许可证管理的要求,也不利于我国实验动物科技工作与国际接轨的发展要求。因此,应该同步开展树鼩资源的开发利用和标准研究,使之纳入实验动物许可证的有效监控和管理,改变目前使用在前、质量控制标准研究在后的被动局面。     

树鼩的生物化学参考值

树鼩科分类地位的争论和我国树鼩的分类至今尚无定论(Lyon,1913;Osgood,1932;Allen,1938;Ellerman等,1951;Hill,1953;Napier等,1967;Walker,1968;Corbet等,1980;Luckett,1980;Honacki等,1982;Ronald等,1983)。自Sim-pson(1945)和Le Gros Clark(1959)将树鼩归入灵长目,特别是本世纪六十年代以来,对树鼩的血液学、血清学和免疫学研究报道较多。     

人单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-Ⅱ)实验感染树鼩的研究

本文探查了树鼩对人单纯疱疹病毒Ⅱ型（HSV-Ⅱ）的敏感性。其结果报道如下: （一）动物感染HSV-Ⅱ后的死亡率:树鼩经HSV—Ⅱ感染后第3天开始死亡,5一7天死亡数达到高峰。腹腔感染组第7天死亡率达80.2％,第14天为100％;阴道感染的动物死亡率为76.8％,见表1。以兔肾细胞悬液经阴道填充和腹腔注射的对照动物无1例死亡。     

树鼩血红蛋白正常值测定

本文报道了30只产于我国云南的成年树鼩(Tupaia belangeri chinensis)的血红蛋白正常值。结果如下:抗碱血红蛋白均数(％)为0.90±0.09,HbF细胞均数(％)0.10±0.05,Heinz小体生成率均数(％)为12.35±0.81,热变性血红蛋白均数(％)为2.48±0.35,血红蛋白溶解度均数(％) 为83.58±1.12。异丙醇试验为阴性,未见H包涵体。上述结果与人的血红蛋白正常值进行了分析比较。血红蛋白的醋酸纤维素薄膜电泳显示了树鼩Hb的五个区带,树鼩Hb的电泳迁移率慢于人的Hb。     

树鼩微卫星DNA的多态性研究

目的探索并建立一种检测树鼩群体遗传多样性的方法。方法利用聚合酶链反应（PCR）扩增技术对30只树鼩个体的11个微卫星位点进行了遗传检测。结果所选的11个微卫星DNA位点中,有9个具有高度多态性,2个微卫星DNA位点多态性较差。结论所研究的树鼩微卫星位点中,有9个符合遗传标记特点,可用于检测树鼩群体的遗传多样性。     

实验室内树鼩爆发间质性肺炎的报告

在动物室内饲养的树鼩于2003年4月至8月爆发了一次间质性肺炎。疫情特征为患病动物呼吸窘迫,发病急,死亡率高,主要累及新生或幼年动物,红霉素类抗生素有显著的防治效果。病理检查见光镜下肺组织呈间质性肺炎改变,肺泡腔内无渗出。推测此次疫情的病原为肺炎支原体。     

中国树鼩的分类研究

本文对中国南部和西南部树鼩的分类问题进行了整理。讨论了中南半岛树鼩的种级分类,提出了中南半岛北部地区的Tupaia belangeri及其近似亚种应恢复其种级分类地位;T.belangeri yunalis,T.belangeri tonquinia和T.belangeri modesta应是3个有效亚种;记述了分布于中国南部和西南部的树鼩为6个亚种,其中有两个新亚种T.belangeri gongshanensis subsp.nov.(云南高黎贡山地区)T.belangeri yaoshanensis subsp.nov.(广西瑶山)。     

树鼩在医学生物学中的应用

目的树鼩是一种新型实验动物,由于它的许多分子与细胞结构近似于人类,已成功建立了多种人类病毒感染的动物模型,并在神经生物学、生殖生物学、免疫学和社会心理学等方面有相当广泛和深入的应用和研究。     

人工饲养树鼩血液学及生化指标正常值测定及分析

目的建立人工饲养健康树鼩血液学和血液生化指标的正常值参考范围,并探讨与不同物种的血液学和血液生化值的差异及相互关系。方法应用全自动血细胞仪和生化分析仪测定140只健康成年树鼩的血液学及血液生化指标。结果雌性与雄性比较,LYM％、PLT、RDW％、GLU、CREA的差异具有显著性（JP〈0．05）,11P、CHOL、TG的差异具有极显著性（P〈0．01）,其他指标的差异不具显著性,部分指标与恒河猴、大鼠及人的相应指标存在一定的差异。结论本文建立了健康树鼩的血液学及生化指标的正常值参考范围,可为应用该动物进行科学研究时提供参考。     

树载脂蛋白CIcDNA序列及其组织表达

分离提取树（ｔｒｅｅｓｈｒｅｗ,ＴＳ）肝组织ｍＲＮＡ,以此为模板,反转录构建了ＴＳ肝组织ｃＤＮＡ文库。利用制备的兔抗ＴＳ载脂蛋白ＣＩ多抗血清为探针筛选该文库,获得两个阳性克隆。测序及序列分析表明：两个克隆均为ＴＳａｐｏＣＩｃＤＮＡ基因。大的克隆由３８０个核苷酸构成,包括２１ｂｐ、９５ｂｐ组成的５′和３′非编码区,２６４ｂｐ组成的一个完整开放阅读框架,编码８８个氨基酸的ａｐｏＣＩ前体,含２６个氨基酸构成的信号肽和６２肽的成熟蛋白。其成熟肽长度与大鼠、小鼠和狗的相应结构一致,但较人和狒狒ａｐｏＣＩ的成熟肽多５个氨基酸。并对其功能域进行了初步预测。ＲＮＡ印迹显示ＴＳａｐｏＣＩｍＲＮＡ不仅主要在肝组织表达;而且不同于人和其他哺乳类动物,亦可少量在小肠表达。上述结果为进一步研究ＴＳａｐｏＣＩ基因组结构、功能和体外表达奠定了基础。     

树鼩CXCR4 cDNA的克隆和序列分析

目的　获得树CXCR4的cDNA序列 ,探讨其是否可以支持HIV_1病毒和细胞的结合。方法　设计相应的引物 ,用RT_PCR ,基因克隆 ,DNA序列分析技术。结果　获得了全长为 10 59bp树CXCR4(tsCXCR4)基因的cDNA。发现其核苷酸序列与人的CXCR4(hCXCR4)基因的cDNA有 92 8%的相似性 ,由此推导出的氨基酸序列有 96 9%相似性。与hCXCR4功能相关的关键位点完全相同 ,tsCXCR4的N端第 7和 12位点为酪氨酸 ,第 14、15和3 2位点为谷氨酸 ,胞外环第 183 ,188为精氨酸 ,第 193、2 62位点以及跨膜区 97位点为天冬氨酸。结论　树的CX CR4很可能会作为HIV_1的辅助受体     

人类巨细胞病毒感染树鼩原代真皮成纤维细胞诱导凋亡特性

人类巨细胞病毒(HCMV)流行广泛,危害严重,由于其严格的物种特异性限制,动物模型缺乏,严重阻碍了对其致病机制的研究及药物、疫苗的研发。本研究对树鼩(Tupaia belangeri)来源的原代真皮成纤维细胞感染HCMV后的细胞死亡现象进行了初步探索。首先,观察了感染后细胞病变和死亡情况,使用细胞增殖检测试剂盒测定了细胞活力;其次,对凋亡相关因子bax、bcl-2和未折叠蛋白反应相关因子chop、atf4、xbp1s转录水平的差异进行了逆转录荧光定量PCR检测与分析;然后利用免疫蛋白印迹技术检测并分析了主要病毒蛋白IE1、UL44和凋亡相关因子Bax、Caspase-9、Caspase-3、PARP的表达水平;最后结合膜联蛋白-V和碘化丙啶双染色法从生物化学角度对细胞死亡类型进行了鉴定。结果显示,细胞病变和死亡情况随着感染进程逐渐严重,细胞活力下降明显(P 0.001)。感染上调bax、bcl-2、chop、atf4、xbp1s转录水平并且使bax与bcl-2转录水平呈明显拮抗趋势;感染同时上调Bax、Caspase-9、Caspase-3、PARP蛋白表达和逐级剪切激活;病毒蛋白IE1、UL44可以上调至一个完整的病毒复制周期结束。综上,本研究指出HCMV跨物种感染树鼩原代真皮成纤维细胞可诱导细胞凋亡,并且与内质网和线粒体密切相关。     

树[鼠句]正常肠道细菌的培养分离鉴定及其药敏试验研究

目的了解人工饲养树[鼠句]肠道菌群感染情况及其各种细菌对药物的敏感性。方法通过肠道细菌采样、培养、分离和菌落生长特性观察,并经革兰氏染色、氧化酶试验、触酶试验、生化编码鉴定管试验和9种药敏试验分析,初步鉴定了107例人工饲养树[鼠句]肠道感染细菌的种类和这些细菌对药物的敏感程度。结果本次细菌培养共从树[鼠句]肠道中培养分离出5株细菌,其中革兰氏阳性菌2株,革兰氏阴性菌3株,以大肠杆菌和葡萄球菌最为多见。同时确定了菌株的药敏情况为：（1）大肠杆菌对头孢类药头孢哌酮最为敏感,对药物磺胺甲嚼唑／甲氧苄定、氧氟沙星、左氧氟沙星、呋喃妥因、诺氟沙星、氨苄西林高敏;（2）沙门氏菌对阿米卡星最为敏感,对药物头孢哌酮青霉素G高敏;（3）链球菌对试验药物氨苄西林、头孢哌酮、呋喃妥因显示为中敏;（4）葡萄球菌对头孢类药头孢哌酮、磺胺类磺胺甲晤唑／甲氧苄定、沙星类诺氟沙星、左氧氟沙星、氧氟沙星、呋喃妥因和氨苄西林最为敏感,对其它药物均为中敏;（5）假单胞菌对药物左氧氟沙星最为敏感,对大多数药物都显示高敏。结论大肠杆菌和葡萄球菌可能是树鼢肠道中正常寄生的主要菌群,同时其它菌群也有寄生。用药敏实验筛选出的药物可为临床用药和动物的生物净化提供指导依据。     

树鼩原代小胶质细胞的分离培养、纯化与鉴定

本文旨在建立树鼩(Tupaia belangeri)小胶质细胞原代培养及纯化的方法,为利用新型实验动物树鼩进行相关研究工作提供实验材料。将新生树鼩大脑皮质机械分离,皮质组织块用胰蛋白酶消化后制成细胞悬液;培养9～10 d后,分别采用直立手拍法、温和胰酶消化法以及恒温振荡法分离纯化树鼩小胶质细胞,通过差速贴壁进一步纯化。荧光显微镜下,利用小胶质细胞的特异性标记物CD11b抗体进行鉴定。结果显示,小胶质细胞分离培养第3天时呈静息状态,表现为梭形、杆状、分支状等不规则形态。细胞免疫荧光CD11b呈阳性。不同纯化方法细胞免疫荧光并计数显示,直立手拍法所获得的细胞产量明显高于恒温振荡法(P 0.05),细胞阳性率( 96%)明显高于温和胰酶消化法( 90%,P 0.05)。直立手拍法可获得产量及纯度高的树鼩原代小胶质细胞。     

树鼩细胞周期蛋白T1 cDNA的克隆和序列分析

树鼩细胞不能感染HIV-1,但支持HIV-1进入靶细胞后的转录,可能是因为树鼩细胞周期蛋白T1(tsCycT1)能结合HIV-1的Tat蛋白。通过设计引物,用RT—PCR技术,获得全长为2175bp tsCycT1基因的cDNA。其核苷酸序列与人的CycT1(hCycT1)基因的cDNA有92．6％的相似性;由此推导出的氨基酸序列有94．1％相似性。其中,hCycT1和tsCycT1氨基端的1—272个氨基酸的相似性高达98．8％,氨基酸第261位点为半胱氨酸。这些结果提示,tsCycT1会和HIV-1的Tat结合,形成高亲和的、锌依赖的复合物,支持HIV-1转录。