炭疽毒素受体与人IgG1的Fc段融合蛋白ATR_Fc在CHO细胞中的表达

ATR_Fc是人炭疽毒素受体(ATR)的胞外区与人免疫球蛋白IgG1的铰链区、CH2区和CH3区组成的融合蛋白。表达该蛋白是为了获得结合PA的抗体样分子,通过阻断PA与细胞受体的结合,而阻止炭疽致死毒素和水肿因子进入细胞内,可作为预防和治疗炭疽感染的生物制品。将编码炭疽毒素受体N端1_227氨基酸的基因和编码Fc段的基因连接,插入到pcDNA3.1的HindⅢ和NotⅠ位点得到表达ATR_Fc融合蛋白的真核表达载体pcDNA3.1ATR_Fc,并用脂质体方法将该载体转染至CHO_K1细胞中,用G418筛选并获得ATR_Fc表达水平为10～15μg(106cells·d)的基因工程CHO细胞系ATR_Fc_1D5。采用蛋白A纯化重组蛋白,并用ELISA法鉴定ATR_Fc与PA的亲和性,表明ATR_Fc可与PA特异性结合。     

炭疽毒素及其细胞受体的研究进展

炭疽毒素由 3种蛋白组成 :保护性抗原 (protectiveantigen ,PA)、致死因子 (lethalfactor,LF)和水肿因子 (edemafactor ,EF) .综述炭疽毒素研究的最新进展 .主要介绍炭疽毒素的关键致病因子———LF的结构与功能 ,炭疽毒素膜转运成分PA的结构及其受体 (anthraxtoxinreceptor ,ATR)和其cDNA克隆的结构 ,并讨论了在炭疽的治疗、预防和毒素在肿瘤治疗中的可能应用 .     

炭疽毒素受体与人IgG1的Fc段融合蛋白ATR_Fc在CHO细胞中的表达

ATR-Fc是人炭疽毒素受体（ATR）的胞外区与人免疫球蛋白IgG1的铰链区、CH2区和CH3区组成的融合蛋白。表达该蛋白是为了获得结合PA的抗体样分子,通过阻断PA与细胞受体的结合,而阻止炭疽致死毒素和水肿因子进入细胞内,可作为预防和治疗炭疽感染的生物制品。将编码炭疽毒素受体N端1-227氨基酸的基因和编码Fc段的基因连接,插入到pcDNA3-1的HindⅢ和NotⅠ位点得到表达ATR-Fc融合蛋白的真核表达载体pcDNA31/ATR9Fc,并用脂质体方法将该载体转染至CHO-K1细胞中,用G418筛选并获得ATR-Fc表达水平为10～15μg/(106cells·d)的基因工程CHO细胞系ATR-Fc-1D5。采用蛋白A纯化重组蛋白,并用ELISA法鉴定ATR-Fc与PA的亲和性,表明ATR-Fc可与PA特异性结合。     

人用炭疽菌苗的研究进展

<正>炭疽是一种人兽共患的急性传染病,羊、牛、马等家畜易患本病,人由于接触炭疽病畜或屠宰、剥食而受染。炭疽的病原体是炭疽杆菌,是一种需氧芽胞杆菌。炭疽菌的毒力除决定于染色体基因外,还与两个编码质粒致病因子有关:一个是荚膜质粒(编码pxo2),主要是聚—D—谷氨酸,在体内能抑制细胞的吞噬作用,在体外能阻断菌体胞壁上的噬菌体受体,故常称为侵袭因子,有助于病菌在体内繁殖扩散和建立感染;另一个是炭疽毒素质粒(编码pxo1),由致死因子(LF)、水肿因子(EF)和保护性抗原(PA)三种成分组成。三种成分单独注射动物未证明有毒素活性,但若将LF加PA静脉注射可致死小白鼠、大白鼠和豚鼠。EF加PA皮内注射可引起豚鼠和家兔皮肤水肿。三种毒素成分的分子量在80～90KDa之间,可能PA结合     

炭疽杆菌的致病因子与炭疽的防治

炭疽为一种人、兽共患急性传染病,部分国家将炭疽杆菌作为生物威胁因子进行研究和生产。该菌毒性与质粒PXOl、PXO2有关,PXOl产物包括水肿因子、保护性抗原和致死因子。PXO2是另一编码致病因子,产物荚膜抑制细胞的吞噬,有助病菌繁殖、扩散和建立感染。抗生素与抗炭疽血清联合应用,突变保护性抗原、水肿因子、致死因子联合注射,Al(OH)3佐剂PA疫苗,减毒口服菌苗,PA基因重组活菌苗均可抵抗炭疽杆菌致死性攻击。     

炭疽杆菌毒素的可能的解毒药--多价抑制剂

ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 2 0 0 1年 19卷 10期 95 8～ 96 1页报道 :炭疽毒素是由炭疽杆菌 (Ｂａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓ)产生的。在临床上 ,炭疽病是罕见的 ,但目前由于在生物战争和恐怖行为中有可能使用炭疽杆菌 ,因而引起科学家对炭疽病的日益增加的关注。如所周知 ,炭疽杆菌毒素是由保护抗原 (ＰＡ) ,即单一的受体结合部分 ,以及两种酶促部分 ,即水肿因子(ＥＦ)和致死因子 (ＬＦ) ,共同组成的。这 3种蛋白作为无毒的单体从炭疽杆菌体内释出后 ,就扩散到哺乳动物细胞表面的受体 ,并组配成为有毒的可结合于宿主细…     

重组炭疽水肿因子的表达与生物活性分析

炭疽毒素包括3种蛋白因子,即保护性抗原（PA）、致死因子（LF）和水肿因子（EF）。EF是钙调蛋白依耐的腺苷酸环化酶,可使细胞cAMP浓度升高,导致宿主防御能力下降。为深入研究炭疽毒素的作用机理,构建了原核表达质粒,在大肠杆菌中表达出重组EF（rEF）。经鉴定,rEF以可溶形式表达于细菌胞质中。经过金属螯和层析、阳离子交换层析和凝胶层析,每升诱导培养物可获得约5mg 重组蛋白。用重组蛋白免疫家兔获得了兔多抗,能够在细胞试验中中和rEF,体外细胞试验显示rEF具有很好的生物活性,在J774A.1和CHO细胞试验中,能与LF共同竞争和PA的结合位点,相互抑制。上述工作为深入研究炭疽毒素的作用机理,开发针对EF的毒素抑制剂打下基础     

炭疽毒素受体ATRcDNA的合成和克隆及ATR-Fc融合蛋白的真核表达载体的构建

可溶性炭疽毒素受体(sATR)可以特异性结合炭疽毒素保护抗原(PA),为获得用于中和炭疽毒素以防治炭疽感染的候选抗毒素药物,构建了表达ATRFc抗体样分子融合蛋白的真核表达载体。将全长为681bp的编码炭疽毒素受体N端1～227氨基酸的基因分成长约50～60碱基的18个寡核苷酸片段,相邻片段重叠部分为20～22个碱基,利用重叠延伸PCR和引物PCR法,将合成的片段组装与扩增,得到了含有ATR_1～227的全部编码区和HindIII、BamHI位点在内的DNA片段。回收的基因片段经BamHI/HindIII双酶切连接到pUC19质粒中,挑选阳性克隆进行酶切鉴定和双向序列测定,获得了全序列正确的克隆。将ATR基因与Fc基因连接后插入pcDNA3.1载体多克隆位点HindIII和NotI之间,得到表达ATRFc融合蛋白的真核表达载体pcDNA3.1/ATRFc,为利用CHO哺乳动物细胞表达ATRFc并研究其生物学性质奠定了基础。     

PA domain4-Fc融合蛋白抗血清可以保护小鼠巨噬细胞免受炭疽毒素损害

目的:探讨炭疽杆菌保护性抗原PA(protective antigen)domain4能否作为炭疽疫苗和炭疽感染时紧急预防用药.方法:构建含有PA domain4和人IgG Fc片段的表达载体,通过免疫大耳白兔获得针对该融合蛋白的免疫血清,通过小鼠巨噬细胞保护试验验证PA domain4-Fc是否具有疫苗和紧急预防用功能.结果:获得了表达PA domain4-Fc融合蛋白的CHO细胞株和针对PA domain4-Fc的兔抗血清,细胞保护试验证实PA domain4-Fc抗血清能够保护小鼠巨噬细胞免受炭疽毒素的攻击,但PA domain4-Fc蛋白本身并不能直接拮抗炭疽毒素对细胞的损害.结论:PA domain4-Fc抗血清可以保护小鼠巨噬细胞免受炭疽毒素损害,表明PA domain4-Fe具有作为炭疽疫苗的可能,但PA domain4-Fc蛋白不能直接竞争性拮抗炭疽毒素损害细胞.     

中和炭疽毒素的化合物

人吸入炭疽菌Ｂａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓ的孢子时 ,炭疽菌便释放 3种蛋白质 ,这 3种蛋白质结合起来形成炭疽毒素 .这 3种蛋白质的组合使血压骤降 ,引起出血 ,并导致昏迷与死亡 .其中 1个蛋白质称为保护性抗原(ＰＡ) ,它与细胞表面的 1个受体相结合 ,并由酶将它粘着在结合处 .ＰＡ与受体的粘着部分称为ＰＡ6 3,它为其他 2个炭疽毒素蛋白提供停靠于细胞的位置 .这 2个炭疽毒素称为致死因子和水肿因子 .炭疽毒素一旦装配好 ,致死因子便得以进入细胞 .在致死因子进入细胞的入口处 ,其割断蛋白质而引起一连串事件的起动 ,这导致产生炭疽…     

炭疽杆菌的特性和主要毒力因子

炭疽是由炭疽杆菌芽胞引起的疾病,炭疽杆菌的主要毒力因子在毒力质粒上编码pXO1和pXO2,pXO1184.5kbp大小,编码分泌外毒素的基因,此二个外毒素为二亚单位毒素,二个A蛋白,致死因子（LF,83kD)和水肿因子（EF,89kD);一个B蛋白,保护因子（PA,85kD);分别由pXO1上的独立基因,Lef,Cya和Pag编码;pXO2为95.3kbp大小的小质粒,携带三个基因,CapB,CapC和CapA,与聚-γ-D谷氨酸构成的荚膜合成有关。     

炭疽毒素受体结构和功能研究进展

肿瘤血管内皮标志物8(TEMS)和毛细血管形态发生蛋白2(CMG2)是已知的两个炭疽毒素受体,它们的主要功能是当炭疽杆菌侵染细胞时介导炭疽毒素进入宿主细胞.这两个受体都是涉及到细胞外基质动态平衡的I型跨膜蛋白,并且都因为它们在血管生成或血管内皮细胞中表达增强而被发现.有研究发现TEM8能够调节内皮细胞迁移和血管形成,而CMG2则在内皮细胞增殖过程中起重要作用.进一步的研究显示它们与整联蛋白同源性较高,但它们确切的生理功能和作用机制尚不明确.本文中,主要讨论这两种蛋白的结构和它们作为炭疽毒素受体介导炭疽毒素进入细胞的分子机制,然后我们简单探讨一下TEM8在靶向肿瘤血管内皮细胞的抗血管生成和抗肿瘤疗法方面的研究进展,最后我们展望了下一步炭疽毒素受体研究的热点-它们的配体及生理功能研究.     

利用转基因小鼠筛选全人源炭疽致死因子中和抗体

炭疽是由炭疽芽孢杆菌引起的严重威胁人类健康的传染病。炭疽毒素包括3种蛋白质成分:保护性抗原(PA)、致死因子(LF)和水肿因子(EF)。PA与LF形成致死毒素(LT),与EF形成水肿毒素(ET)。由于致死毒素(LT)在感染者损伤及死亡中发挥主要作用,因此在炭疽感染晚期单纯使用抗生素治疗难以发挥疗效,治疗性中和抗体成为目前最有效的炭疽治疗药物。目前国外获得的炭疽毒素抗体多为炭疽PA抗体,美国FDA已批准瑞西巴库(人源PA单抗)用于吸入性炭疽的治疗。一旦炭疽芽孢杆菌被人为改构或PA中和表位发生突变,针对PA单一表位的抗体将可能失效,因此针对LF的抗体将成为炭疽治疗的有效补充。目前国外已有的LF抗体多为鼠源抗体和嵌合抗体,而全人源抗体可以避免鼠源抗体免疫原性高等缺点。本研究首先用LF抗原免疫人抗体转基因小鼠,利用流式细胞仪从小鼠脾淋巴细胞中分选抗原特异的记忆B细胞,通过单细胞PCR方法快速获得两株具有结合活性的抗LF单抗1D7和2B9。瞬时转染Expi 293F细胞制备抗体,通过毒素中和实验(TNA)发现1D7和2B9在细胞模型中均显示较好的中和活性,并且与PA单抗联合使用时,表现出较好的协同作用。总之,本文利用转基因小鼠、流式分选技术和单细胞PCR技术的优势,快速筛选到全人源LF抗体,为快速筛选全人源单克隆抗体开辟了新的思路与方法。     

应用改构的炭疽毒素作为靶向肿瘤细胞的药物递送系统及其效果评价

目的:通过改造炭疽毒素保护性抗原Protective Antigen (PA)及致死因子Lethal Factor (LF),尝试建立更加广谱的新型炭疽毒素靶向给药系统并对其递送效率进行定量评价.方法:采用基因工程手段,分别构建了3种改构的天然炭疽毒素保护性抗原PA及炭疽毒素的LF N端融合海肾荧光素酶(Luciferase)的LFn-linker-Luc的大肠杆菌重组表达体系.利用CCK-8法评价改构PA和LF共同作用肿瘤细胞后的细胞存活率;利用改构PA和LFn-linker-Luc与肿瘤细胞共孵育,通过测定细胞内荧光素酶活性,评价改构PA靶向肿瘤细胞的效果.结果:体外酶解实验证明构建的改构PA蛋白能够被正确地酶解成目的大小的片段;改构PA和LF共同作用肿瘤细胞能够显著降低细胞存活率;利用LFn-linker-Luc能够评价改构PA的靶向效率,PA蛋白的改构方式与其递送效率相关.结论:设计并改构的炭疽毒素药物递送系统,能够实现特异性靶向肿瘤细胞的效果,并具有更广谱的作用效果,为研制新型广谱抗肿瘤药物提供了新的思路和方法.     

LFn融合蛋白表达载体的构建及转导融合蛋白进入细胞的研究

LFn包括炭疽致死因子(LF)的1—254位氨基酸残基,它可以在PA存在时将融合在其C端的外源蛋白/多肽带入细胞.将LFn的编码序列分别导入pas22和pET21a表达载体中,构建了LFn融合蛋白表达载体pas22 LFn和pET21 ＬＦn.将绿色荧光蛋白(EGFP)基因插入LFn融合蛋白表达载体中,并在其C端融合6个His序列,表达及纯化了LFn EGFP融合蛋白.细胞实验表明,表达的LFn EGFP在PA存在时可以有效地进入细胞.这为今后研究PA和LFn在理论和应用研究中作为“运用工具”的使用打下了基础     

CMG2-Fc 融合蛋白突变体筛选及中和炭疽毒素活性分析

目的:筛选能有效中和炭疽毒素和抵抗炭疽毒素损伤细胞的CMG2-Fc(炭疽毒素受体II-人免疫球蛋白Fc段融合蛋白)突变体。方法:运用FoldX等计算软件分析CMG2与PA晶体学结构,设计能提高CMG2-PA亲和力的突变体分子,并与人IgG1Fc片段构成融合基因,转染CHO-S细胞并通过亲和层析获得CMG2-Fc突变体蛋白,通过亲和力检测和细胞保护实验分析各突变体中和炭疽毒素能力。结果:筛选并表达了8个CMG2-Fc突变体分子,亲和力实验显示其中E117Q突变可明显提高CMG2-Fc与PA的亲和力(KD=1.35×10-11 mol/L),细胞保护实验提示E117Q突变能有效提高CMG2-Fc中和炭疽毒素能力(CMG2-Fc(E117Q)的IC50为15 ng/μL,而wt CMG2-Fc的IC50为50ng/μL)。结论:CMG2-Fc(E117Q)突变体分子可作为拮抗炭疽毒素损伤的炭疽治疗药物分子,进行进一步研究。     

利用炭疽杆菌毒素的细胞受体克隆防毒

Ｎａｔｕｒｅ 2 0 0 1年 4 14卷 6 86 0期 2 2 5～ 2 2 9页报道 :炭疽杆菌 (Ｂａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓ)分泌的三联毒素可侵犯宿主的免疫系统 ,使宿主在全身感染后死亡。在这三种毒素中 ,有两种毒素可通过酶促作用损害哺乳动物细胞液内的底物。其中 ,水肿因子是一种腺苷酸环化酶 ,可通过多种机理包括抑制吞噬作用 ,损害宿主的防御能力 ;致死因子 (ＬＦ)是一种依赖于锌的蛋白酶 ,可裂解巨噬细胞。第三种因子 (毒素 )称为保护抗原 (ＰＡ) ,可结合于细胞受体 ,并将酶促组分提供给细胞液。最近 ,美国威斯康星大学的科学家Ｋｅｎｎｅｔ…     

炭疽受体CMG2-Fc 融合蛋白在CHO 细胞中的表达、纯化与鉴定

目的:构建炭疽受体CMG2和人IgG1 Fc片段融合基因载体,转染CHO细胞并通过毒素中和试验检测CMG2-Fc拮抗炭疽毒素(PA+LF)的能力。方法:将含有CMG2胞外区1-217AA片度基因和人IgG1的Fc片段基因共同连接入pcDNA3.1载体转染CHO细胞并筛选高表达CMG2-Fc的CHO细胞系,通过小鼠RAW264.7巨噬细胞保护试验检测CMG2-Fc拮抗炭疽毒素的能力。结果:获得了表达CMG2-Fc的细胞株,毒素中和实验显示该蛋白可以有效抑制炭疽毒素引起的细胞损伤。结论:CMG2-Fc能够保护小鼠巨噬细胞免受炭疽毒素攻击,提示其可以作为抗毒素治疗炭疽感染。     

产生炭疽杆菌抗原的一种新的限定培养基

<正>炭疽杆菌的三组分毒素是由三种多肽成份组成的一种复合毒素或毒性物质:水肿因子(EF;因子I)、保护性抗原(PA;因子Ⅱ)和致死因子(LF;因子Ⅲ)。没有     

炭疽毒素受体胞外区在毕赤酵母中分泌表达、纯化与活性鉴定

使用分泌型表达载体,实现了重组炭疽毒素受体胞外区 (rATR(CMG2)-EXCELL) 在毕赤酵母 KM71H 培养物上清中的分泌表达 . 表达量约占培养物上清总蛋白质的 20%. 经过螯合柱初步纯化,每升诱导培养物可获得约 1 mg 电泳纯的 rATR(CMG2)-EXCELL. 体外与配基 PA 结合试验和细胞保护试验显示, rATR(CMG2)-EXCELL 具有很好的生物活性 . rATR(CMG2)-EXCELL 的成功表达为今后研究炭疽毒素受体的作用机理、发展新型炭疽治疗药物打下基础 .