热带假丝酵母高效利用甘油研究

目的:热带假丝酵母以油脂为底物发酵时会产生副产物甘油,研究对热带假丝酵母gk基因进行过表达,将副产物甘油转化为能量,提高油脂转化利用效率。方法:以热带假丝酵母Candida tropicalis 1798中的甘油激酶(gk)为研究对象,利用PCR技术获得同源臂基因gkpR,通过一步法无缝克隆将同源臂和G418抗性基因(kanr)连接至pPICzαA载体,同时将解脂假丝酵母Candida lipolytica 1457中的启动子基因pGAP无缝连接至载体中的gkpR,构成质粒pPICzαA-gkp,并电转化至C.tropicalis 1798感受态细胞中,通过一次同源单交换,将启动子pGK替换为pGAP。结果:经过G418抗性筛选和PCR鉴定,成功获得pGAP基因替换菌株C.tropicalis 1798-gkPr;发酵验证结果显示,启动子基因替换C.tropicalis 1798在以甘油为底物培养时重组菌OD600值比野生型菌株高46.4%,重组菌培养基中甘油剩余量比野生菌降低56.1%,表明启动子替换能促进C.tropicalis1798对甘油的吸收利用。此外,以油脂为底物进行发酵实验时还发现重组菌产长链二元酸的量比野生菌提高32.7%。结论:通过启动子替换手段构建的重组菌C.tropicalis 1798-gkPr,提高了热带假丝酵母对油脂组分中甘油成分的利用效率。     

代谢工程改造热带假丝酵母生产1,2,4-丁三醇

【背景】 1,2,4-丁三醇属于手性多羟基醇,是一种重要的有机合成的化学中间体,以木糖为原料经四步酶反应是目前研究最多的生物合成路线。然而大肠杆菌的鲁棒性较弱,对发酵液中一些抑制剂的耐受性不是很好,同时存在严重的碳代谢抑制。近年来,鲁棒性较好的酵母菌成为更有吸引力的宿主,其中热带假丝酵母具有天然的木糖代谢途径,可以更好地利用木糖。【目的】在热带假丝酵母中构建从木糖到1,2,4-丁三醇的代谢途径。【方法】在热带假丝酵母中敲除木糖还原酶基因GRE3,从而阻断自身的木糖代谢途径。将来源于Caulobacter crescentus的木糖脱氢酶基因(xylB)和木糖酸脱水酶基因(xylD)及来源于Lactococcus lactis的酮酸脱羧酶基因(kdcA)克隆至C. tropicalis 207中,得到重组菌C. tropicalis BT,在此基础上考察重组菌代谢木糖合成1,2,4-丁三醇的能力,确定限速步骤,并通过增加关键基因xylD与kdcA的拷贝数提高1,2,4-丁三醇产量。【结果】在30℃、200 r/min、接种量1%、以30 g/L木糖为底物的情况下,重组菌的1,2,4-丁三醇的产量达到了1.2 g/L,在5 L发酵罐中的产量达到了3.7 g/L。【结论】在热带假丝酵母中实现以木糖为底物的1,2,4-丁三醇代谢途径,并通过在基因组上增加关键基因xylD与kdcA的拷贝数,获得了一株高产1,2,4-丁三醇的重组酵母菌株,这为后续在热带假丝酵母中进一步提高1,2,4-丁三醇产量奠定了基础。     

运用穿梭载体建立产甘油假丝酵母质粒基因文库

产甘油假丝酵母WL2002─5既具有耐高渗压性能,又能以葡萄糖为原材料高产甘油,且耐高渗压性能与高产甘油的能力相关。本研究以大肠杆菌—酿酒酵母穿梭质粒YEp51为载体,通过对产甘油假丝酵母WL2002─5高分子量染色体DNA的提取、Sau3AI部分酶切、体外重组等建立起产甘油假丝酵母WL2002—5的质粒基因文库,库容为5．3×105,已满足对WL2002—5某一特定基因的克隆。     

泥炭提取液培养热带假丝酵母的研究

用稀酸酸解泥炭制得泥炭提取液,以该提取液为基质进行了热带假丝酵母的深层培养研究。试验结果表明,热带假丝酵母在泥炭提取液中最适生长条件是：１：１稀释的泥炭提取液,添加１％蔗糖和１．５％的酵母抽提物,起始ｐＨ６．４,接种量１％,３００ｍｌ摇瓶装液５０ｍｌ,３６℃２５０ｒｐｍ旋转培养４８小时。此条件下收获的细胞生物量比优化前提高２．６倍。     

热带假丝酵母79线粒体DNA的研究

本文报道了热带假丝酵母线粒体DNA的分离纯化、性质和酶切图。此线粒体DNA用电镜观察有线状、开环状和闭环状三种形状;在氯化铯中浮力密度为1.691g/cm~3;解链温度为80.0℃。限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ和PstⅠ在此线粒体DNA上分别有6、5和3个切点。根据酶切片段计算分子量为22.97×10~6道尔顿。同时,用双酶切方法得到此线粒体DNA的内切酶图谱。     

利用可重复使用的URA3标记基因建立热带假丝酵母基因敲除系统

热带假丝酵母(Candida tropicalis)在发酵工业中具有重要的应用潜力,但二倍体遗传结构和较低的遗传转化效率限制了其代谢工程育种技术的应用。建立可靠的遗传转化技术并高效的删除目的基因是代谢工程改造热带假丝酵母的重要前提。文章以C. tropicalis ATCC 20336为出发菌株,通过化学诱变筛选获得了尿嘧啶缺陷型突变株C. tropicalis XZX(ura3/ura3)。以丙酮酸脱羧酶(Pyruvate decarboxylase,PDC)基因作为靶基因构建了两端包含同源臂并在选择性标记C. tropicalis URA3(Orotidine-5′-phosphate decarboxylase,乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶)基因两侧同向插入源于沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的hisG序列的基因敲除盒PDC1-hisG-URA3-hisG- PDC1(PHUHP),并转化宿主菌株C. tropicalis XZX,筛选获得PHUHP片段正确整合到染色体的PDC基因位点的转化子XZX02。在此基础上,将转化子XZX02涂布于5-FOA(5-氟乳清酸)选择培养基上,筛选得到URA3基因从PHUHP片段中丢失的营养缺陷型菌株XZX03。进一步构建了第2个PDC等位基因的删除表达盒PDCm- URA3-PDCm,并转化C. tropicalis XZX03菌株,获得转化子C. tropicalis XZX04。经PCR和DNA测序确认转化子C. tropicalis XZX04细胞染色体上的两个PDC等位基因被成功敲除。文章建立了一种营养缺陷型标记可重复使用的热带假丝酵母遗传转化技术,利用该技术成功敲除了细胞的PDC基因,为进一步利用代谢工程改造热带假丝酵母奠定了基础。     

一种新的食品酵母表达系统:产朊假丝酵母

由于其安全性及高效性,产朊假丝酵母表达系统受到越来越广泛的重视。该酵母具有以下特点：严格好气的条件下生长不会产生乙醇,发酵密度高,在廉价的糖蜜中能生长,本详细介绍了该系统的生物学特点,转化方法和应用前景。     

热带假丝酵母不同培养条件下丝化的研究

研究了热带假丝酵母在不同培养条件下的丝化情况,实验中发现丝化率与菌体生长有着密切关系,对数期中后期丝化率处于低谷,稳定期早期丝化率达到最高。在液体培养条件下丝化率随着生长曲线呈“W”型波动;固体培养条件下丝化率随着生长曲线变化分为：持续增长型,“W”型,平缓“N”型。丝化率因培养基不同而有较大差异,不同培养基中丝化率最大能差近60％,其中以麦芽汁平板上的平均丝化率最高,稳定期平均丝化率达到了82％,液体YPD中最低。丝化率随时间变化幅度大小也因培养基而异。     

假丝酵母一新种——北京假丝酵母

本文研究了一株从水果表皮分离到的假丝酵母,它与至今已发表的所有已知假丝酵母均不相同,定名为北京假丝酵母(Candida beijingensis)。     

鉴别都柏林假丝酵母和白假丝酵母的一种新的烟草琼脂培养基

根据表型特征鉴别都柏林假丝酵母（都柏林念珠菌）和白假丝酵母（白念珠菌）的方法一般不完全可靠，最可信的选择是基于聚合酶链反应（PCR）的分子生物学方法，但因其要求条件较高，不适于推广使用。原本用于鉴定新生隐球菌的Staib琼脂和向日葵琼脂培养基在区分都柏林念珠菌和白念珠菌中的作用逐渐得到肯定,     

表型相似的热带假丝酵母和麦芽糖假丝酵母在脉冲电泳核型上的差异

热带假丝酵母Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ （Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉ ）Ｂｅｒｋｈｏｕｔ和麦芽糖假丝酵母Ｃ． ｍａｌｔｏｓａＫｏｍａｇａｔａ, Ｎａｋａｓｅ ＆ Ｋａｔｓｕｙａ是两种可利用烃类作为碳和能量来源的酵母菌,前者还是一种条件致病菌,可引起系统感染。这两种假丝酵母菌在形态和生理生化性状上非常相似,用常规分类方法不易准确地鉴别。本研究对Ｃ． Ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ和Ｃ ｍａｌｔｏｓａ的模式菌株以及中国普通微生物菌种保藏中心（ＣＧＭＣＣ）保藏的归于这两个种名下的其它菌株进行了脉冲电泳核型比较分析。发现这两个表型相似的种具有明显不同的染色体ＤＮＡ分子带型,而同一种内的不同菌株却具有相同或相似的分子核型。Ｃ．Ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ的特异染色体ＤＮＡ分子带谱为２条８．５—１．２ Ｍｂ的带, ４条２．３－３．４ Ｍｂ的带。 Ｃ ｍａｌｔｏｓａ的特异带谱为： ３～４条分子量在１．１－１．３Ｍｂ范围内的带, １条约为２．２Ｍｂ的带以及２－３条大小为３．２－３．５Ｍｂ的带。 Ｃ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ与Ｃ ｍａｌｔｏｓａ在染色体ＤＮＡ分子带型上的差异与二者在可溶性淀粉的同化能力和４０℃下的生长能力上的差异具有明显的相关性…     

产朊假丝酵母整合表达载体的构建

[目的]构建一个产朊假丝酵母(Candida utilis,C.utilis)整合表达载体.[方法]该载体以质粒pBR322为骨架,包括3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAP)启动子和终止子、放线菌酮(CYH)抗性基因和18S rDNA介导的同源整合区.再以木聚糖酶基因为目标基因,插入pGLR9K载体上,构建重组表达载体,电击转化C.utilis.对阳性转化子进行酶活测定,检测其表达情况.[结果]转化子的胞内外都可检测到木聚糖酶酶活,酶活可达60 U/mL.[结论]本实验构建了一个C.utilis载体,并用此载体表达了木聚糖酶基因,本研究将为产朊假丝酵母工程菌在饲料添加剂及食品行业中的应用提供又一个新的实验平台.     

热带假丝酵母唑类耐药相关基因的研究进展

临床上热带假丝酵母(又称热带念珠菌)的分离率越来越高,唑类抗真菌药物因较低的细胞毒性且大多可口服给药,是治疗热带念珠菌感染的常用药物。我国耐唑类药物热带念珠菌的分离率较高,因此有必要了解其具体机制,为寻求新的药物作用靶点提供依据。目前认为,与热带念珠菌唑类耐药有关的主要机制有靶基因ERG11过度表达和突变、编码转录因子的upc2基因过度表达和突变、外排泵基因过度表达及其他相关基因过度表达等。本文就目前热带念珠菌唑类耐药机制的基因水平研究进展进行综述。     

热带假丝酵母代谢烷烃过程中的β-氧化和代谢调控

热带假丝酵母(Candida tropicalis)能利用烷烃作唯一碳源和能源.当以烷烃或脂肪酸为碳源时,在细胞内可形成大量的过氧化物酶体(peroxisome),同时诱导生成脂肪酸β-氧化酶系,当以葡萄糖为碳源时,则极少有过氧化物酶体形成[1],一些C.tropicalis能氧化烷烃生成长链二元酸(long chain dicarboxylicacid,DCA).由于这些特征,人们从酶学、分子生物学和实际应用等方面对这种酵母进行了深入研究,并阐述了C.tropicalis代谢烷烃的途径、脂肪酸β-氧化酶系的生理功能及其几种重要酶的基因结构和酶活性的调控,阐明了它与哺乳动物细胞在脂肪酸代谢及调控方面上的差异;通过C.tropicalis突变株的筛选和发酵工艺的优化,使长链二元酸发酵技术实现了产业化[2,3].     

热带假丝酵母代谢烷烃过程中的β-氧化和代谢调控

热带假丝酵母 (Ｃａｎｄｉｄａｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ)能利用烷烃作唯一碳源和能源。当以烷烃或脂肪酸为碳源时 ,在细胞内可形成大量的过氧化物酶体 (ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ) ,同时诱导生成脂肪酸 β 氧化酶系 ,当以葡萄糖为碳源时 ,则极少有过氧化物酶体形成[1] ,一些Ｃ .ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ能氧化烷烃生成长链二元酸 (ｌｏｎｇｃｈａｉｎｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃａｃｉｄ ,ＤＣＡ)。由于这些特征 ,人们从酶学、分子生物学和实际应用等方面对这种酵母进行了深入研究 ,并阐述了Ｃ .ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ代谢烷烃的途径、脂肪酸β 氧化酶系…     

代谢工程改造热带假丝酵母高效合成中链ω-羟基脂肪酸

[目的]ω-羟基脂肪酸(ω-hydroxyfatty acid,ω-HFAs)是一种绿色安全无毒,具有良好生物相容性的理想生物降解材料,广泛应用于化工、食品、药学等方面,微生物发酵法生产ω-羟基脂肪酸具有重要的研究意义和应用前景.[方法]为了得到高产ω-羟基脂肪酸的代谢工程菌株,通过同源重组技术,连续敲除二倍体热带假丝...     

代谢改造热带假丝酵母发酵木糖母液生产木糖醇

木糖醇是一种在食品、医药、轻工等领域具有广泛用途的多元醇,目前主要通过酸水解木聚糖获得木糖并进一步化学催化加氢方法制备。提取木糖过程中会产生大量的木糖母液副产物,其中含有一定浓度的葡萄糖、木糖、阿拉伯糖等碳源,以及少量的糠醛、四氢呋喃等物质。研究微生物转化木糖母液生产高附加值化学品不仅能够提高木糖母液的利用价值,而且能够减少环境污染。热带假丝酵母不仅能够利用葡萄糖,也具有高效的木糖代谢途径。首先利用代谢工程技术删除了热带假丝酵母菌株的木糖醇脱氢酶基因,获得能够转化木糖积累木糖醇的突变株。在此基础上,评价了突变株在木糖母液培养基中的发酵性能。通过单因素优化实验确定了突变株发酵生产木糖醇较优的发酵工艺:培养基组成为木糖母液300g/L,玉米浆5g/L;最佳发酵条件为:发酵温度35℃,初始p H为5.0,接种量15%,200r/min摇床培养140h。利用优化后的发酵工艺,木糖醇产量达到83.01g/L。初步建立了转化木糖母液生产木糖醇的工艺,为进一步利用木糖母液奠定了基础。