葡萄风信子谷胱甘肽S转移酶基因克隆与表达分析

以亚美尼亚葡萄风信子为材料,利用本课题组前期获得的葡萄风信子转录组数据库,根据已经获得的葡萄风信子GST基因片段,通过PCR技术克隆得到葡萄风信子GST基因的c DNA序列,命名为Ma GST。Ma GST的c DNA全长为711 bp,开放阅读框为666 bp,编码221个氨基酸,推测蛋白质分子量为54.1 k D,理论等电点p I为5.13。利用生物信息分析软件对Ma GST基因进行同源性比对和系统进化分析表明,结果显示该基因编码的氨基酸具有谷胱甘肽S转移酶典型的C端与N端双结构域,属于GST Tau家族蛋白;与洋葱和小麦GST基因的一致性分别为76.72%和62.50%。实时定量PCR结果显示Ma GST在葡萄风信子各组织器官表达强度相似,属于组成型表达;水杨酸(SA)可以明显诱导Ma GST表达,Ma GST对氯化钠(Na Cl)应答不是很明显,甚至表达量有稍微的下调。     

火把梨谷胱甘肽S-转移酶基因的克隆与表达

依据火把梨编码谷胱甘肽S-转移酶(GST)的EST序列设计基因特异引物,采用快速扩增cDNA末端技术,从云南火把梨中克隆到一个新的GST基因的全长cDNA序列。该基因被命名为PpGST(GenBank登录号为HQ889136)。PpGST全长cDNA为1 177bp,具有130bp 5′-UTR、696bp ORF以及351bp 3′-UTR,编码含231个氨基酸的蛋白质。与已知植物GSTs家族成员间的氨基酸序列聚类分析将PpGST聚为zeta类GST。RT-PCR分析显示,PpGST在火把梨光照的果皮和没有光照的果皮中大量表达,并且表达强度不受光照时间的影响,而在幼嫩叶片中没有表达。研究结果暗示在果皮中大量表达的PpGST可能参与维持火把梨果实发育过程中的氧化还原平衡及应答逆境胁迫。     

石榴果色合成相关基因CHS和CHI的表达特性分析

花色苷是类黄酮家族中重要的一类次生代谢产物,对果实呈色起重要作用。CHS (查尔酮合成酶)和CHI (查尔酮异构酶)为花色苷合成提供了前体物质,是花色苷合成所不可或缺的。利用RT-PCR和RACE方法,本研究从石榴果皮中克隆了与花色苷合成相关的CHS基因和CHI基因的cDNA全长,同时采用qRT-PCR研究了这两个基因在三个不同色泽石榴品种‘红宝石’、‘水晶甜’、‘墨石榴’发育期内的表达模式,并分析了果皮花色苷含量变化与基因转录水平的关系。结果表明,石榴中CHS和CHI基因cDNA全长分别为1 197 bp和693 bp,分别编码398和230个氨基酸,命名为PgCHS和PgCHI,在GenBank中的登录号分别为KF841615和KF841616。在氨基酸水平上,Pg CHS与荔枝、葡萄、山竹等果树的同源性达到90%以上。Pg CHI与果树中龙眼、梨、美洲葡萄、桑树等同源性达到70%以上。qRT-PCR结果显示,CHS和CHI基因的表达模式随色泽发育期和品种不同而有差异。在‘红宝石’石榴中,该两个基因都有前期和后期两个表达高峰期;而‘水晶甜’石榴中这两个基因的表达高峰期均出现在中后期;‘墨石榴’发育初期时CHS和CHI的表达量最高,以后的表达量都较低。同一品种内,CHS和CHI的表达具有协同性,两者的协同性表达有利于花色苷及其他类黄酮相关产物的合成。3个品种中CHS和CHI基因的表达与花色苷的积累并不一致。     

牡丹二氢黄酮醇4-还原酶基因PsDFR1的克隆及表达分析

二氢黄酮醇4-还原酶（DFR）是花色素苷合成途径中的关键酶,在植物花色的形成过程中起重要作用。本研究以牡丹品种‘彩绘’为试材,采用RT-PCR和RACE方法从花瓣中获得了一个牡丹DFR基因cDNA全长,命名为PsDFR1,GenBank登录号为HQ283448。序列分析结果表明,PsDFR1全长1242bp,包含一个长为1095bp的开放阅读框,编码364个氨基酸。生物信息学分析显示该基因编码的蛋白具有典型的DFR蛋白功能结构域,包括多个保守的短链脱氢/还原酶家族的特征位点,属于NADB_Rossmann超家族。氨基酸序列比对和系统进化树分析表明,PsDFR1与葡萄、棉花、毛果杨、梨等植物的DFR相似性都在75%以上。实时荧光定量PCR分析表明,PsDFR1在花色素大量积累的花瓣中表达量最高,其次是萼片和雄蕊,再次是叶片,在心皮中表达量最低。     

漳州水仙ZDS 基因cDNA克隆及其表达分析

采用RACE技术从漳州水仙‘金盏银台’Narcissus tazetta var. chinensis花器官总RNA中克隆ZDS的cDNA序列,用相关软件进行序列分析,并利用实时荧光定量技术检测ZDS基因在各水仙品种不同花器官的表达。序列分析表明,ZDS基因cDNA全长2189 bp,其中包含69 bp 5'非编码区,395 bp 3'非编码区,1725 bp编码区（编码574个氨基酸,分子量约63.6 kDa）,命名为Ntzds （GenBank登录号: EU573238）,其编码的氨基酸序列（ACB87206.1）与喇叭水仙（CAA12062.1）、葡萄（XP_002277348.21）和温州蜜柑（ABC33728.1）ZDS基因编码产物的相似性分别为97%、85%和83%。实时荧光定量PCR分析表明,Ntzds基因在漳州水仙‘金盏银台’、‘Minnow’、‘Fortissimo’中均有表达,且同一品种中副冠的表达量高于花瓣;随着花色的加深,其转录水平也逐渐趋高。     

二色补血草硫氧还蛋白(Trx)的克隆和表达分析

从二色补血草cDNA文库中分离出1个硫氧还蛋白基因全长cDNA序列。基因全长1138bp,其中,5’非翻译（UTR）区128bp,3＇非翻译区212bp,开放阅读框（ORF）全长798bp,编码265个氨基酸,编码蛋白的分子量为28．58kDa,理论等电点（pI）为9．68。BlastP分析表明二色补血草Trx与拟南芥Trx序列同源性为52％,与葡萄7h序列同源性为76％,从11个物种的氨基酸多序列比对可以看出Trx氨基酸序列保守性较高。实时定量RT-PCR方法检测低温、NaCl和PEG胁迫不同时间后的基因在二色补血草中表达模式的结果表明,NaCl能诱导Trx基因在二色补血草叶中表达,胁迫24h后达到高峰,而聚乙二醇和低温处理则抑制Trx在二色补血草根和叶的表达。     

蝴蝶兰全长cDNA文库构建及F3′H基因克隆

以红色蝴蝶兰为材料,利用SMARTer技术构建蝴蝶兰全长cDNA文库,分析从文库中获得的EST序列,获得蝴蝶兰类黄酮3′羟化酶基因（PhF3′H）的全长,并对其进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR方法,研究PhF3′H基因在红色蝴蝶兰和黄色蝴蝶兰花瓣中的表达情况。结果表明:（1）从构建的蝴蝶兰文库中随机挑选24个单克隆进行测序,结果显示均含有插入片段,重组率为100.0%,其中扩增片段长度在750bp以上的克隆有22个,占91.7%。（2）获得的PhF3′H基因编码的氨基酸序列与大丽花（Dahlia pinnata,ADB₇7826.1）、毛油点草（Tricyrtis hirta,BAH₂2519.1）等多种观赏植物F3′H编码的氨基酸序列均具有较高的一致性。（3）实时荧光定量PCR检测结果显示,PhF3′H在红色蝴蝶兰中的表达量大约是黄色蝴蝶兰的19倍,说明该基因对蝴蝶兰花青素苷的积累有重要影响。该研究结果为蝴蝶兰新基因的挖掘及花色育种奠定了理论基础。     

‘黄花’梨及其芽变‘绿黄花’梨HHT基因克隆与表达分析

该试验以砂梨品种‘黄花’梨（果皮褐色）及其芽变‘绿黄花’梨（果皮绿色）盛花后第8周的果皮为试材,利用常规PCR和巢式PCR技术克隆了ω 羟基棕榈酸O 阿魏酰转移酶（ω hydroxypalmitate O feruloyl transferase, HHT）基因cDNA的全长,命名为 PpyHHT（登录号为KX131155）。序列分析结果表明,该基因开放阅读框（ORF）为1 335 bp,编码444个氨基酸。生物信息学分析显示,推定的PpyHHT蛋白质相对分子质量为49.91 kD,等电点是4.75,与白梨相似性高达98%,亲缘关系最近。实时荧光定量PCR（qRT PCR）表达分析显示,2种梨果皮中 PpyHHT基因在盛花后6~9周的4个转色关键期表达量不断变化,在‘黄花’梨果皮中的表达量明显高于‘绿黄花’梨。推测 PpyHHT基因可能参与砂梨果实褐色/绿色性状的形成。     

甘蔗过氧化氢酶基因的电子克隆及生物信息学分析

应用电子克隆技术,获得甘蔗中一个过氧化氢酶基因的cDNA序列全长,命名为S-CAT。该基因全长2160bp,包含一个1479bp的开放阅读框,编码492个氨基酸。通过PSORT工具,预测甘蔗S-CAT蛋白存在于过氧化物酶体中。同源比对分析显示,S-CAT基因编码的氨基酸序列与水稻、玉米、高粱、朝鲜碱茅、葡萄等植物中过氧化氢酶基因所编码的氨基酸序列高度同源,同源性分别为97%,97%,95%,91%和92%。研究结果为该基因的实验克隆奠定基础。     

中国野生毛葡萄芪合成酶基因克隆及表达分析

采用RT-PCR技术克隆中国野生毛葡萄‘丹凤-2’芪合成酶基因,命名为VqDSTS1,并进行序列及表达模式分析.结果表明:VqDSTS1基因cDNA编码区全长为1 179bp,GenBank登录号为JQ342086,编码392个氨基酸;氨基酸序列分析表明,VqDSTS1含有芪合成酶基因家簇的特征识别序列‘IPNSAGAIAGN’和‘GVLFGFG-PGLT’;序列比对显示,VqDSTS1与其他葡萄种质的芪合成酶氨基酸序列一致性在95.2%～98.7%之间;半定量RT-PCR分析表明,VqDSTS1受白粉病诱导表达,呈双峰模式.为进一步研究中国野生毛葡萄‘丹凤-2’芪合成酶基因家族的表达及功能分析提供了基础.     

柑橘钙结合蛋白基因的克隆及其在果皮褐变中的表达分析

从柑橘果皮褐变相关基因的差减cDNA文库中,筛选了一个与钙结合蛋白基因家族同源的EST片段,通过RACE技术克隆了其全长cDNA序列(CsCAB,GenBank登录号EF010854).CsCAB基因全长984 bp,含有一个621 bp的开放阅读框,编码207个氨基酸,预测蛋白质分子量为22.95 kD,理论等电点为4.5;序列分析结果显示CsCAB与钙结合蛋白具有很高的同源性,且具有钙结合蛋白的保守结构域EF-hand.Northern blot结果显示CsCAB在褐变果皮中上调表达,说明该基因与柑橘果实的果皮褐变有密切关系.     

板栗MADS-box蛋白基因(CmMADS3)的克隆和表达分析

根据MADS-box基因保守区结构,设计简并引物,从板栗（Castanea mollissima）中分离出花特异表达基因的cDNA片段。并通过5’RACE方法获得了全长cDNA,命名为CmMADS3。该片段全长1016bp,包含一个729bp的开放阅读框,推导的氨基酸序列（243个氨基酸）与拟南芥的SEPl、SEP2和SEP33类MADS-box蛋白有很高的序列相似性。系统进化分析同样将CmMADS3基因归入MADS-box基因家族的AGL2组。RT-PCR分析显示,该基因在板栗的花和幼果中表达丰度高,在茎中有微弱的表达,在叶中不表达,研究结果表明CmMADS3基因是板栗花器官发育中具有E功能的功能基因。     

青花菜谷胱甘肽-S-转移酶基因克隆及其表达分析

为探讨青花菜在模拟酸雨胁迫下谷胱甘肽-S-转移酶的表达变化,克隆了青花菜谷胱甘肽-S-转移酶基因(glutathione-S-transferase,GST)的cDNA序列全长,并进行了生物信息学和表达分析。结果表明:青花菜GST基因cDNA全长为915bp,开放阅读框为642bp,编码213个氨基酸,推测分子式为C1091H1719N289O306S5,分子量为23 940.7,没有跨膜螺旋区域和信号肽。系统进化树分析表明,该青花菜基因GST与芥菜的GST聚类关系最近。实时荧光定量PCR结果显示,在模拟酸雨胁迫下,GST基因的表达量在胁迫初期显著增大,随时间延长开始下降,表明其参与了青花菜抗酸雨的应答反应。     

西伯利亚蓼钙调蛋白基因的克隆及其在盐胁迫下的表达

已从西伯利亚蓼叶中cDNA文库中获得的钙调蛋白EST序列,采用cDNA末端快速扩增（RACE）技术克隆了具有完整编码区的钙调蛋白基因的cDNA序列（GenBank登录号GQ988382）,命名为PsCaM。该基因全长615bp,编码区为450bp,编码149个氨基酸,5＇非翻译区为63bp,3＇非翻译区为102bp。同源性分析表明,该蛋白与其他植物钙调蛋白高度保守,氨基酸同源性高达98%。用实时荧光定量PCR研究3%NaHCO3胁迫下西伯利亚蓼基因表达的结果显示,自然条件下,该基因在叶中表达量最高,地下茎次之,茎中最低;盐胁迫下CaM在西伯利亚蓼的地下茎、茎和叶中均有表达,表达模式不同。     

桂花查尔酮异构酶OfCHI基因的克隆与表达分析

查尔酮异构酶CHI是花青素苷合成途径中的关键酶。为了解桂花花青苷的合成机理,该研究对3个桂花品种的花青苷含量进行了测定。结果显示:(1)‘橙红丹桂’花中的花青苷含量最高,‘金桂’和‘早银桂’中花青苷含量较低。(2)利用RACE和RT-PCR方法获得了桂花查尔酮异构酶基因(OfCHI)的全长cDNA序列1 069bp,该基因编码248个氨基酸,相对分子量为26.85kD,等电点为6.34。(3)多重序列比对显示,OfCHI与金花茶CnCHI、忍冬LjCHI、石榴PgCHI的相似性分别为68.13%、65.86%和63.53%,氨基酸序列中含有CHI蛋白的活性位点Thr47、Tyr108、Met115以及Ser192;系统进化树分析表明,OfCHI与其他物种起源相同,而与油橄榄OeCHI亲缘关系最近。(4)利用qRT-PCR对不同桂花品种、不同组织中OfCHI的表达量检测结果显示,OfCHI在‘橙红丹桂’花中表达量最高,在‘金桂’和‘早银桂’中表达量较低;OfCHI在‘橙红丹桂’、‘金桂’和‘早银桂’的花、茎、叶中均有表达,且表达趋势相同,均为叶中表达量最高。该研究为揭示桂花青素苷的合成机理奠定了理论基础,并为培育不同花色的桂花新品种提供了基因专利。     

鸡爪槭叶片花青素合成酶基因ApANS的克隆与表达分析

花青素合成酶(anthocyanin synthetase,ANS)是花色苷合成途径末端的一个关键酶,催化无色花色素到有色花色素的转变。该研究利用RACE技术从鸡爪槭‘出猩猩’深红色叶片中克隆获得一个ANS基因,命名为ApANS。该cDNA序列全长1 371 bp,具有完整的开放阅读框(ORF),共1 083 bp,编码360个氨基酸,该基因编码的蛋白质具有典型的2OG-Fe II-Oxy保守功能域,保守结构域中含有α-酮戊二酸及Fe~(2+)结合位点,属于α-酮戊二酸双加氧酶家族;序列比对和系统进化分析表明,鸡爪槭ApANS蛋白质与同为无患子目的龙眼ANS蛋白质同源性为90%,亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析结果显示,ApANS基因在红色叶片中表达量较高,略带红色的黄色、绿色叶片中微量表达,绿色叶片中不表达;在叶片芽叶期、展叶期及呈色期具有很高的表达量,而后随着叶色的转绿,表达量急剧下降。这说明,ApANS在鸡爪槭叶片花色苷代谢及色泽形成过程中具有重要作用。     

葡萄果实成熟期花色苷与白藜芦醇合成相关基因的表达

以酿酒葡萄‘赤霞珠’为试材,采用pH示差法和高效液相色谱(HPLC)法分别测定葡萄成熟期果皮花色苷和白藜芦醇含量,用实时荧光定量PCR检测两者合成途径中相关基因的表达量,分析花色苷含量和白藜芦醇含量与其相关基因表达的关系,以揭示结构基因与调控基因的调控机制,为筛选富含花色苷和白藜芦醇的酿酒葡萄提供理论依据。结果显示:(1)葡萄果皮花色苷含量在花后112d达到最高值(0.77mg/g),反式白藜芦醇含量在花后126d达到最高值(30.87μg/g)。(2)花色苷和白藜芦醇合成途径中,CHSs、CHI、STS、UFGT、MybA1、MybA2基因的表达量除花后98d下调外,其余时间均呈上调表达,而Myb5a则始终呈上调表达。(3)相关分析表明,STS基因表达量与CHS1、CHS2基因表达量呈极显著和显著正相关关系,MybA1、MybA2基因表达量与CHSs、CHI、STS、UFGT基因的表达量呈极显著正相关关系;Myb5a基因表达量与CHS3基因表达量呈极显著正相关关系。研究表明,部分结构基因的表达与花色苷和白藜芦醇的变化不同步,MybA1和MybA2可能调控花色苷合成途径中多个结构基因的表达,花色苷与白藜芦醇的关系并不固定,而是处在动态变化中。     

球毛壳菌（Chaetomium globosum）过氧化物膜蛋白过敏原基因克隆、序列分析及原核表达

以球毛壳菌cDNA文库中获得过氧化物膜蛋白（pero）基因片段（GenBank Accn:BP099709）为基础,用RACE 技术获得该基因的全长cDNA序列。序列长747bp,由412bp的3′RACE产物和508bp的5′RACE产物拼接而成。开放阅读框501bp,编码166个氨基酸,蛋白分子量为17.5kD,理论等电点为5.75。利用cDNA两侧非编码区序列作引物克隆出该基因的DNA序列,序列分析表明该基因由2个内含子和3个外显子组成。ClustalX多序列比对表明：该基因与粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）的过氧化物膜蛋白过敏原同源性最高（83%）。将pero基因编码区克隆到原核表达载体pET28a中,构建成表达质粒pET28a-pero并转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导后SDS-PAGE检测表达情况,结果发现在21kD处有一特异性融合蛋白带,大小与预期相符,说明该基因已经在大肠杆菌中表达。克隆的cDNA序列、DNA序列及推测的氨基酸序列在GenBank登录(登录号分别为AY555771,AY584753,AAS66898)。     

七彩红竹二氢黄酮醇4-还原酶基因IhDFR1的克隆及表达分析

二氢黄酮醇4-还原酶（DFR）是植物花色素苷合成途径中的关键酶,在植物花色的形成过程中起重要作用。依据七彩红竹转录组数据设计特异引物,采用ImPcR技术从七彩红竹中克隆获得了一个新的DFR基因cDNA全长,命名为IhDFR1（登录号为KF728205）。序列分析结果表明,IhDFR1基因cDNA全长945bp,编码314个氨基酸。生物信息学预测显示,该基因编码的蛋白具有典型的DFR蛋白功能结构域,存在2个特异结合位点,属于非Asn／Asp型DFR酶,与禾本科植物中的DFR具有较高的相似性。对不同发育时期七彩红竹的IhDFR1基因进行时空表达的结果显示,只有在竹秆颜色呈现红紫色时,IhDFR1基因才有表达。以上结果初步显示IhDFR1蛋白可能作为一个重要的酶参与竹秆花色素苷的代谢调控,同时为进一步研究七彩红竹花色素苷产生的分子机理和综合开发利用奠定了基础。