盐胁迫下花花柴miR398对Cu/Zn超氧化物歧化酶基因的调控研究

植物miRNA能够参与盐胁迫下基因表达的调控。在盐胁迫条件下盐生植物花花柴miR398(KcmiR398)呈现显著性差异表达,为了探讨miR398的靶基因及其对靶基因的调控方式,通过生物信息学分析(http://plantgrn.noble.Org/psRNATarget/),预测KcmiR398的靶基因分别为Cu/Zn超氧化物歧化酶(SOD)基因CSD1和CSD2。利用RACE技术从花花柴中克隆到CSD1和CSD2基因全长序列,分别命名为KcCSD1和KcCSD2。qRT-PCR结果表明:(1)KcmiR398在盐胁迫的花花柴茎中上调表达,在新叶中下调表达;KcCSD1在盐胁迫的老叶中上调表达,而在老茎和根中下调表达;KcCSD2在盐胁迫的老茎和根中上调表达。(2)300mmol/L NaCl胁迫24~48h,KcmiR398与对照无显著差异;KcCSD1的表达为对照的3倍以上,而KcCSD2的表达没有显著差异。研究表明,花花柴的KcmiR398和KcCSD1、KcCSD2有组织差异性表达,盐胁迫可以影响KcmiR398和KcCSD1、KcCSD2基因的表达以适应盐胁迫产生的氧化危害。     

响应盐胁迫调控的露地菊miR398a的克隆及功能研究

miRNAs在非生物胁迫中起着重要的作用。通过前期对露地菊Small RNA高通量测序数据测得到miR398a成熟体和前体序列,命名为cgr-miR398a和cgr-MIR398a。序列对比显示,cgr-miR398a与其他植物中已经鉴定的miR398a序列高度保守;利用前期露地菊降解组数据获得miR398a预测的靶基因,cgr-miR398a根和叶中的靶基因共有18个,其中有铜/锌超氧化物歧化酶（CSD2）、铜伴侣蛋白（CCS）、类A20/AN1-l锌指家族蛋白（SAP8）等与抗性相关的基因。qPCR结果显示盐胁迫下露地菊miR398a及靶基因在不同组织部位的表达水平存在显著的负相关性。为探究cgr-miR398a响应盐胁迫的功能,克隆cgr-MIR398a并构建过表达载体转化拟南芥。结果表明,拟南芥中过表达cgr-MIR398a降低了盐胁迫下种子发芽率以及成苗期的抗盐性,说明cgr-miR398a在拟南芥响应盐胁迫中起着负调控作用。这为进一步研究露地菊mi398a的功能和露地菊的抗盐机理奠定了基础。     

miR398在植物逆境胁迫应答中的作用

MicroRNA (miRNA)是一类新型的调控基因表达的小分子RNA, 它作为基因表达的负调控因子, 在转录后水平调节靶基因的表达。miRNA参与调控植物的生长发育, 并在多种非生物与生物胁迫响应中发挥重要作用。miR398是第一个被报道的受氧化胁迫负调控的miRNA。它通过负调控其靶基因Cu/Zn过氧化物歧化酶(Cu/Zn-superoxide dismutase, CSD)的表达, 在多种逆境胁迫响应中扮演重要角色, 如调节铜代谢平衡, 应答重金属、蔗糖、臭氧等非生物胁迫, 以及参与应答生物胁迫等。文章综述了miR398在多种逆境胁迫响应中重要的调节作用及miR398自身的转录调控。     

白桦BpBEE2基因的遗传转化及抗逆性分析

Brassinolide Enhanced Expression2（BEE2）基因属于bHLH转录因子家族,是调控油菜素内酯信号转导的上游调控因子。本研究通过RT-PCR技术克隆BpBEE2基因的全长cDNA序列,构建植物过表达及抑制表达载体,并通过农杆菌介导法进行白桦的遗传转化,对获得的转基因株系进行生长量及盐、旱胁迫分析,结果表明：获得了长度为1 080 bp的全长cDNA序列,成功构建了该基因的过表达及抑制表达载体,并获得了过表达和抑制表达的白桦株系。BpBEE2基因过表达白桦株系的苗高高于对照株系,而抑制表达株系的苗高低于对照株系。同时发现BEE2基因对盐、旱胁迫后对植株的鲜重也产生了影响。说明BpBEE2可能参与了植物的生长发育过程,并且改善了植物的抗旱、耐盐性。     

水稻锌指蛋白基因O_sBBX22响应热胁迫的功能分析

利用RNA干涉技术研究水稻锌指蛋白基因O_sBBX22的生物学功能,为探讨O_sBBX22响应热胁迫的机制、培育抗逆水稻、减轻高温对水稻的损害奠定基础。通过观察转基因突变体植株和野生型植株在热胁迫下的表型差异,分析O_sBBX22生物学功能;采用半定量PCR和荧光定量PCR检测O_sBBX22以及相关的热激转录因子(HSF)、热激蛋白(HSP)基因在转基因突变体株系中的表达水平;通过原位组织化学检测过氧化氢在野生型、转基因突变体株系叶片中的定位和积累情况。结果表明,在0~5 h热胁迫条件下,与野生型株系相比,O_sBBX22的表达在转基因突变体植株中明显下调;而野生型O_sBBX22受热信号诱导,随着热激时间的增加,O_sBBX22的表达量呈先上升后下降的趋势,且在热激1 h时表达量最高。相关的HSF和HSP也受热信号诱导,野生型株系中的HSFA2a、HSFA7、HSP16.9和HSP100表达量均比转基因突变体株系高,且在热激1 h时,HSFA2a、HSP16.9和HSP100表达量最高,而HSFA7在热激3 h时表达最高。热胁迫3 h,经DAB染色,转基因突变体株系叶片上出现的红褐色斑点主要集中于叶脉和受损伤部位,且明显多于野生型。锌指蛋白基因O_sBBX22在水稻苗期热胁迫应答中具有重要的作用,野生型株系抗热能力明显高于O_sBBX22抑制表达转基因株系;HSFA2a、HSFA7、HSP16.9和HSP100可能参与了O_sBBX22介导的水稻耐热调控。     

过表达TaLEA1和TaLEA2基因提高转基因拟南芥的耐盐性

我国土壤盐碱化日益严重,对我国的粮食安全造成了严重威胁。耐盐基因挖掘对作物耐盐育种非常重要。LEA蛋白家族是一个多基因家族,在植物应对非生物胁迫中发挥重要作用。本课题组前期研究阐明小麦TaLEA1基因在拟南芥中过表达可以提高转基因植物的耐盐性和抗旱性。本研究系统分析了小麦TaLEA2基因表达蛋白的理化性质、基因表达模式及启动子功能区域,并在拟南芥中过表达TaLEA2基因及共表达TaLEA1和TaLEA2基因,分析TaLEA2基因的抗逆功能及2个LEA基因的抗逆效果。结果表明,TaLEA2基因的表达产物属于第3组LEA蛋白,是稳定的亲水蛋白,富含α-螺旋、β-转角等结构。TaLEA2基因在小麦根、茎、叶、花、种子等不同组织中均有表达,盐胁迫条件诱导其高表达。在拟南芥中过表达TaLEA2基因,或过表达TaLEA1和TaLEA2基因都能够提高转基因拟南芥的耐盐性和抗旱性,转基因株系的种子萌发率、根长及叶绿素含量显著高于野生型,且双基因过表达的转基因植物的抗逆能力高于单个基因过表达株系。本研究结果为LEA基因抗逆机理的研究和多基因共转提高植物抗逆性提供了重要信息。     

OsBTF3过表达转基因水稻株系的创制及其分子鉴定

本研究旨在创制OsBTF3过表达转基因水稻株系,为验证OsBTF3基因在水稻抗性和生长发育中的功能、评价其在水稻农艺性状遗传改良中的应用价值提供试验材料。通过基因过表达载体构建、水稻愈伤组织诱导、农杆菌介导愈伤组织转化、植株再生、潮霉素抗性(Hyg^R)筛选及PCR验证、基因过表达RT-Q-PCR检测等方法,成功地获得了97个T₀代和20个T₁代过表达转基因株系,并分别得到分子验证。与野生型对照株相比,5个T₁代过表达株系中的OsBTF3基因表达水平显著提高,平均高达3.58倍。因此,由组成型表达的35S启动子驱动的OsBTF3基因在转基因水稻株系中成功地得到了增量表达,并对水稻生长发育、抗病性和抗逆性具有调控作用。     

山葡萄CBF基因表达载体构建及对拟南芥根生长的影响

为了研究山葡萄CBF基因调节植物对盐胁迫的应答机理,分别构建了山葡萄Va CBF1、Va CBF2和Va CBF3的植物过表达载体。经酶切及琼脂糖电泳检测证实3个基因均插入到p BASTA中,表明表达载体构建成功。然后,分别将3个植物过表达载体转入农杆菌EHA105中,并通过浸花法浸染拟南芥。利用除草剂筛选获得3个基因的拟南芥过表达株系。最后,对野生型拟南芥与转基因拟南芥进行盐胁迫处理,发现OE-CBF2转基因植株的主根伸长长度显著长于其它植株,3个转基因株系的侧根长度也明显长于野生型植株。上述结果表明山葡萄CBF基因可能在植物盐胁迫中对根部生长发育起到非常重要的调控作用。     

RsICE1基因表达和转基因水稻抗冷通路研究

以萝卜幼苗和水稻T1代转RsICE1基因(从抗寒萝卜植株中分离的一个编码碱性螺旋-环-螺旋低温胁迫转录因子,HQ891287)株系为材料,通过半定量RT-PCR及实时定量PCR等方法,分析RsICE1基因的表达、水稻转基因株系中RsICE1基因的遗传及冷诱导基因的表达情况.结果显示:(1)半定量RT PCR分析表明,RsICE1基因在萝卜的根、茎、叶中为组成型表达,在幼苗根和茎中表达量较强;RsICE1基因的表达水平能够被冷处理和NaCl处理诱导上调表达,但ABA和脱水处理无上调作用.(2)卡方测验表明,水稻转基因T1代潮霉素抗性发生了3∶1分离模式;Southern和Northern杂交结果表明,4个抗冷转基因株系中RsICE1基因均以单拷贝、单位点整合到水稻基因组并正常表达.(3)实时定量PCR分析表明,冷胁迫下,RsICE1基因超表达但对水稻OsDREB1A(AF300970)、OsDREB1B(AF300972)、OsDREB1F(AY785897)基因表达没有影响,表明RsICE1基因对转基因水稻抗寒性的影响不依赖OsDERB1冷反应通路.     

水稻Bph14基因生理功能初探

Bph14基因是第一个被克隆的水稻抗虫基因,但鲜有Bph14基因对水稻生理方面影响的报道。研究该基因对水稻生理方面的影响有助于全面理解Bph14基因对褐飞虱的抗性机制。将Bph14基因转入水稻栽培品种中,对携带有外源基因的转基因株系通过荧光定量PCR检测乙烯合成和非生物胁迫相关基因的表达,另外,分别用5μmol/L ABA和250 mmol/L Na Cl处理转基因水稻株系和相应受体材料,结果表明,与乙烯合成相关的基因Os ACO2,Os ACS2,Os ACS6,O1g P5CS和O5g P5CS的表达量均较转基因受体m5274发生了变化,与干旱、耐盐等非生物胁迫相关的基因Cat A、Cat B、Cat C、RAB16A、LEA3、LIP9、Sal T、Adh I等也都不同于在受体m5274中的表达。同时Bph14基因的导入也提高了水稻对ABA的敏感性和对盐胁迫的耐受性,说明Bph14基因在水稻中可能参与调控乙烯合成以及非生物胁迫应答的功能基因的表达。     

Biotic and abiotic stress down-regulate miR398 expression in Arabidopsis

MicroRNA398 targets two Cu/Zn superoxide dismutases (CSD1 and CSD2) in higher plants. Previous investigations revealed both decreased miR398 expression during high Cu²⁺ or paraquat stress and increased expression under low Cu²⁺ or high sucrose in the growth medium. Here, we show that additional abiotic stresses such as ozone and salinity also affect miR398 levels. Ozone fumigation decreased miR398 levels that were gradually restored to normal levels after relieved from the stress. Furthermore, miR398 levels decreased in Arabidopsis leaves infiltrated with avirulent strains of Pseudomonas syringae pv. tomato, Pst DC3000 (avrRpm1 or avrRpt2) but not the virulent strain Pst DC3000. To our knowledge, miR398 is the first miRNA shown to be down-regulated in response to biotic stress (P. syringae). CSD1, but not CSD2, mRNA levels were negatively correlated with miR398 levels during ozone, salinity and biotic stress, suggesting that CSD2 regulation is not strictly under miR398 control during diverse stresses. Overall, this study further establishes a link between oxidative stress and miR398 in Arabidopsis.     

Sucrose induction of <Emphasis Type="Italic">Arabidopsis</Emphasis> miR398 represses two Cu/Zn superoxide dismutases

MicroRNAs (miRNAs) are approximately 21-nt RNAs that reduce target accumulation through mRNA cleavage or translational repression. Arabidopsis miR398 regulates mRNAs encoding two copper superoxide dismutase (CSD) enzymes and a cytochrome c oxidase subunit. miR398 itself is down-regulated in response to copper and stress. Here we show that miR398 is positively regulated by sucrose, resulting in decreased CSD1 and CSD2 mRNA and protein accumulation. This sucrose regulation is maintained both in the presence and absence of physiologically relevant levels of supplemental copper. Additionally, we show that plants expressing CSD1 and CSD2 mRNAs with altered miR398 complementarity sites display increased mRNA accumulation, whereas CSD1 and CSD2 protein accumulation remain sensitive to miR398 levels, suggesting that miR398 can act as a translational repressor when target site complementarity is reduced. These results reveal a novel miR398 regulatory mechanism and demonstrate that plant miRNA targets can resist miRNA regulation at the mRNA level while maintaining sensitivity at the level of protein accumulation. Our results suggest that even in plants, where miRNAs are thought to act primarily through target mRNA cleavage, monitoring target protein levels along with target mRNA levels is necessary to fully assess the consequences of disrupted miRNA-mRNA pairing. Moreover, the limited complementarity required to maintain robust miR398-directed repression of target protein accumulation suggests that similarly regulated endogenous plant miRNA targets may have eluded detection.