海南捕鸟蛛毒素-Ⅳ突变体的固相合成和生理活性分析

海南捕鸟蛛毒素-Ⅳ(HNTX-Ⅳ)是从我国海南捕鸟蛛粗毒中分离出的一种TTX-敏感型的钠离子通道阻断剂,由35个氨基酸残基组成,含3对二硫键.为了研究HNTX-Ⅳ结构与功能的关系,用芴甲氧羰基(Fomc)固相多肽合成方法合成了用丙氨酸(Ala)替代HNTX-Ⅳ第12位丝氨酸(Ser12)的突变体S12A-HNTX-Ⅳ和替代第29位精氨酸(Arg29)的突变体R29A-HNTX-Ⅳ.合成的突变体经谷胱甘肽法氧化复性和纯化后,分别用MALDI-TOF质谱进行分子量鉴定,用一维核磁共振波谱法分析空间结构的变化,膜片钳电生理方法分析生物学活性.结果表明,Ser12和Arg29被Ala突变后没有明显影响分子的空间结构,S12A-HNTX-Ⅳ的生物学活性与天然HNTX-Ⅳ的相近,提示Ser12与HNTX-Ⅳ的生物学活性无关或关系不大;而R29A-HNTX-Ⅳ的生物学活性下降了155倍,说明Arg29是与HNTX-Ⅳ生物学活性相关的关键残基之一.推测R29A-HNTX-Ⅳ活性的降低是由于Ala替代Arg后改变了HNTX-Ⅳ与受体作用的位点,而不是由于毒素分子整体空间结构变化所致.     

虎纹捕鸟蛛毒素—Ⅰ突变体K3A—HWTX—I的化学合成与生理活性分析

采用固相Ｆｍｏｃ法在自制自动蛋白质化学工作站上合成了春第３位赖氨酸被丙氨酸取代的虎纹捕鸟蛛毒素－Ｉ的突变体Ｋ３Ａ－ＨＷＴＸ－Ｉ。合成的突变体用Ｅｄｍａｎ降解和电雾质谱进行鉴定。Ｋ３Ａ－ＨＷＴＸ－Ｉ经谷胱甘肽系统进行氧化复性后通过离子交换和反相ＨＰＬＣ纯化。     

虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅰ突变体A1Y-HWTX-Ⅰ的固相合成和生物学活性测定

用芴甲氧羰基 (Fmoc)固相多肽合成的方法在自制自动蛋白质化学工作站上合成了用酪氨酸 (Y)替代虎纹捕鸟蛛毒素 - (HWTX- )第一位丙氨酸 (A1 )的突变体 A1 Y- HWTX- .合成的突变体用 Edman降解和电喷雾质谱法进行鉴定 .活性分析结果证明 ,合成的 A1 Y- HWTX- 在含有谷胱甘肽的缓冲体系中氧化折叠后显示出与天然 HWTX- 完全相同的生物学活性 ,提示 Y替代 HWTX- 的 A1后并不明显影响 HWTX- 的活性部位和空间构象 ;A1与 HWTX- 生物学活性无关 .此外 ,将 Y引入 HWTX- 分子有助于利用碘标记方法研究 HWTX- 的作用机制     

虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅰ突变体K3A-HWTX-Ⅰ的化学合成与生理活性分析

采用固相Ｆｍｏｃ法在自制自动蛋白质化学工作站上合成了其第３位赖氨酸（Ｋ３）被丙氨酸（Ａ）取代的虎纹捕鸟蛛毒素－Ⅰ的突变体Ｋ３Ａ－ＨＷＴＸ－Ⅰ．合成的突变体用Ｅｄｍａｎ降解和电喷雾质谱进行鉴定．Ｋ３Ａ－ＨＷＴＸ－Ⅰ经谷胱甘肽系统进行氧化复性后通过离子交换和反相ＨＰＬＣ纯化．活性分析结果表明,Ｋ３被Ａ取代后ＨＷＴＸ－Ⅰ的生物活性下降了８０％,提示Ｋ３与ＨＷＴＸ－Ⅰ的生物活性有一定的相关性     

Arg26和Lys27突变对海南捕鸟蛛毒素-Ⅳ生物活性影响

海南捕鸟蛛毒素Ⅳ(hainantoxin-Ⅳ,HNTX-Ⅳ)是一种新型的从海南捕鸟蛛粗毒中分离纯化的作用于河豚毒素敏感型(tetrodotoxinsensitive,TTXS)钠通道阻断剂.采用2D1HNMR技术解析HNTXⅣ的空间结构为胱氨酸抑制剂结模体,为进一步阐述HNTX-Ⅳ结构与功能的关系,应用固相Fmoc方法化学合成了用丙氨酸代替海南捕鸟蛛毒素Ⅳ第26位精氨酸的单残基突变体R26AHNTXⅣ和第27位赖氨酸的单残基突变体K27AHNTXⅣ.合成的突变体用谷胱甘肽法氧化复性并通过反相高效液相色谱(RPHPLC)纯化.通过MALDITOF质谱测定突变体的分子量.通过核磁共振谱仪测定突变体的空间结构.通过全细胞膜片钳实验比较天然HNTX-Ⅳ(nHNTX-Ⅳ)和两个突变体分子的生物学活性.结果发现,nHNTX-Ⅳ的R26或K27被突变后的空间结构没有发生明显变化.R26AHNTX-Ⅳ能明显抑制TTXS钠电流,K27AHNTX-Ⅳ对TTXS钠电流无明显影响.说明第26位的精氨酸与HNTX-Ⅳ的生物学活性无关,而第27位赖氨酸则是HNTX-Ⅳ的关键残基.     

虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅰ的化学合成及其结构与生理活性分析

应用芴甲氧羰基(Fmoc)固相方法化学合成了虎纹捕鸟蛛毒素-I,合成采用Fmoc氨基酸五氟苯酯,各侧链保护措施如下:羧基和酚羟基用叔丁基(tBu)保护,赖氨酸和组氨酸侧链用叔丁氧羰基(Boc)保护,精氨酸胍基用4-甲氧-2,3,6-三甲基苯磺酰基(Mtr)保护,半胱氨酸巯基用三苯甲基(Trt)保护.固相载体为需活化的乙二胺-聚乙二醇-聚苯乙烯(EDA-PEG-PS)树脂.合成产物(肽树脂)用苯甲硫醚-乙二硫醇-苯甲醚-三氟乙酸系统一步裂解以及去除侧链保护基,然后用二硫苏糖醇(DTT)还原,再通过氧化型和还原型谷胱甘肽系统促使其形成正确的二硫键配对.对HPLC分离纯化得到的合成产物,进行了氨基酸组成、肽谱、氨基酸顺序以及一维核磁共振谱分析.分析结果表明合成毒素具有与天然毒素相同的化学结构和空间构象.生理实验结果表明,其生物学活性与天然Huwentoxin-I也相同.     

虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅰ单残基突变体R20A-HWTX-Ⅰ的化学合成与性质分析

虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅰ(Huwentoxin-Ⅰ,HWTX-Ⅰ)是从虎纹捕鸟蛛(-Selenocosmia huwena)-的粗毒中分离出的一种多肽类神经毒素。为了探明该毒素分子中唯一的Arg残基与其生物学活性的关系,运用固相多肽合成技术和Fmoc化学直接构建了Ala取代HWTX-Ⅰ第20位Arg(R20)的突变体R20A-HWTX-Ⅰ;将合成的突变体置于含谷胱甘肽的缓冲体系中氧化复性后用反相和特殊设计的离子交换HPLC纯化,并对之进行氨基酸组成、Edman降解与质谱分析。活性测定结果表明,HWTXⅠ分子中的R20被A取代后,活性下降了92%,提示R20是与活性密切相关的重要残基。     

虎纹捕鸟蛛毒素-III及其天然突变体的纯化与鉴定(英文)

虎纹捕鸟蛛毒素 III及其天然突变体是从虎纹捕鸟蛛粗毒中分离得到的两个毒素多肽。虎纹捕鸟蛛毒素 III含 33个氨基酸残基 ,其中包含 6个半胱氨酸残基 ;而其天然突变体只比虎纹捕鸟蛛毒素 III少了C端的色氨酸残基。MALDI TOF质谱测得虎纹捕鸟蛛毒素 III及其天然突变体的分子量分别为 385 3.35和 36 6 7.4 0。通过比较其理论分子量和质谱测定的分子量表明两个多肽的 6个半胱氨酸残基分别形成了三对二硫键。虎纹捕鸟蛛毒素 III与从同一种蜘蛛分离得到的凝集素 I具有 70 .5 %的序列相似性。生物学活性实验表明 ,虎纹捕鸟蛛毒素 III具有使美洲蜚蠊可逆的致瘫作用 ,其半有效剂量 (ED50 )为 (1 92 .95±1 2 0 .84 ) μg/g (P =0 .95 ) ,而且能加强由电刺激引起的大鼠输精管收缩 ;而其天然突变体却不具有上述生物学活性 ,表明C端色氨酸残基为虎纹捕鸟蛛毒素 III生物学活性相关残基 ;同时虎纹捕鸟蛛毒素 III及其天然突变体都不具有类似于凝集素 I对红细胞的凝集活性 ,表明虎纹捕鸟蛛毒素 III和凝集素 I两者氨基酸序列中不同氨基酸残基对于决定两者的生物学活性有着重要的作用     

虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅰ-(HWTX-Ⅰ)28肽类似物的化学合成与活性鉴定

虎纹捕鸟蛛毒素-(huwentoxin-,HWTX-)是从我国虎纹捕鸟蛛毒素中分离纯化得到的一种多肽类神经毒素.该多肽分子由33个氨基酸残基组成,含三对二硫键.其一级结构和三级结构均已测定.弄清该毒素的活性部位,是研究其结构功能关系的基础.用固相Fmoc化学合成的方法,合成了虎纹捕鸟蛛-的28肽类似物.该突变体去掉了天然毒素分子N端的Alal和C端的Lys30-Trp31-Lys32-Leu33共5个残基.用氧化还原型谷胱甘肽法完成二硫键配对,并用HPLC进行纯化,所得突变体与天然HWTX-的紫外光谱相似.质谱鉴定确认合成产物正确,分子量为3124,浓度为1×10-5g/ml的突变体能可逆阻断小白鼠膈神经-膈肌的接头传递,阻断时间为60～70min.与天然毒素比较,活性有所下降.结果说明HWTX-的N端、C端残基对其生物活性有一定影响,但不是位于活性中心的重要残基.由结果推测,虎纹捕鸟蛛毒素-的活性中心位于该分子中连接β-折叠的回环区     

Effects of Arg26 and Lys27 mutation on the bioactivity of HNTX-IV

Hainantoxin-IV (HNTX-IV) was isolated from the Chinese bird spider Ornithoctorcs hainana and identified as a novel antagonist of tetrodotoxin-sensitive (TTX-S) sodium channels. As revealed by the solution structure of HNTX-IV solved by two-dimensional nuclear magnetic resonance (2D-NMR), HNTX-IV adopts an inhibitor cystine knot motif. To check the role of basic residues during HNTX-IV’s interaction with TTX-S sodium channels, R26A and K27A mutants of HNTX-IV were constructed by solid-phase chemical synthesis. The synthesized peptides were purified and refolded under optimized oxidation conditions. Correct synthesis and folding were confirmed by MALDI-TOF mass spectrometry and NMR spectroscopy, respectively. Using the whole-cell patch-clamp technique, Lys27 but not Arg26 was identified as a key residue for HNTX-IV’s bioactivity against TTX-S sodium channels, because R26A-HNTX-IV showed slightly reduced activity and K27A-HNTX-IV showed almost no inhibition. Translated from Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology, 2005, 21(4): 499–503 [译自: 中国生物化学与分子生物学报]     

杂环肽FIK的Fmoc固相合成法研究

为研究二硫键成环的杂环肽FIK的合成工艺, 以Fmoc氨基酸为原料, 采用固相合成法, 经TBTU/HOBT/DIEA复合缩合剂催化合成直链肽, 再经I2氧化肽链上两个半胱氨酸的巯基生成分子内二硫键而得到目标环肽, 将其用切割试剂切割脱离树脂得到粗产品, MALDI-MS和RP-HPLC进行鉴定, 分析和纯化。产率可以达到18%, 纯化后纯度达97%以上, 经MALDI-MS和Ellman试剂检测确定为目标肽。该合成法高效, 简便, 快速, 目标肽收到较理想产率, 适合大批量生产。     

杂环肽FIK的Fmoc固相合成法研究

为研究二硫键成环的杂环肽FIK的合成工艺, 以Fmoc氨基酸为原料, 采用固相合成法, 经TBTU/HOBT/DIEA复合缩合剂催化合成直链肽, 再经I2氧化肽链上两个半胱氨酸的巯基生成分子内二硫键而得到目标环肽, 将其用切割试剂切割脱离树脂得到粗产品, MALDI-MS和RP-HPLC进行鉴定, 分析和纯化。产率可以达到18%, 纯化后纯度达97%以上, 经MALDI-MS和Ellman试剂检测确定为目标肽。该合成法高效, 简便, 快速, 目标肽收到较理想产率, 适合大批量生产。     

海南捕鸟蛛毒素—IV的化学合成与氧化复性

应用芴甲氧羰基 (Fmoc)固相方法化学合成了海南捕鸟蛛毒素 IV ,并通过反相HPLC对不同条件下的氧化复性结果进行监测 ,从而摸索出海南捕鸟蛛毒素 IV的最适氧化复性条件 :0 .1mol/LTris HCl和 0 .1mol/LNaCl缓冲液、pH 8.0、样品浓度为 0 .1g/L、5mmol/LGSH、0 .5mmol/LGSSG。复性产物经质谱测定为 3988.70 ;而与天然毒素混合进行HPLC分析时也得到了单一峰 ;膈神经 膈肌标本测活实验表明 ,合成毒素具有与天然毒素相同的生物学活性 ,从而可推断两者在结构和功能上具有一致性。     

New Allyl Ester Linker and Solid-phase Block Synthesis of the Serglycin Core Region

The prototype glycopeptidyl fragments of serglycin, a proteoglycan with the characteristic peptide sequence of repeating L-seryl-L-glycine, were synthesized by a convergent method involving block condensation on a solid support. In order to facilitate detachment of the protected glycopeptides from the resin, a new allyl ester type of linker, which is cleavable by Pd(0)-catalysis, was designed and used in combination with the commercial acid-labile Sieber amide resin for the solid-phase synthesis. Glycopeptide blocks consisting of [O-(2,3,4-tri-O-acetyl-D-xylosyl)-L-seryl-L-glycine]n (n=1-8) were produced in good yields. Block condensation in a solution was also successful to synthesize up to the hexadecapeptide (n=8).     

一种多肽固相合成方法与纯化策略研究

目的：多肽与小分子化学药物相比,具有生物活性高、特异性强、不容易产生耐药性等特点,是目前新型药物研发的重点领域。多肽的合成直接影响到多肽药物的作用机制以及药物效果,因此需要建立一种更加便捷、高效的多肽合成方法。方法：采用Fmoc固相合成法合成多肽HF01,通过比较氨基酸连接的反应体系以及氨基酸脱保护的反应体系,从中确定最优体系。利用乙酰化基团进行肽链末端保护,经肽链剪切制备干燥的粗肽,最后采用高效液相色谱仪与高分辨质谱仪联用对粗肽进行纯化。结果：确定多肽合成的连接和脱保护反应体系,并获得纯度高达98.3%的线性多肽。结论：建立了一种高效、便捷的多肽合成及纯化方法,提高了实验室合成多肽的效率,为多肽类药物的研发提供技术支撑。     

虎纹捕鸟蛛毒素-I单残基突变体R20A-HWTX-I的化学合成与性质分析

虎纹捕鸟蛛毒素－１（Ｈｕｗｅｔｏｘｉｎ－１,ＨＷＴＸ－１）是从虎纹捕乌蛛（Ｓｅｌｅｎｏｃｏｓｍｉａ ｈｕｗｅｎａ）的粗只同的一种多肽类神经毒素。为了探明该毒素分子中统一的Ａｒｇ残基与其生物学活性的关系,运用固相多肽合成技术和Ｆｍｏｃ化学直接构建了Ａｌａ取代ＨＷＴＸ－１第２０位Ａｒｇ（Ｒ２０）的突变体Ｒ２０Ａ－ＨＷＴＸ－１;将合成的突一置于含谷胱甘肽的缓冲体系中氧化复性后用反相和特殊设计的离子交换Ｈ     

Biological and conformational studies on analogues of a synthetic peptide enhancing HIV-1 infection

We have previously demonstrated that a 23-amino acid peptide derived from the V3 loop of the surface glycoprotein of the HIV-1 strain MN is able to bind CD4 and to enhance HIV-1 infection. Further studies have suggested that the peptide/CD4 interaction induces an increase in both CD4 expression and CD4/gp120 binding affinity. This paper describes the biological and physico-chemical characterization of three analogues of reduced sequence that have been designed in order to identify the minimum active sequence of this peptide corresponding to the MN-HIV-1 principal neutralizing domain. Biological studies indicate that the entire sequence is required for biological activity and that the sequence 1–18 presents an inhibitory activity. CD and FT-IR absorption data are discussed here in order to identify possible structure-function correlations. © 1998 European Peptide Society and John Wiley & Sons, Ltd.     

Phenotypic and Genetic Characterization of Two New Mutants of Heterorhabditis bacteriophora

Two new "dumpy" mutants (Hbdpy-2 and Hbdpy-3) of Heterorhabditis bacteriophora were induced and characterized. Mutants (hermaphrodites and males) that hatched from eggs were shorter and wider than the wild-type strain. This phenotype was not discernible in young animals until 24 hours after hatching from eggs or in mutants that developed from infective juveniles. Scanning electron microscopy revealed that the tails of the two mutants are much more slender than in the wild-type. In addition, the vulva of Hbdpy-3 nematodes appeared to be sunken; that of Hbdpy-2 animals was protruding, like in the wild-type. Upon self fertilization, individual Hbdpy-3 hermaphrodites produced fewer progeny than the wild-type. Crosses between virgin Hbdpy-2 and Hbdpy-3 hermaphrodites and wild-type males indicated that the two mutations are recessive. Complementation tests indicated that Hbdpy-1, Hbdpy-2, and Hbdpy-3 affect different genes. The ratio (1.03:1) of wild-type to dumpy phenotype among the F₂ progeny of self-fertilizing heterozygotes suggested linkage among the three genes. The genetic map distance was estimated only between Hbdpy-1 and Hbdpy-2 genes, approximately 29 map units.