酿酒酵母二腺苷四磷酸磷酸解酶Ⅰ片段的表达、纯化及晶体培养研究

[目的]为了培养用于X-衍射的酿酒酵母二腺苷四磷酸磷酸解酶Ⅰ的蛋白晶体,为研究该酶的三维结构和功能打下基础;[方法]构建了表达酿酒酵母二腺苷四磷酸磷酸解酶Ⅰ片段(Apaldn16)的表达质粒,用核苷酸序列分析证明了克隆片段的正确性.将重组载体转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3),经.IPTG诱导后,用SDS-PAGE检测了蛋白的表达情况.将粗蛋白用Ni-NTA亲和层析分离,收集组分进一步用Superdex 75分子筛纯化.纯化后的蛋白用SDS-PAGE和质谱检验其纯度和正确性,然后用悬滴气相扩散法进行了蛋白结晶条件的初筛.[结果]成功地用大肠杆菌可溶性地高效表达了Apaldn16蛋白.得到了分子量约为36 kD的单一蛋白条带,纯度在95%以上.质谱结果证明该蛋白纯度高,分子量正确.将纯化后的蛋白用悬滴气相扩散法进行晶体初筛,得到了针状簇晶.此晶体经SDS-PAGE检测,证明为Apaldn16蛋白晶体.[结论]利用大肠杆菌高效表达体系可以正确表达Apalan16蛋白,蛋白经过纯化后,用悬滴气相扩散法可以生长出针状晶体,适合于进一步的三维结构研究.     

米曲霉中蓝藻抗病毒蛋白-N基因的克隆与表达

[目的]提高蓝藻抗病毒蛋白-N(CVN)的异源表达量,获得大量高纯度可溶性蛋白。[方法]采用RT-PCR从酱油发酵酱醪宏基因组中克隆获得CVN基因cvn-SF,构建了重组表达载体p ET32a-cvn-SF,转化E.coli BL21菌株,获得工程菌株,优化表达条件,通过Ni-NTA凝胶亲和层析对CVN-SF蛋白进行纯化。[结果]工程菌株在温度30℃、添加1 mmol/L的IPTG诱导剂、培养时间12 h的条件下获得最高表达量的可溶性蛋白。Ni-NTA凝胶亲和层析纯化得到了230.8 mg/L的CVN蛋白,占提取总蛋白含量的33.37%。[结论]所得CVN蛋白高于目前报道的CVN在大肠杆菌的最高表达量140 mg/L~([11])。     

大肠杆菌UvrB基因的克隆、表达与功能研究

[目的]在大肠杆菌表达系统表达UvrB蛋白,优化其表达和纯化的条件,并初步研究其对抗紫外线伤害的功能。[方法]克隆大肠杆菌MG1655菌株UvrB编码序列,采用酶切连接的方法构建表达载体p Waldo-GFP-UvrB,并转入BL21(DE3)表达菌株诱导蛋白质表达,采用Ni-NTA亲和层析以及分子筛层析的方法纯化蛋白质,采用紫外光刺激的方法研究其细胞内功能。[结果]成功构建UvrB表达载体,获得UvrB在BL21(DE3)中重组菌株,其表达条件为22℃,0. 2 mmol/L IPTG诱导20 h,UvrB以可溶蛋白的形式存在。SDS-PAGE结果显示UvrB蛋白质分子量约76 k Da与预期相符;经纯化后UvrB蛋白质得率约为0. 6 mg/L培养基,纯度> 85%,为其进一步研究奠定了基础。[结论]研究克隆并构建了大肠杆菌UvrB蛋白的原核表达体系,优化了其纯化方案,得到纯度> 85%的可溶UvrB蛋白质,为进一步研究UvrB蛋白质功能奠定了基础。     

黄瓜Cu/Zn-SOD基因克隆及可溶性表达和纯化

[目的]克隆黄瓜Cu/Zn-SOD基因,并利用大肠杆菌进行可溶性表达、纯化及活性测定。[方法]采用Trizol法提取黄瓜表皮的总RNA,然后设计特异性引物,通过RT-PCR技术克隆获得黄瓜Cu/Zn-SOD基因。该基因与p GEX2T载体相连后,转化大肠杆菌BL21(DE3),摸索可溶性表达方法。利用GST亲和层析方法纯化目标蛋白,SOD酶活性测定采用邻苯三酚法。[结果]成功地克隆了全长为459 bp的黄瓜Cu/Zn-SOD基因,编码152个氨基酸。Protein Blast分析表明其结构域中分别包含Cu2+、Zn2+结合位点,为典型的Cu/Zn-SOD酶。目标蛋白可溶性表达条件是16℃、0. 1 mmol/L IPTG诱导20 h。SDS-PAGE分析表明GST亲和层析成功地获得重组黄瓜Cu/Zn-SOD。活性测定表明两次纯化的蛋白样品SOD酶活力分别为2 328. 9 U/m L、2 144. 7 U/m L。[结论]从黄瓜表皮中克隆获得Cu/Zn-SOD基因,该基因在大肠杆菌系统中获得可溶性表达,纯化后的重组蛋白具有较高的SOD酶活力。     

人表皮生长因子融合蛋白的表达及纯化工艺的优化

探讨了在大肠杆菌中生产小分子泛素样修饰蛋白与人表皮生长因子（SUMO-hEGF）的最佳表达及纯化条件。将重组表达载体pET3c-SUMO-hEGF转化到大肠杆菌BL21(AI)中,以阿拉伯糖为诱导剂,对诱导表达参数进行优化,并进一步通过离子交换层析,Ni-NTA亲和层析及分子筛层析等进行纯化分析。结果表明： SUMO-hEGF在BL21(AI)中的最佳诱导表达温度为37℃,诱导剂阿拉伯糖的最佳浓度为5.0g/L,最佳诱导表达时间为4h,表达量约为20.2%,Western blot 分析证实,纯化后的蛋白是hEGF,为进一步开发hEGF基因工程药物奠定了基础。     

重组MBP-SUV39H1在大肠杆菌中表达与纯化

[目的]在大肠杆菌中获得具有甲基转移酶活性的重组MBP-SUV39H1蛋白。[方法]通过在大肠杆菌中同时表达异染色质蛋白1(HP1)与重组MBP-SUV39H1蛋白的方法,实现了MBP-SUV39H1的表达,采用his亲和纯化与分子筛Superdex200(SD200)两步分离纯化方案,并利用质谱和ELISA检测MBP-SUV39H1的甲基转移酶活性。[结果]利用大肠杆菌成功表达了MBP-SUV39H1融合蛋白,经纯化后目的条带单一,并具有良好的甲基转移酶活性。[结论]纯化的具有甲基转移酶活性的MBP-SUV39H1可用于抑制剂筛选等后续研究。     

重组肺炎链球菌甘油脱氢酶活性及晶体培养的初步分析

甘油脱氢酶能够氧化胞内甘油为代谢活动提供能量,并参与调控与宿主粘附相关细菌蛋白质的表达,是潜在的抗菌药物靶点. 本文利用大肠杆菌BL21原核表达肺炎链球菌甘油脱氢酶,获得大量上清表达的目的蛋白. 再用Ni-NAT亲和层析、DEAE离子交换层析以及Superdex 200分子筛进行纯化. 经数据拟合,证实该酶在溶液中以同源二聚体形式存在. 光谱实验证实该重组表达甘油脱氢酶仍具有氧化甘油生成1, 3-二羟基丙酮的活性. 用Hampton试剂盒初筛晶体及棋盘法优化晶体,在0.1 mol/L Bicine PH 9.6,13% PEG MME 5000,0.2 mol/L KSCN,4% Dioxone条件下,得到了晶型好且有一定衍射能力的单晶,为解析肺炎链球菌甘油脱氢酶的三维结构及研究结构与酶活之间的关系奠定了基础.     

人类肠道病毒68型3A蛋白可溶区的表达及其结构初步研究

为了解人类肠道病毒68型3A蛋白可溶区的结构,本研究构建了EV-D68 3A蛋白可溶区的原核表达载体,在大肠杆菌中表达、纯化并对其结构进行了初步研究。首先,采用PCR的方法扩增EV-D68 3A(1~61)基因片段,克隆至原核表达载体pET-28a-His-SUMO中,转化进入BL21(DE3)感受态细胞,诱导表达出His-SUMO-3A(1~61)融合蛋白。经Ni-NTA树脂亲和层析初步纯化后得到大量融合蛋白,利用ULP酶酶切去除His-SUMO标签,通过Ni-NTA树脂亲和层析、阴离子交换层析柱、分子筛层析等方法分离标签并进一步纯化目的蛋白。最后通过化学交联反应检测目的蛋白的多聚化状态。结果显示,利用pET28a-His-SUMO-3A(1~61)原核表达载体能够在大肠杆菌中成功表达出大量可溶性的融合蛋白;经过多步纯化方法得到了大量高纯度的目的蛋白,平均每升大肠杆菌可得到约5mg目的蛋白,纯度达95%以上;通过化学交联反应证明了该蛋白的多聚化存在形式。本研究成功建立了EV-D68 3A蛋白可溶区的表达和纯化系统,为进一步获得3A蛋白晶体、研究3A蛋白功能以及设计以3A为靶点的抗病毒药物奠定了基础。     

布氏锥虫自噬蛋白ATG12的表达、纯化及二级结构预测

[目的]表达纯化布氏锥虫自噬蛋白TbATG12,并对其二级结构进行预测。[方法]克隆TbATG12编码序列,采用酶切连接方法构建表达载体TbATG12(pET-28a),转化进入BL21(DE3)表达菌株诱导蛋白表达,利用Ni^(2+)-NAT亲和层析及分子筛层析方法纯化蛋白。采用核磁手段,采集一维和二维谱图,利用JPred 4预测其二级结构。[结果]16℃、0.5 mmol/L IPTG诱导20 h,TbATG12以可溶蛋白形式存在。纯化后蛋白纯度可达95%。TbATG12谱峰分布均匀,强度较强,二级结构预测其含有3个α-螺旋和5个β-折叠,为后续解析TbATG12溶液结构提供指导。[结论]克隆、表达纯化得到纯度>95%可溶TbATG12蛋白,二级结构预测和比对发现其结构在进化上很保守。     

重组芋螺毒素His-Xa-MrVIB分泌表达研究

[目的]利用简单快速的基因工程法来生产富含二硫键的芋螺毒素Mr VIB,寻找有效合成具有天然活性芋螺毒素的新途径。[方法]人工设计合成芋螺毒素Mr VIB基因引物来构建表达载体p ET22b(+)/His-Xa-Mr VIB,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)plys S进行诱导表达。再利用Ni-NTA琼脂糖柱进行亲和层析纯化重组蛋白,Tricine-SDS-PAGE电泳分析重组蛋白表达形式。[结果]重组芋螺毒素His-Xa-Mr VIB(r His-Xa-Mr VIB)在大肠杆菌中获得有效分泌表达,经一步亲和层析获得纯度大于90%的重组芋螺毒素。[结论]基因工程方法能够有效分泌表达芋螺毒素Mr VIB,解决化学合成芋螺毒素产量低、成本高、难以纯化等问题。     

拟南芥VSP1硒代蛋白衍生物的制备和晶体生长

拟南芥VSPl蛋白是一种具有酸性磷酸酶活性的植物防御蛋白。为利用硒原子的反常散射获取VSPl蛋白晶体X射线衍射的相位信息,以质粒pET-22b为表达载体,大肠杆菌B834（DE3）为宿主茵,在含有硒代甲硫氨酸的M9培养基中诱导表达VSPl硒代蛋白衍生物。通过Ni-NTA亲和层析纯化的目的蛋白经SDS-PAGE检验,纯度在95％以上。通过优化VSPl母体蛋白晶体的生长条件,获得了可衍射的硒代蛋白晶体。     

缓激肽生物合成及其对心肌细胞缺氧复氧保护作用

[目的]获得有活性的缓激肽药物,探讨缓激肽在心肌细胞缺氧复氧过程中的保护作用。[方法]利用PCR方法构建p Waldo-BK质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株,优化诱导剂IPTG浓度和表达温度;利用镍柱亲和层析和分子筛纯化缓激肽融合蛋白质,利用GFP荧光In-gel检测蛋白质的表达情况;构建心肌细胞缺氧复氧模型,检测缓激肽对细胞的保护作用。[结果]成功构建p Waldo-BK表达载体,0. 2 mmol/L IPTG于25℃诱导培养20 h,能够获得高表达的目标蛋白质; In-gel荧光检测证实,融合蛋白GFP能够发出绿色荧光;心肌细胞缺氧复氧模型证实缓激肽能够有效保护心肌细胞。[结论]0. 2 mmol/L IPTG、25℃诱导表达20 h,得到散发绿色荧光的融合蛋白,每1L BL21(DE3)细胞培养基能够获得缓激肽约0. 55 mg,且最终获得的缓激肽能够有效保护心肌细胞对抗缺氧复氧刺激。     

炭疽芽胞杆菌A16R株FtsE蛋白的可溶性表达和纯化

目的:构建炭疽芽胞杆菌FtsE蛋白的原核表达载体,实现其在原核表达系统中的可溶性表达,并纯化融合蛋白。方法:用PCR方法从炭疽芽胞杆菌A16R株扩增得到ftsE基因片段,酶切后连接到pET28a原核表达载体,构建重组表达质粒pET28a-ftsE,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,筛选可溶性诱导表达与纯化融合蛋白的条件,以获得高纯度融合蛋白。结果:构建了FtsE蛋白的融合表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达;在20℃下,经0.1 mmol/L IPTG诱导3 h表达的产物主要是可溶性蛋白,经Ni-NTA亲和层析纯化获得了高纯度的FtsE融合蛋白,经Western印迹检测,目的蛋白表达正确。结论:实现了炭疽芽胞杆菌FtsE蛋白原核表达系统的可溶性表达并获得了高纯度融合蛋白,为后续研究奠定了基础。     

融合表达载体pET32a/Trx-EK-MrVIB的构建及在大肠杆菌中表达

人工设计合成芋螺毒素基因Mr VIB来构建表达载体p ET32a/Trx-EK-Mr VIB,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)plys S进行诱导表达。菌体经超声破碎后利用Ni-NTA琼脂糖柱进行亲和层析纯化融合蛋白,SDS-PAGE电泳分析融合蛋白表达。结果表明融合表达载体p ET32a/Trx-EK-Mr VIB经PCR扩增和测序鉴定具有正确的开放阅读框。SDS-PAGE电泳显示融合蛋白在大肠杆菌中获得高效可溶性表达,经一步亲和层析获得纯度大于90%的融合芋螺毒素达73.6 mg/L。本文成功构建了融合表达载体p ET32a/Trx-EK-Mr VIB,融合芋螺毒素Trx-EK-Mr VIB在大肠杆菌中获得高效可溶性表达。     

猪丹毒丝菌SpaA蛋白的表达与纯化

[目的]在大肠杆菌中表达猪丹毒丝菌spaA基因并纯化重组蛋白。[方法]利用PCR扩增猪丹毒丝菌临床分离株spaA基因,构建重组质粒p GEX-4T-1-spaA,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达融合蛋白GST-SpaA,并优化表达条件。最后采用GST琼脂糖纯化树脂纯化,SDS-PAGE和Western Blotting检测。[结果]成功扩增spaA基因,获得重组表达菌株BL21(DE3)/p GEX-4T-1-spaA;在菌体OD₆₀₀为0. 9时,加入IPTG至终浓度0. 1 mmol/L,34℃诱导6 h的条件下表达效果最好。经SDS-PAGE检测和纯化后得到大小为97 kDa的GST-SpaA; Western Blotting检测结果表明,GST-SpaA具有良好的免疫原性。[结论]成功在大肠杆菌中表达了SpaA蛋白,经纯化得到具有免疫原性的重组蛋白,为后续研制猪丹毒丝菌SpaA蛋白亚单位疫苗奠定基础。     

转录因子LRF蛋白POZ结构域的表达与纯化

[目的]旨在原核表达转录因子LRF的POZ结构域,纯化获得GST-POZ融合蛋白。[方法]以SD大鼠海马组织c DNA为模板,利用PCR扩增带有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的LRF基因的POZ结构域,并将其插入到原核表达载体p GEX-4T-1中,将构建成功的p GEX-4T-1-POZ原核表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导融合蛋白表达,再利用MagneGST particles亲和纯化GST-POZ融合蛋白,最后通过Western Blot鉴定融合蛋白。[结果]p GEX-4T-1-POZ原核表达质粒构建成功;在37℃条件下,浓度为0. 2 mmol/L的IPTG诱导7 h能够使重组蛋白大量表达,经MagneGST particles纯化后的GST-POZ重组蛋白能够被识别LRF的抗体特异性识别。[结论]纯化后的GST–POZ重组蛋白能够用于后续的生物学研究。     

人Fas N端融合蛋白的原核表达、纯化及初步分析

目的：对Fas蛋白N端的30～108位肽段进行原核表达,制备可溶性蛋白,并完成二级结构分析。方法：利用BLAST程序进行同源性分析,确定所要构建的FasN端半胱氨酸富集结构域（CRD）,PCR扩增目的基因片段,将其克隆入表达载体pGEX-6P-1,并转化大肠杆菌BL21（DE3）,于16℃用0.2mmol/L的IPTG诱导25h表达GST-Fas融合蛋白;用Glu-tathione Sepharose 4B柱分离GST-Fas融合蛋白,用PreScission蛋白酶切去GST标签,将洗脱的蛋白样品经Superdex 75凝胶预装柱进一步纯化;对所获得的可溶性、高纯度蛋白进行圆二色谱分析。结果与结论：获得重组质粒pGEX-6P-1-fas,并在大肠杆菌中可溶性表达了FasN端CRD功能结构域蛋白;经亲和层析、酶切、分子筛层析后,获得了可溶的、高纯度的FasN端CRD功能结构域蛋白;圆二色谱结果揭示目标蛋白富含β-折叠,为进一步研究Fas的结构和功能奠定了基础。     

藻红蛋白的高效异源生物合成及其生物活性

[目的]实现藻红蛋白在大肠杆菌中的高效生物合成。[方法]将藻红蛋白生物合成的多个基因构建到单一表达质粒上,质粒转化大肠杆菌后获得表达菌株,优化诱导物、诱导温度和诱导时长等发酵条件,利用亲和层析法分离纯化重组藻红蛋白,分析重组蛋白的光谱学性质与抗氧化活性。[结果]获得了高效生物合成藻红蛋白的大肠杆菌菌株,以乳糖为诱导物时最佳诱导条件为:2.0 g/L的乳糖、25℃下诱导28 h,藻红蛋白表达量达211.6 mg/L;以IPTG为诱导物时最佳诱导条件为:0.4 mmol/L的IPTG,在25℃条件下诱导28 h,藻红蛋白表达量达188.7 mg/L。藻红蛋白色基结合率达92.0%,OD555/OD280为8.0。[结论]成功实现了藻红蛋白在大肠杆菌中的高效生物合成,重组藻红蛋白具有羟基自由基的清除活性。     

线粒体自噬受体Bnip3的载体构建及蛋白表达纯化

[目的]获得可用于蛋白晶体筛选的高纯度Bnip3蛋白。[方法]将Bnip3截断基因构建到原核表达载体上并转化大肠杆菌。IPTG诱导表达后通过GST柱纯化目标蛋白。TEV酶切除GST标签后采用凝胶过滤层析纯化Bnip3蛋白。[结果]Bnip3截断基因重组体成功构建并诱导表达目标蛋白。通过GST亲和层析得到可溶性的携带GST标签的Bnip3(1~111)和Bnip3(1~152)蛋白。切除GST标签的Bnip3(1~152)通过凝胶过滤层析得到构象均一的二聚体蛋白。[结论]采用原核表达、亲和层析和凝胶过滤层析可获得构象均一的高纯度二聚体Bnip3蛋白。     

抗菌肽Cec4a的重组表达和抗菌活性研究*

目的:构建Cec4a的原核重组表达体系,通过诱导表达、酶切纯化获得重组蛋白,并检测产物的抗菌活性。方法:基于Cec4a的序列设计引物,克隆Cec4a基因的DNA片段。利用原核表达载体(pCold-SUMO)构建重组原核表达质粒,并将其转化到大肠杆菌C41(DE3)等感受态细胞,使用IPTG进行诱导表达。通过Ni-NTA亲和层析柱纯化,获得含有His-SUMO标签的重组Cec4a融合蛋白。在SUMO蛋白酶酶切后,再次使用Ni-NTA亲和层析纯化,得到目的蛋白,最后用鲍曼不动杆菌(ATCC19606)作为指示菌检测表达产物的抗菌活性。结果:成功构建pCold-SUMO-Cec4a原核表达质粒,测序分析其序列与预期结果一致。Cec4a融合蛋白表达量为42.8mg/L,纯化后的Cec4a重组蛋白对鲍曼不动杆菌的MIC为4 μg/mL。结论:通过原核表达,并经Ni-NTA亲和层析纯化,获得了具有抗菌活性的重组蛋白Cec4a,为研究Cec4a的生物活性、抗菌机制及应用奠定了基础。