大肠杆菌异源合成甲羟戊酸的适配性优化

[目的]对甲羟戊酸在大肠杆菌中的生物合成进行适配性优化。[方法]将来源于粪肠球菌的甲羟戊酸合成途径基因mvaE和mvaS引入大肠杆菌中,构建大肠杆菌甲羟戊酸合成体系。继而通过比较不同的表达系统和不同的RBS序列探究甲羟戊酸合成的最佳条件。接下来,考虑到乙酰辅酶A是连接大肠杆菌细胞代谢途径和外源甲羟戊酸合成途径的桥梁,通过加强乙酰CoA的代谢通量来继续提高甲羟戊酸的产量。[结果]采用pTrc99A载体,8 000 au的RBS强度下,大肠杆菌甲羟戊酸合成体系的效率最高,产量达到20.5 mmol/L;通过加强乙酰CoA的代谢通量,甲羟戊酸的产量继续提高到26 mmol/L。[结论]获得一株高产甲羟戊酸的大肠杆菌菌株,该菌株可用于合成甲羟戊酸,也可作为一平台菌株用于其他萜类化合物的生物合成。     

提高大肠杆菌通过MVA途径合成异戊二烯

异戊二烯是橡胶合成的重要前体物质。为了提高菌株的异戊二烯产量,本实验室在研究中构建了一株异戊二烯产气的菌株BW-01,基于蛋白质预算理论的指导,理性设计通过改变质粒拷贝数、增加稀有密码子等合成生物学手段调控关键限速酶编码基因表达,从而提高大肠杆菌外源MVA代谢途径的异戊二烯产量。摇瓶发酵实验中我们构建的新产气菌株BW-07比原有的产气菌株BW-01的产量提高了73%,达到了761.1 mg/L。为后续菌株改造及进行发酵罐实验奠定了基础。     

产大米蛋白水解酶的菌株筛选、酶学性质及制备大米寡肽

[目的]旨在分离、筛选并鉴定具有大米蛋白降解作用的菌株及其关键蛋白酶,为高效制备大米寡肽提供制备酶及最优制备条件.[方法]以"水解圈"为评价指标,从粮食仓库附近土壤筛选获得具有降解大米蛋白能力的菌株;通过16S rRNA序列分析确定菌株归属;利用单因素实验获得最佳氮源并初步分析酶学性质;利用HPLC检测寡肽得率,并对制...     

C端结构域截短提高苏云金芽孢杆菌来源几丁质酶的活力

[目的]尝试利用蛋白质结构域工程的手段优化苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis BMB 171)来源的几丁质酶BtChiA的酶活力,并对水解胶体几丁质的产物进行定性和定量分析.[方法]根据BtChiA的序列分析其结构域的组成,构建BtChiA及部分结构域缺失的突变体蛋白在大肠杆菌中的表达菌株并进...     

黑曲霉纤维二糖水解酶基因cbhA在毕赤酵母中异源表达

[目的]对黑曲霉纤维二糖水解酶cbhA基因进行了克隆和在毕赤酵母中的真核表达。[方法]采用PCR方法扩增黑曲霉纤维二糖水解酶A(Cellobiohydrolase A,CBHA)基因,获得的DNA序列与cbhA基因表现出高度相似,推导出的氨基酸序列与真菌CBHA酶也高度相似,属于糖基水解酶第7家族。将扩增得到的cbhA基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K上,与α-因子信号肽序列形成融合蛋白,进一步通过电转化方法将线性化质粒p PIC9K-cbhA转化至毕赤酵母GS115菌株进行表达。[结果]在甲醇诱导下,重组菌株CMC比酶活力是对照的2.5倍,SDS-PAGE分析结果也确认了cbhA基因在重组菌株GS115/p PIC9K-cbhA中的表达。对该酶性质的分析表明,重组CBHA酶水解CMC底物最适p H值为5.0,最适温度为55℃。[结论]黑曲霉纤维二糖水解酶基因cbhA的克隆和其真核表达工程菌株的构建,为获得纤维二糖水解酶A高产菌株,实现纤维素酶多组分的人工组装奠定了基础。     

理性代谢工程改造促进谷氨酸棒杆菌高效合成L-谷氨酸

L-谷氨酸是世界上第一大宗氨基酸产品,广泛应用于食品医药及化工等行业。以谷氨酸高产菌谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) G01为出发菌株,首先通过敲除主要副产物丙氨酸合成相关基因-丙氨酸氨基转移酶编码基因(alaT),降低了发酵副产物丙氨酸含量。其次,α-酮戊二酸节点碳流量对谷氨酸合成起重要作用,因此,采用核糖体结合位点(ribosome-binding site,RBS)序列优化降低了α-酮戊二酸脱氢酶的活性,强化了谷氨酸合成代谢流。同时通过筛选不同来源的谷氨酸脱氢酶,加强了α-酮戊二酸内源转化为谷氨酸的能力。接着,对谷氨酸转运蛋白进行理性设计,提高了谷氨酸的外排能力。最后,对基于以上策略构建的整合菌株进行了5 L发酵罐发酵优化,通过梯度升温结合分批补料策略,谷氨酸产量为(136.33±4.68) g/L,较原始菌的产量(96.53±2.32) g/L提高了41.2%;糖酸转化率为55.8%,较原始菌的44.2%提高了11.6%;且降低了副产物丙氨酸的含量。以上策略一定程度上提高了谷氨酸的产量与糖酸转化率,可为谷氨酸生产菌株的代谢改造提供参考。     

通过番茄红素环化酶的优化构建β-胡萝卜素高产菌株

目标产物的合成途径往往需要对关键酶的来源、表达水平等因素进行系统性优化才能实现代谢通量的最大化。β-胡萝卜素是一类具有重要应用价值的萜类化合物,其中番茄红素环化酶(Lycopene cyclase,CrtY)是β-胡萝卜素合成途径中的关键酶,能够催化FAD依赖的环化反应将番茄红素转化合成β-胡萝卜素。本研究通过对CrtY的系统优化提高β-胡萝卜素的合成水平,并确定CrtY的表达对代谢通路的影响。在大肠杆菌中以番茄红素合成模块为基础,通过引入番茄红素环化酶基因crt Y构建了β-胡萝卜素合成模块。并进一步利用寡聚接头介导的DNA组装方法 (Oligo-linker mediated assembly method,OLMA)引入一系列不同强度的人工设计的核糖体结合位点(Ribosome-binding site,RBS),对CrtY的表达强度、基因来源等因素进行高通量的优化。通过OLMA文库构建和平板筛选,获得了5株高产β-胡萝卜素的工程菌株。在摇瓶中,5株工程菌株的β-胡萝卜素产量可达15.79-18.90 mg/g DCW(Dry cell weight),比优化前提高了65%。进一步选取了其中的CP12菌株,在5 L发酵罐上,利用高密度培养技术验证工程菌株合成β-胡萝卜素的能力。最终β-胡萝卜素产量可达1.9 g/L。RBS强度分析及代谢中间体分析表明,适当地降低CrtY表达强度能够有利于β-胡萝卜素模块相关基因之间协同发挥作用。以上结果为β-胡萝卜素合成途径的优化规律提供了理论指导。     

谷氨酸棒杆菌代谢工程高效生产L-缬氨酸北大核心CSCD

L-缬氨酸作为一种支链氨基酸,广泛应用于医药和饲料等领域。本研究借助多种代谢工程策略相结合的方法,构建了生产L-缬氨酸的微生物细胞工厂,实现了L-缬氨酸的高效生产。首先,通过增强糖酵解途径、减弱副产物代谢途径相结合的方式,强化了L-缬氨酸合成前体丙酮酸的供给;其次,针对L-缬氨酸合成路径关键酶—乙酰羟酸合酶进行定点突变,提高了菌株的抗反馈抑制能力,并利用启动子工程策略,优化了路径关键酶的基因表达水平;最后,利用辅因子工程策略,改变了乙酰羟酸还原异构酶和支链氨基酸转氨酶的辅因子偏好性,由偏好NADPH转变为偏好NADH,从而提高了L-缬氨酸的合成能力。在5L发酵罐中,最优谷氨酸棒杆菌工程菌株Corynebacterium glutamicum K020的L-缬氨酸产量、得率和生产强度分别达到了110g/L、0.51g/g和2.29 g/(L·h)。     

栀子类胡萝卜素剪切双加氧酶基因GjCCD4的克隆与原核表达

[目的]类胡萝卜素剪切双加氧酶(Carotenoid cleavage oxygenase,CCD)是西红花总苷生物合成途径的关键酶,本研究拟从栀子果实中克隆CCD基因。[方法]在NCBI数据库中搜索CCD蛋白,获得种子序列后,构建系统进化树,按照亲缘关系分组。再利用CODEHOP法,针对每个组设计简并引物,在栀子果皮和果肉c DNA中扩增,获得保守区段。然后通过RACE获得基因全长。构建pet28a原核表达载体,转化BL21(DE3)菌株后在30℃培养4 h,转化菌株Aritic Expression(DE3)后在15℃培养过夜,诱导蛋白表达。[结果]克隆了一个GjCCD4基因,长1 863 bp,编码的蛋白质N端序列变动较大,C端保守性强,N-末端含有一个叶绿体定位的信号肽。系统发育分析表明,GjCCD4蛋白与拟南芥和西红花的同源蛋白聚在同一个簇。在BL21(DE3)和AE(DE3)菌株的沉淀中表达出大量包涵体形式的融合蛋白,在BL21(DE3)菌株的上清中表达出少量可溶蛋白。[结论]获得了一个类胡萝卜素剪切双加氧酶基因GjCCD4,通过原核表达获得了少量可溶蛋白。     

米曲霉中蓝藻抗病毒蛋白-N基因的克隆与表达

[目的]提高蓝藻抗病毒蛋白-N(CVN)的异源表达量,获得大量高纯度可溶性蛋白。[方法]采用RT-PCR从酱油发酵酱醪宏基因组中克隆获得CVN基因cvn-SF,构建了重组表达载体p ET32a-cvn-SF,转化E.coli BL21菌株,获得工程菌株,优化表达条件,通过Ni-NTA凝胶亲和层析对CVN-SF蛋白进行纯化。[结果]工程菌株在温度30℃、添加1 mmol/L的IPTG诱导剂、培养时间12 h的条件下获得最高表达量的可溶性蛋白。Ni-NTA凝胶亲和层析纯化得到了230.8 mg/L的CVN蛋白,占提取总蛋白含量的33.37%。[结论]所得CVN蛋白高于目前报道的CVN在大肠杆菌的最高表达量140 mg/L~([11])。     

一株产右旋糖酐酶青霉的分离及酶的纯化和性质

[目的]从土壤中筛选到一株新的产右旋糖酐酶的真菌F1001,为酶法制备药用级右旋糖酐提供新的右旋糖酐酶产生菌株.[方法]通过形态特征和ITS rDNA序列分析方法鉴定菌株.利用硫酸铵盐析、Sepharose 6B凝胶柱纯化,得到纯度较高的酶蛋白.以右旋糖酐70 kDa为底物,对右旋糖酐酶酶学性质及催化机理进行研究.[结...     

构建酿酒酵母细胞工厂高效合成摩尔酸

[目的] 摩尔酸作为齐墩果烷型三萜化合物具有抗HIV、抗炎等多种生物学活性,其前体物质是计曼尼醇,本研究基于合成生物学策略构建酿酒酵母细胞工厂高效合成摩尔酸。[方法] 运用CRISPR/Cas9技术,首先分别整合不同来源的氧化鲨烯环化酶（OSCs）,筛选高产计曼尼醇底盘细胞;进一步异源表达长春花来源的细胞色素P450氧化酶（CYP716AL1）和麻风树来源的细胞色素P450还原酶（JcCPR）,构建摩尔酸生物合成途径;并通过CYP716AL1和不同来源的CPR适配研究以及过表达甲羟戊酸（MVA）代谢途径中关键酶的方式提高摩尔酸的产量。[结果] 整合苹果来源的氧化鲨烯环化酶MdOSC获得的重组菌株计曼尼醇产量最高,达68.3 mg/L;以此为底盘细胞进一步整合CYP716AL1和JcCPR实现了摩尔酸的生物合成,产量为15.0 mg/L;共表达CYP716AL1和拟南芥来源的CPR获得的重组菌株摩尔酸产量最高,达到24.3 mg/L;最后过表达MVA代谢途径中的关键酶法呢基焦磷酸合酶（ERG20）和鲨烯环氧酶（ERG1）,获得的重组菌株摩尔酸产量高达34.1 mg/L。[结论] 本研究实现了摩尔酸的高效生物合成,为构建高产齐墩果烷型三萜酿酒酵母细胞工厂提供了理论和技术依据。     

RBS文库调控重组大肠杆菌β-胡萝卜素合成途径关键基因提高β-胡萝卜素合成能力

β-胡萝卜素属于类胡萝卜素家族的一员,在药品、保健品、化妆品和食品行业有广泛的应用。本研究通过用RBS文库对重组大肠杆菌CAR005中β-胡萝卜素合成途径的关键基因dxs、idi和crt操纵子进行调控来提高β-胡萝卜素合成能力。研究发现3个基因分别用RBS文库调控后,与起始菌株相比β-胡萝卜素产量最高分别有7%、11%和17%的提高,表明使用RBS文库调控比使用多个固定强度启动子调控能筛选到更有利于目标产品合成的基因表达强度。三基因组合调控后,β-胡萝卜素产量相对于CAR005菌株提高了35%。同时发现,单基因文库筛选到的最优强度对于组合调控来说,未必是最优强度。本研究为利用基因表达调控优化目标产物合成途径提供了一种新的方案。     

产异戊二烯重组大肠杆菌发酵培养基的系列优化

目的:以重组大肠杆菌YJM23为试材菌株,进行培养基优化提高异戊二烯产量。方法:利用Design expert软件中Placket-Burman设计法对影响供试菌株生产异戊二烯的8个因素进行了筛选;用最陡爬坡实验及基于中心组合设计的响应面分析法对三因素最佳水平及交互作用进行了研究。结果:确定了牛肉膏(P,0.0313)、微量元素混合液(P,0.0360)和K2HPO4.3H2O(P,0.0340)为影响摇瓶生产异戊二烯的主要因素;并确定这三种成分的最佳使用浓度:牛肉膏7.7 g/L,微量元素混合液0.1 ml/L,K2HPO4.3H2O 10.09 g/L,该三种成分的两两交互作用不显著。结论:优化条件下异戊二烯产量从140.16 mg/L提升至935.02 mg/L,提高6.67倍。     

引入新型异戊二烯醇利用途径促进解脂耶氏酵母中β-胡萝卜素的合成*

目的:微生物体内异戊二烯类化合物的前体物异戊烯焦磷酸酯的天然合成路径受到严格的代谢调控,因此限制了异戊二烯类化合物的高效生物合成,而新型异戊二烯醇利用途径独立于生物体内源性代谢路径,通过在微生物中引入IUP能够进行异戊烯焦磷酸酯的大量合成,从而促进异戊二烯类化合物的大量合成。方法:在油脂酵母解脂耶氏酵母中引入IUP,强化异戊烯焦磷酸酯生物合成,促进β-胡萝卜素的高效积累。结果:通过生物信息学的方法预测IUP中两个关键蛋白酿酒酵母来源的胆碱激酶ScCK和拟南芥来源的异戊烯磷酸激酶AtIPK,均为酸性亲水性蛋白,无跨膜区和信号肽,二者都具有疏松不稳定的结构特征,显著富集于磷酸类物质的合成通路中。在解脂耶氏酵母中利用同源重组技术引入外源β-胡萝卜素合成关键基因carRP和carB,强化甲羟戊酸途径的关键基因thmgR和ggs1,使工程菌株中积累2.68 mg/L β-胡萝卜素。通过Cre-loxP系统回收基因组上的ura标签,再将IUP进一步整合到工程菌株染色体上。当培养基中含有20 mM异戊二烯醇作为底物、碳氮比为4/3且发酵96 h后,重组解脂耶氏酵母中β-胡萝卜素的产量提高到410.2 mg/L,较原始工程菌的产量提高了近200倍。结论:IUP能够促进解脂耶氏酵母中β-胡萝卜素的高效积累,为利用IUP开展β-胡萝卜素和其他异戊二烯类化合物的高效生物合成提供新思路。     

真菌细胞色素P450在大肠杆菌中的表达

【背景】真菌细胞色素P450蛋白在大肠杆菌中表达水平低甚至不表达,近期研究发现通过对该类蛋白氨基端(N端)氨基酸序列的修饰可优化其表达水平。【目的】在大肠杆菌系统中表达预测功能为P450酶的焦曲霉094102菌株的Au8002蛋白,为真菌P450蛋白在大肠杆菌表达系统中的N端氨基酸序列修饰策略提供有效依据。【方法】对野生型P450蛋白Au8002的氨基酸序列进行分析,对其N端序列进行了3种序列修饰,并在诱导蛋白表达时添加P450生物合成前体5-氨基乙酰丙酸(5-ALA),研究N端氨基酸序列修饰策略及前体添加对真菌P450在大肠杆菌中蛋白表达的影响。【结果】SDS-PAGE和Westernblot检测结果显示,对目的蛋白进行的3种氨基酸序列修饰均使Au8002蛋白获得了表达,前体5-ALA的添加提高了目的蛋白表达量。其中对目的蛋白进行N端全长截短时可部分增加其可溶性,同时也验证了其特征性的CO结合能力。【结论】对预测为P450酶的菌株094102蛋白Au8002氨基端(N端)氨基酸序列的修饰有效解决了其在大肠杆菌内不表达的难题,实现了其可溶性表达;另一方面P450生物合成前体5-ALA的添加也能有效提高该类蛋白的表达水平,上述策略对改善其它该类蛋白在大肠杆菌内的表达水平具有借鉴意义。     

法夫酵母β-胡萝卜素转化酶(Asy)基因的克隆及可溶性表达研究

[目的]从高产虾青素的法夫酵母(Phaffia rhodozyma) 7B12菌株中克隆β-胡萝卜素转化酶基因(β-Carotene converting enzyme gene,asy),并将该基因在大肠杆菌(Escherichia coli)中进行可溶性表达,为深入研究该酶的性质及应用提供基础.[方法]采用cDNA末端快速扩增技术,克隆得到asy基因全长cDNA序列,将其克隆到表达载体pET32a中,通过优化温度和IPTG浓度提高其可溶表达量;进一步在E.coli BL21(DE3)中共表达携带asy基因的重组质粒和pACCAR 16△crtx质粒(携带由乙酰辅酶A合成β-胡萝卜素的基因链),用液相色谱分析共转化菌株中类胡萝卜素种类的变化,鉴定可溶性表达的Asy酶活性.[结果]法夫酵母7B12菌株asy基因的cDNA序列与GenBank能检索到的唯一一条asy基因mRNA序列(Accession No.DQ002007.1)一致性达到97％,该序列总长1 971 bp,最大开放阅读框为1 614 bp,编码538个氨基酸,在E.coli BL21 (DE3)中表达的Asy融合蛋白分子量约为70 kD;条件优化后转化asy基因的重组菌在26℃、0.5 mmol/L IPTG的条件下诱导时,可溶性融合蛋白比例达85％.与pACCAR16△crtx单质粒转化相比,共转化pACCAR 16△crtx及asy基因的菌株类胡萝卜素产物的成分发生了明显的变化,其中α-胡萝卜素的含量明显减少,伴随出现了3种新的色素,根据出峰时间判断其中一种为β-胡萝卜素和虾青素的中间产物——β-隐黄质.[结论]从法夫酵母中克隆得到asy基因,通过优化诱导温度及IPTG浓度等条件提高了该基因在E.coli BL21(DE3)中的可溶性表达量,经鉴定可溶性的Asy融合蛋白具有转化β-胡萝卜素的活性.     

评论：塑料结合模块促进聚对苯二甲酸乙二醇酯的酶法降解

塑料的大量生产和无节制的使用已造成严重的环境污染。为了减少塑料废物对环境的影响,近年来塑料酶法降解已成为国内外研究者关注的热点。例如,通过蛋白质工程策略提高塑料降解酶催化活性和热稳定性,进一步提高酶法降解的效率。另外,通过融合酶策略将塑料结合模块与塑料降解酶融合,也可以促进塑料降解。近期发表在期刊Chem Catalysis的一项研究表明,采用碳水化合物结合模块融合策略可以在低浓度(<10 wt%)的底物聚对苯二甲酸乙二醇酯[poly(ethylene terephthalate),PET]中提高塑料降解酶的活性。但是在高浓度底物(10 wt%−20 wt%)中,该策略无法提高PET的酶法降解。该项研究对于采用塑料结合模块促进酶法降解塑料具有重要的指导意义。     

优化的复合自动诱导培养基（CAI-4）对外源蛋白在大肠杆菌中 表达的影响

[目的]原核表达系统是目前最为广泛使用的一种外源蛋白表达系统。在利用原核表达系统表达目的蛋白的过程中,可溶性外源蛋白的产量是决定成本和效率的决定性因素。[方法]本项研究中利用本实验室构建的7种不同的重组质粒(-1、p-2、p-3、p-4、p-5、p-6、p-7),检测其在复合自动诱导培养基中的表达情况,评价哪一种培养基更适合于外源蛋白的表达,提高目的蛋白的产量。[结果]结果显示,这7种重组蛋白在复合自动诱导培养基的表达量是普通LB培养基的4~8倍;并在此基础上,对复合培养基的成份进行进一步优化,形成了一种优化培养基(改良培养基-4),P-1、P-2、P-3这3种融合蛋白在这种改良培养基中的表达量比优化前提高了至少2倍。     

球形芽胞杆菌C3-41磷酸果糖激酶的克隆、表达及基本生物活性

[目的]球形芽孢杆菌缺乏EMP、HMP、ED途径的关键酶,如磷酸果糖激酶等被认为是其不能以糖类物质进行生长的主要原因.杀蚊球形芽孢杆菌C3-41全基因组序列分析表明,在染色体DNA上存在的磷酸果糖激酶基因pfk,为了进一步分析球形芽孢杆菌糖酵解途径,进一步确定磷酸果糖激酶在糖酵解途径中的功能.[方法]通过pfk基因在球形芽孢杆菌菌株中的Southern-blot拷贝数鉴定,在C3-41pfk基因克隆的基础上进行pfk基因在大肠杆菌中的融合表达、序列分析和序列比对等方法进行研究.[结果]证明了球形芽孢杆菌pfk基因由960 bp核苷酸组成,表达42 kDa的PFK融合蛋白,有保守的底物结合域和ATP结合域,同时pfk基因重组表达质粒可以回复大肠杆菌pfk缺陷型菌株DFl020代谢糖的能力.[结论]杀蚊球形芽孢杆菌C3-41的pfk表达产物具有磷酸果糖激酶活性,为今后深入研究球形芽孢杆菌产能代谢机理奠定了基础.