插入到细胞膜上的葡萄糖转运子4可不暴露其被光化学法标记的活性位点

胰岛素刺激骨胳肌产生磷脂酰肌醇3, 4, 5三磷酸(PI(3,4,5)P₃), 它是促进葡萄糖转运子4(GLUT4)与细胞膜融合的必要条件. 向肌肉细胞内导入PI(3,4,5)P₃可以模拟胰岛素刺激GLUT4与细胞膜融合的作用, 但不足以增加细胞摄取葡萄糖的量. 本研究目的是探讨PI(3,4,5)P₃与胰岛素作用不同的机制. 在骨骼肌细胞株(L6-GLUT4myc)中, 应用免疫反应方法检测细胞膜片上与特异性抗体反应的GLUT4的胞浆区羧基末端表位和胞外区myc表位的可用性; 使用不能渗透到细胞内的甘露糖-生物素衍生物Bio-LC-ATB-BMPA, 结合亲和光化学标记法检测GLUT4胞外区的活性位点. 相对于基础组, 100 nmol/L胰岛素和10 mmol/L PI(3,4,5)P₃分别使与myc结合的抗体量增加1.64倍和1.58倍. 胰岛素还使细胞膜上GLUT4的光化学标记量和细胞膜片上与羧基末端表位结合的抗体量分别增加了2.47倍和2.04倍, 而PI(3,4,5)P₃则无此作用. 在胰岛素作用下, 细胞膜片上与羧基末端表位结合的抗体量大于与myc表位结合的抗体量(分别为2.04和1.64倍). 结果表明: (i) 尽管PI(3,4,5)P₃能使GLUT4与细胞膜融合, 但不能使GLUT4胞外区的活性位点暴露; (ii) GLUT4胞外区活性位点的可用性与胞浆区羧基末端的可用性相关; (iii) 除了能刺激GLUT4与细胞膜融合, 胰岛素还使封闭GLUT4羧基末端的蛋白脱离. 推论胞浆内某种蛋白封闭羧基末端, 同样阻止甘露糖-生物素衍生物对GLUT4活性位点的标记, 并可能妨碍GLUT4转运葡萄糖.     

量子点标记活细胞内GLUT4 蛋白的研究

目的:研究量子点标记活细胞内GLUT4蛋白的方法,用于长时程观察活细胞内GLUT4的转运过程。方法:使用在GLUT4蛋白膜外区构建了myc位点的L6-GLUT4myc细胞系,用胰岛素刺激L6细胞内的GLUT4myc转运到细胞膜上,通过抗体抗原反应先后将一抗9E10和偶联二抗IgG的量子点与特异性位点结合。结果:通过量子点标记固定细胞内GLUT4的实验,证明了标记方法的特异性和灵敏性。量子点能够标记细胞膜表面的GLUT4蛋白并伴随GLUT4的胞吞进入细胞。适当调整实验温度,用量子点标记细胞膜上的GLUT4并且在实验过程结束后将标记了量子点的GLUT4保持在细胞膜表面,能够观察活细胞内GLUT4蛋白内化和胞内循环的过程。结论:发展了量子点标记活细胞内GLUT4的方法,为进一步研究活细胞内GLUT4的转运过程打下了基础。     

Ⅱ型糖尿病患者红细胞膜葡萄糖运输特性研究

红细胞膜葡萄糖运输的温度依赖性研究结果表明,Ⅱ型糖尿病患者的葡萄糖输入的活化能比正常增大约30%,这和患者葡萄糖输入速率减小的结果相一致.但葡萄糖跨膜输出的活化能没有显著变化.对在红细胞葡萄糖转运蛋白(GLUT1)内侧特异结合的细胞松弛素B(CB)的抑制效应研究结果表明,糖尿病人的CB抑制常数无明显变化.结合以前我们用根皮素抑制剂的实验,表明Ⅱ型糖尿病患者红细胞膜上GLUT1很可能发生了结构的变化,发生变异的位点在在此膜蛋白的膜外侧区域.     

葡萄糖转运的胰岛素敏感性以及forskolin, dipyridamole和pentobarbital对三种L6 骨骼肌细胞葡萄糖转运的抑制作用

用稳定过表达并带有myc表位的葡萄糖转运子1(glucose transporter 1, GLUT1)或葡萄糖转运子4(glucose transporter 4, GLUT4)的L6骨骼肌细胞株定征GLUT1和GLUT4对胰岛素的响应. 所筛选的L6-GLUT1myc细胞克隆分化前后的葡萄糖摄取量均在线性范围. 100 nmol/L胰岛素使L6-GLUT1myc和L6-GLUT4myc肌原细胞膜上GLUT1或GLUT4的量分别达到基础组的(1.58±0.01)倍和(1.96±0.11)倍, 2-脱氧葡萄糖摄取量分别达到了(1.53±0.09)倍和(1.86±0.17)倍, 此作用可被渥曼青霉素(wortmannin)抑制. 胰岛素刺激了此2种细胞中的Akt磷酸化. L6-GLUT1myc肌原细胞的葡萄糖摄取量对胰岛素浓度呈剂量依赖性, 但与野生型细胞相比, 其对胰岛素的敏感性和最大响应没有改变. 但L6-GLUT4myc肌原细胞的葡萄糖摄取量对胰岛素的敏感性和最大响应均增加. 以前的研究提示毛喉素(forskolin)可能影响胰岛素刺激的GLUT4转位. 本研究表明, 在L6-GLUT4myc细胞中, 毛喉素使胰岛素刺激的葡萄糖摄取减少了65%, 此作用是由它对GLUT4的直接抑制而不是由其对GLUT4转位的影响造成的. 毛喉素和dipyridamole对GLUT4比对GLUT1有更强的抑制作用, 而戊巴比妥(pentobarbital)对GLUT1的抑制作用强于GLUT4. 应用这些抑制剂的结果表明、L6肌原细胞中基础状态下和胰岛素刺激状态下的葡萄糖主要由过表达的GLUT1或GLUT4转运. 因此, L6-GLUT1myc和L6-GLUT4myc细胞株为筛查对肌肉细胞GLUT1或GLUT4的活性或转位有不同作用的化合物提供了一个平台.     

绿色荧光蛋白标记的葡萄糖转运蛋白4稳定表达细胞系的建立

目的:建立稳定表达EGFP标记的葡萄糖转运蛋白4的CHO细胞系,为研究GLUT4在CHO细胞中的转运调节机制奠定基础。方法:采用分子克隆方法构建GLUT4-EGFP的融合蛋白,在FLP-in的CHO细胞系中表达,潮霉素筛选后得到稳定的细胞系。结果:通过共聚焦显微镜的检测,证明了此稳定细胞系的阳性率达到了99%。定位研究表明大部分GLUT4以囊泡形式分布在CHO细胞胞浆内,但是质膜上也有少量的GLUT4。结论:建立了一个稳定表达GLUT4-EGFP的CHO细胞系,为进一步研究GLUT4的转运提供了一个很好的细胞模型。     

人肾小球系膜细胞葡萄糖转运蛋白的研究

本文采用了RT-PCR,细胞免疫荧光染色及流式细胞仪分析技术证实人肾小球系膜细胞有GLUT1(glucose transportorl)mRNA和蛋白质的表达。用2-Deoxy[~3H]-D-Glucose摄入法与根皮素抑制实验肯定了系膜细胞上GLUT1的功能及其在系膜细胞葡萄糖摄入中的作用。本项研究为进一步研究系膜细胞GLUT1在糖尿病肾病发病机理中的作用奠定了基础。     

1类葡萄糖转运体家族蛋白与2型糖尿病相关的研究进展

葡萄糖是机体的主要能量来源,而葡萄糖转运体(glucose transporter, GLUT)是介导葡萄糖进入细胞内的一类跨膜蛋白家族,目前已发现并鉴定了14种不同的GLUT,它们在不同组织细胞中具有不同的表达水平和功能,并参与调控组织细胞摄取葡萄糖的过程。越来越多的研究发现,GLUT的表达水平下降和功能丧失可降低组织细胞对血液葡萄糖的摄取和利用,导致血糖升高和胰岛素抵抗,形成2型糖尿病。本文主要围绕1类葡萄糖转运体GLUT1–4蛋白的结构、结构与功能关系及其与2型糖尿病的关系进行综述,旨在为2型糖尿病临床治疗方案的探索提供新的方向。     

Caveolin-1与葡萄糖转运蛋白4共同参与PC12细胞缺糖应激调节(英文)

近年研究表明,作为构成胞膜窖(Caveolae)主要的组分之一,窖蛋白-1(caveolin-1,Cav-1)除了在细胞胆固醇平衡、信号转导和整合以及细胞生长等过程中起重要作用外,还参与细胞营养改变的神经元代谢调节过程。本文旨在探讨Cav-1和葡萄糖转运蛋白4(glucose transporter 4,GLUT4)在神经细胞内营养环境改变时的功能变化和关系。采用Western blot和激光共聚焦法观察了两种蛋白在PC12细胞葡萄糖剥夺(glucose deprivation,GD)前后的表达水平与分布,发现GD 6 h后能诱导PC12细胞内Cav-1和GLUT4蛋白表达水平增加,CCK检测和流式细胞术结果显示细胞活力下降、细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)升高、线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)下降。采用si RNA技术敲低Cav-1基因后,GD组PC12细胞死亡率和[Ca2+]i进一步升高,MMP进一步下降;Cav-1敲低细胞系和甲基化β环化糊精(methylated-β-Cyclodextrin,M-β-CD)法处理实验组中,Cav-1和GLUT4蛋白表达均下降。此外还发现,GD可促进GLUT4从细胞质转位到细胞膜。结果提示,Cav-1可能通过调节GLUT4在GD情况下发挥神经保护作用。     

氯化钴增强培养海马神经元葡萄糖转运活性参与抗缺氧的作用

本文用培养新生大鼠海马神经元观察了氯化钴对葡萄糖转运活性的影响及其在神经元抗缺氧中的作用。结果表明,用CoCl2处理的培养海马神经元,24h后其2-脱氧-D-[1-^3H]葡萄糖摄取率和葡萄糖转运体GLUT1和GLUT3mRNA表达明显高于对照组,并且其在缺氧6或8h后的损伤也明显减轻,氯化钴对神经元缺氧损伤的保护作用被葡萄糖转运体抑制剂细胞松弛素B大部分消除,结果提示,氯化钴能够增强神经元GLUT1和GLUT3mRNA的表达和葡萄糖转运活性,CoCl2的这一作用可能是其增强神经元抗缺氧的重要机制。     

PKM2对乳腺癌细胞有氧糖酵解、增殖和凋亡的影响

[目的]探讨siRNA介导的PKM2基因沉默对乳腺癌细胞中有氧糖酵解、细胞增殖和凋亡产生的影响。[方法]荧光定量PCR检测乳腺癌细胞转染siRNA-PKM2的效率,葡萄糖和乳酸试剂盒及Western Blot检测细胞的糖酵解能力,CCK-8法检测细胞增殖能力,Western Blot检测细胞的凋亡状况。[结果]与对照组相比,转染PKM2的siRNA 48h后,细胞摄取葡萄糖量及乳酸分泌量均明显降低(P0.05),两种与糖酵解相关的蛋白Glut1和PFK-1表达量均降低;细胞增殖速率减慢(P0.05);抗凋亡蛋白bcl-x L蛋白表达降低,促凋亡蛋白caspase-9蛋白表达增多。[结论]siRNA介导的PKM2基因沉默能抑制乳腺癌细胞的有氧糖酵解及增殖能力,并促进细胞凋亡。     

脂肪细胞中Munc18c的缺失不影响胰岛素诱导的GLUT4转运(已撤稿2016-01-13)

动物脂肪和肌肉组织中葡萄糖的摄取是通过受胰岛素调控的GLUT4储存囊泡的运输实现的.Sec1p的同源物Munc18c被认为是通过控制SNARE复合物的装配来使GLUT4囊泡锚定到质膜上的重要物质.我们发现Munc18c的缺失没有影响GLUT4的转运上膜,也没有影响Syntaxin4在细胞膜上的定位.在缺少Munc18c和功能性Syntaxin2的时候,GLUT4的转运可能和Munc18b有关.在3T3-L1脂肪细胞中与Syntaxin4具有强烈相互作用的是Munc18c而不是Munc18a和Munc18b.然而,当缺少Munc18c时,Munc18a和Munc18b与Syntaxin4体现出较弱的相互作用.因此,Syntaxin4可能在胰岛素刺激GLUT4转运过程中起到重要的作用,且与SM蛋白的相互作用是有代偿性的.     

辣椒碱对3T3-L1 前脂肪细胞葡萄糖摄取的影响

目的:探讨辣椒碱对3T3-L1前脂肪细胞葡萄糖摄取的影响。方法:不同浓度的辣椒碱作用于3T3-L1前脂肪细胞,采用MTT测定细胞活性,GLU Test试剂盒法测定葡萄糖摄取,Western Blot法检测葡萄糖转运蛋白1(GLUT-1)表达的变化。结果:25μM辣椒碱作用72 h和50μM、100μM辣椒碱作用48 h、72 h,可显著抑制3T3-L1细胞增殖,6.25、12.5、25μM辣椒碱作用可显著促进3T3-L1细胞的葡萄糖摄入,Western Blot结果显示辣椒碱能够显著增加GLUT1蛋白表达量,差异均具有统计学意义(P0.05)。结论:低剂量辣椒碱具有降糖作用,其作用机制可能与增加GLUT-1蛋白表达有关。     

Rab蛋白在葡萄糖转运中的作用

在脂肪和骨骼肌细胞中,胰岛素可迅速刺激葡萄糖转运,即通常所说的GLUT4转运。 GLUT4转运是指Rabs与GTP结合时,促进囊泡与微管和微丝蛋白结合,并通过锚定和融合作用使GLUT4囊泡与目标膜结构融合。多数 Rab 家族成员广泛表达于各种组织细胞中,且在细胞内定位十分广泛,几乎存在于真核细胞所有的膜相关的细胞器的胞浆侧。 Rab 蛋白作为囊泡运输的分子开关,通过调节运输小泡的停泊和融合,在囊泡的形成、转运、粘附、锚定、融合等过程中起着重要的作用。 Rab蛋白受到多种上游调节蛋白的调节,同时调控着下游的多种效应蛋白,构成了复杂的调控网络：任何一个环节改变都可能会导致蛋白质转运的异常,进而引发疾病。本文系统阐述了Rab蛋白在葡萄糖转运过程中的作用及该领域的最新进展。     

猪脂肪GLUT4蛋白的大量提取纯化及鉴定

目的:寻找提取纯化具有12次跨膜结构的葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)的新方法,并通过晶体结构的解析来研究二型糖尿病的发生机制。方法:首次选用猪肉皮下脂肪作为GLUT4蛋白提取的原材料,采用组织匀浆,差速离心方法初步提取分离了富含GLUT4的组分,进一步通过硫酸铵沉淀法初步纯化到大量的GLUT4蛋白。结果:通过单抗1F8对每一个组分进行Westem Blot检测,证明了分子量55kD处的蛋白即是GLUT4。150g脂肪组织通过组织匀浆和差速离心后,于35%-55%的硫酸铵沉淀浓度范围内得到40mg纯度达到50%的GLUT4。纯化后的GLUT4可以在0.5%DM下稳定存在三天。结论:发展了快速有效提取GLUT4的新方法,为进一步蛋白结晶打下基础。     

核桃多肽对高糖诱导HepG2胰岛素抵抗模型的影响

摘 要：目的：探究核桃多肽在细胞水平上的降糖作用机制,为核桃资源开发利用提供科学依据。方法：在实验室提取的HT多肽,分离纯化HT-1、HT-2的基础上,通过GLUT4转膜活性筛选,L6肌管细胞葡萄糖摄取活性筛选以及高糖诱导HepG2细胞模型胰岛素抵抗实验,探究核桃多肽的降糖生物活性及降糖作用机制。结果：HT多肽、HT-1、HT-2均有一定的促GLUT4转膜活性,其中量效曲线趋势分布较好的为HT-2,15min开始响应,30min达峰值,在25min细胞膜上GLUT4增加1倍;葡萄糖摄取活性都较好,摄取率分别为1.16、1.06和1.36;IRβ、IRS-1蛋白、GLUT2蛋白的表达水平与HT-2呈浓度依赖性增加,表明HT-2通过胰岛素信号传导途径改善葡萄糖代谢。结论：HT多肽、HT-1、HT-2的降糖活性都较好,其中HT-2效果明显,且是通过胰岛素信号传导途径改善葡萄糖代谢。     

游离脂肪酸对3T3-L1脂肪细胞糖代谢的影响

目的:通过培养3T3-L1前脂肪细胞,并诱导其分化至成熟,研究游离脂肪酸对脂肪细胞糖代谢的影响。方法:培养诱导3T3-L1脂肪细胞,用油红O染色鉴定并比较其形态结构的变化。LPS、EPA、SA、PA干预成熟脂肪细胞,收集不同时间的培养基,葡萄糖氧化酶法算出各组脂肪细胞的葡萄糖消耗量。用Western blot检测不同时间各组干预后细胞AMPK、GLUT4蛋白含量。结果:油红O染色鉴定成熟脂肪细胞胞浆中的脂滴染成红色,并出现戒环样结构;诱导分化第8天,90%以上细胞均分化成熟。含LPS、EPA、SA、PA的培养基作用于成熟脂肪细胞,随着时间的延长,显著抑制脂肪细胞对葡萄糖的吸收(P<0.05),同时,脂肪细胞AMPK、GLUT4蛋白含量在减少(P<0.05)。结论:游离脂肪酸可以诱导胰岛素抵抗的分子机制可能是通过胰岛素信号通路激活蛋白激酶(AMPK),进而影响GLUT4的蛋白表达,使脂肪细胞的葡萄糖吸收率减低,影响脂肪细胞的糖代谢。     

siRNA干涉PIM-3表达对胶质瘤细胞增殖和糖代谢的影响

目的:利用小干扰RNA(siRNA)在胶质瘤细胞干涉PIM-3的表达,观察细胞增殖能力和代谢的变化,并探讨相关机制。方法:转染PIM-3 siRNA入胶质瘤细胞U87-MG和U251,利用MTT实验和平板克隆实验检测细胞增殖能力的变化,利用流式细胞仪测定细胞糖摄取能力,并通过Western印迹检测葡萄糖转运蛋白GLUT1的表达变化。结果:利用siRNA干涉了PIM-3在胶质瘤细胞中的表达;PIM-3表达降低后,细胞增殖能力下降,葡萄糖摄取能力减弱,GLUT1蛋白表达降低。结论:PIM-3对胶质瘤细胞的增殖和代谢重编程具有调控作用,并主要通过影响细胞的糖代谢来实现。     

Ⅱ型糖尿病患者红细胞膜葡萄糖运输体异常的研究

用葡萄糖跨膜运输蛋白的抑制剂－根皮素,观察到它对Ⅱ型糖尿病患者红细胞膜葡萄糖输入的抑制常数显著增大,提示了患者葡萄糖运输体外侧和底物分子结合位点发生了结构改变。进一步,测量了和膜上葡萄糖运输体能特异结合的葡萄糖、细胞松弛素Ｂ、根皮素等对血影膜上色氨酸残基荧光的淬灭效应。由淬灭效应前后血影膜荧光强度的相对变化,证实患者红细胞膜对葡萄糖转运功能的异常和运输蛋白中某些色氨酸残基（特别是膜外侧区段）周围结构的改变有关。     

成纤维细胞生长因子(FGF)-21改善胰岛素抵抗肝细胞对葡萄糖的吸收和肝糖原的合成

在体外建立胰岛素抵抗肝细胞模型,探讨在胰岛素抵抗状态下成纤维细胞生长因子(FGF)-21对模型细胞糖代谢的影响及机制．将HepG2细胞置于10^-7 mol/L 的胰岛素培养基中培养24 h,建立胰岛素抵抗细胞模型．分别用不同浓度的胰岛素和FGF-21处理模型细胞,采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶(GOD-POD)法检测细胞对葡萄糖的摄取情况,并检查胰岛素与FGF-21的协同作用．利用实时荧光定量PCR检测FGF-21对模型细胞葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)mRNA表达的影响,蒽酮法检测模型细胞糖原合成量,探讨FGF-21对胰岛素抵抗细胞模型葡萄糖摄取的影响及机制．结果发现,用高浓度胰岛素处理HepG2细胞24 h后,细胞对胰岛素的敏感性显著降低,说明成功建立了胰岛素抵抗细胞模型,抵抗状态可维持48 h,未发现细胞形态学变化．FGF-21能改善胰岛素抵抗模型细胞的葡萄糖摄取,参与肝糖原的合成,并与胰岛素产生协同作用．实时荧光定量PCR结果发现,FGF-21作用模型细胞后,细胞的GLUT1 mRNA表达量显著增加,说明FGF-21促进模型细胞摄取葡萄糖的作用机制与其增加GLUT1的表达有关．     

葡萄糖转运蛋白GLUT4表达的调节机制

胰岛素反应性的葡萄糖转运蛋白4（glucose transporter 4,GLUT4）在葡萄糖的摄取和代谢过程中发挥着重要作用。GLUT4蛋白表达水平直接影响机体葡萄糖的利用。肌细胞增强因子2（myocyte enhancer factor 2,MEF2）、过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferator activated receptors,PPARs）、CCAAT增强子结合蛋白α（CCAAT enhancer binding protein α,C/EBP-α）、固醇类反应元件结合蛋白1c(sterol response element binding protein 1c,SREBP-1c）等转录因子可以上调或下调Glut4基因转录。激素、代谢以及一些病理状态可以通过改变转录因子的量或活性影响Glut4。本文综述了在Glut4基因表达中发挥作用的转录因子,以及在特定的生理或病生理状态下Glut4基因表达调控的机制。