动物细胞大规模培养技术

近年来,动物细胞大规模培养技术在生物技术领域成为最受关注的热点之一,并开始广泛应用于生物医药的研发和生产过程中。以生物反应器技术为基础的动物细胞大规模培养技术平台,正逐步被建立起来并日益走向成熟,成为推动生物医药产业快速发展的有力工具。结合该技术目前的应用水平和最新进展,分析了不同细胞培养工艺之间的内在差异,以探索这一技术的未来发展方向。     

大规模动物细胞培养的问题及对策

大规模动物细胞培养在生物技术产业化进程中显示出强大的潜力。本文综述了大规模动物细胞培养过程中出现的问题及其解决办法 ,包括细胞培养环境、基因工程途径改建细胞系及过程监控等。对于这些进展的充分了解对优化细胞培养工艺、提高产品质量具有重要意义     

大规模动物细胞培养的问题及对策

大规模动物细胞培养在生物技术产业化进程中显示出强大的潜力。本文综述了大规模动物细胞培养过程中出现的问题及其解决办法,包括细胞培养环境、基因工程途径改建细胞系及过程监控等。对于这些进展的充分了解对优化细胞培养工艺、提高产品质量具有重要意义     

动物细胞大规模培养过程中细胞凋亡的检测与控制

动物细胞大规模培养技术是目前生物技术制药产业广泛采用的技术平台,凋亡是大规模培养过程中细胞的主要死亡方式。近些年来,细胞凋亡的形态学特征和分子机制已得到初步阐明,并由此开发出了一系列的细胞凋亡检测和控制方法,为提高大规模培养中的细胞活力发挥了重要作用。     

动物细胞大规模培养的主流技术

随着对单克隆抗体等产品需求量的不断增加,2000年以后,动物细胞培养的产能迅速增加．现在全球的反应器总容量超过2000000L,比8年前增加了约4倍。产物浓度也比15年前提高了约100倍。达到了5g／L以上。动物细胞大规模培养产业,在规模和技术方法上,越来越与微生物发酵产业类似。在重组蛋白的生产中,当今的主流技术是．在大型机械搅拌式反应器中,用无血清培养基和流加培养工艺悬浮培养细胞,     

微载体系统动物细胞大规模培养技术

微载体系统动物细胞大规模培养技术王佃亮,肖成祖动物细胞大规模培养技术首创于１９６２年［１］,时隔五年,荷兰的ＶａｎＷｅｚｅｌ［２］率先在这一领域中使用了微载体（ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ,ＭＣ）微载体系统（ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒｓｙｓｔｅｍ,ＭＣＳ）用于动物细胞大规模培养具有显著的优点：①兼具单层培养和悬浮培养的优势,且是均相培养;②细胞所处环境均一,放大容易;③环境条件（温度、ＰＨ、Ｃｏ２,Po2等)容易测量④具有较高的表面积体积比⑤培养操作可系统化、自动化,降低了污染发生的机会。     

大规模动物细胞培养技术研究进展

利用动物细胞大规模培养技术可生产多种生物制品,为提高细胞活力和表达水平及有利于表达产物的纯化,采用有多种添加成分的无血清培养基培养细胞,选择更有利于细胞生长又可提高培养细胞密度的微载体和条件温和、易操作、气体交换速度快的生物反应器,在线监控细胞生存环境和生理活动,减少培养过程培养基中的抑制因素,可创造更适合细胞生存的环境,提高表达水平,向细胞中导入抗凋亡基因,可提高细胞活性和蛋白产量。利用多也微载体以球转球方式大规模培养动物细胞有很好的发展前景。     

用多孔微载体大规模长期培养动物细胞的方法

长期大规模高密度动物细胞培养是生物制药产业中的关键技术,文中介绍了利用多孔微载体在中试规模生物反应器中长期大规模连续培养分泌尿激酶 原的DNA重组中国仓鼠卵巢细胞（rCHO)的方法。     

用多孔微载体大规模长期培养动物细胞的方法

长期大规模高密度动物细胞培养是生物制药产业中的关键技术,文中介绍了利用多孔微载体在中试规模生物反应器中长期大规模连续培养分泌尿激酶原的DNA重组中国仓鼠卵巢细胞（rCHO）的方法。     

动物细胞培养过程中的细胞凋亡

细胞培养过程中的细胞凋亡是细胞受环境因素的影响而发生的现象。随着对细胞凋亡的分子生物学和细胞生物学了解的深入,显示了有效地控制动物细胞培养中细胞凋亡的巨大潜力。包括采用ＤＮＡ重组技术把抗细胞凋亡的基因导入细胞和在培基中加入具有抗细胞凋亡的生存因子或化合物等手段已用于控制细胞培养过程中的细胞凋亡。这些技术将大大延长细胞达到饱和密度后的培养时间,提高细胞培养系统的生产效率。     

动物细胞培养用多孔载体的研制

多孔载体是一种新型的用于动物细胞培养的优秀的细胞支持物,其内部网状结构的小孔具有固定细胞和保护细胞免受机械损伤的功能,适合于贴壁细胞和悬浮细胞的培养,能提高培养密度,可应用于大规模培养系统。本文综述了多孔载体的物化性质、制作材料和制备方法。     

重组戊型肝炎病毒衣壳蛋白工程菌的高密度培养

在10L发酵罐中对戊型肝炎病毒衣壳蛋白在重组大肠杆菌中表达发酵工艺进行了研究,用分批培养方法探讨了不同培养基、培养基中磷酸盐浓度和Mg^2＋浓度等因素对菌体生长与重组蛋白表达的影响;用分批补料培养研究了不同的补料工艺对菌体生长与重组蛋白表达的影响,同时对重组菌诱导时期、诱导持续时间以及不同诱导温度表达包含体在尿素溶液中的溶解性进行了研究。结果表明,在优化后的培养基中,磷酸盐浓度、Mg^2＋浓度分别为80mmol/L 与20mmol/L时菌体生长与表达效果较好;分批补料培养中,37℃培养9h菌体达到对数期中期(约45OD600)为适宜诱导时期,加入终浓度为10mmol/L IPTG后诱导5h,OD600达到80以上,重组蛋白表达量达到29.74％,为最适收获菌体时间;37℃表达的包含体80％以上溶解在4mol/L的尿素溶液中,最终浓度达到14mg/mL; 10L发酵罐中确定的发酵工艺参数在30L发酵罐中进行了放大培养,10L发酵罐中确定的发酵工艺参数在30L发酵罐上具有可放大性与重复性, 可以应用于工业生产。     

Application of the Bradford Assay for Cell Lysis Quantification: Residual Protein Content in Cell Culture Supernatants

Frequently measured mammalian cell culture process indicators include viability and total cell concentration (TCC). Cell lysis, an additional important process characteristic that substantially contributes to the overall product purity profiles, is often not addressed in detail. In the present study, an inexpensive and simple application of the Bradford assay is developed to determine the residual protein content (RPC) in cell culture supernatants. The reliability and reproducibility of the method are tested in a long‐term study and compared with lysis quantification via the DNA measurement. The results show that its performance is more robust and accurate over time and the respective concentration range. Additionally, both methods are used for cell lysis process monitoring in a recombinant Chinese hamster ovary fed‐batch process. In the presented process, by applying the established assay, the lysis rate k _DL is determined to be constant over time at 4.6 × 10 ^?4 lysed cell concentration (LCC) per TCC and time (LCC/TCC/h). In contrast, DNA data did not confirm the constant lysis rate due to variations of the content per cell during cultivation. Thus, information on the RPC can facilitate the determination of the optimal harvest time point with respect to purity and in improving process characterization.     

纤维素多孔微载体的制备及其用于动物细胞培养

将纤维素铜氨溶液喷洒至-40℃的硅油：正己烷=1：4的冷冻液中形成含冰晶的微球,用-30℃、40%的H₂SO₄再生纤维素,并用EDAE盐酸盐修饰其表面,制成适合动物细胞培养的纤维素多孔微载体。利用该微载体培养能分泌尿激酶原(Pro-UK)的重组CHO细胞,在100mL搅拌瓶中换液培养25d,细胞最高密度为6.3×10⁶/mL,尿激酶原最高活性为2325IU/mL,共获28.7mg产品。之后转入1000mL搅拌瓶中培养,可观察到细胞可从种子微载体中自动转移到新微载体中生长繁殖直至所有微载体中都长有细胞。在25d二级培养中,细胞最高密度为7.3×10⁶/mL,尿激酶原最高活性为3108IU/mL,共获含353mg尿激酶原的上清13.7L。在培养后期换用无血清培养基培养,细胞生长及蛋白表达水平正常。     

多孔微载体无血清培养rCHO细胞生产u-PA

在30L搅拌式反应器中无血清培养分泌尿激酶型纤溶酶原激活剂(u-PA)的DNA重组CHO细胞,定期部分更换Cytopore多孔微载体,使生长在多孔微载体中的细胞不断更新繁殖,解决大规模细胞培养中的细胞凋亡问题。在91d连接换液培养过程中,细胞密度可维持在(1.3～2.6)×107/mL,活细胞比率维持在90%以上。在7.5L搅拌罐中培养细胞,利用外部周期性压力振荡刺激并结合载体更新技术,可减轻密度效应对细胞生长和表达的影响,在一定程度上提高细胞在高密度培养条件下的表达水平。在67d连续换液培养中,细胞最高密度为2.64×10⁷/mL,活细胞比率维持在95%以上。与稳压操作相比,利用周期变压刺激技术可提高产量10%～20%,且可降低葡萄糖厌氧代谢生成乳酸的转化率,利用4步纯化工艺,从含u-PA约135g的2100 L上清中获得约80guPA(单链比例约为90%)。     

多孔微载体无血清培养rCHO细胞生产u-PA

在30L搅拌式反应器中无血清培养分泌尿激酶型纤溶酶原激活剂(u-PA)的DNA重组CHO细胞,定期部分更换Cytopore多孔微载体,使生长在多孔微载体中的细胞不断更新繁殖,解决大规模细胞培养中的细胞凋亡问题。在91d连接换液培养过程中,细胞密度可维持在(1.3～2.6)×107／mL,活细胞比率维持在90％以上。在7.5L搅拌罐中培养细胞,利用外部周期性压力振荡刺激并结合载体更新技术,可减轻密度效应对细胞生长和表达的影响,在一定程度上提高细胞在高密度培养条件下的表达水平。在67d连续换液培养中,细胞最高密度为2.64×107／mL,活细胞比率维持在95％以上。与稳压操作相比,利用周期变压刺激技术可提高产量10％～20％,且可降低葡萄糖厌氧代谢生成乳酸的转化率,利用4步纯化工艺,从含u-PA约135g的2100L上清中获得约80gu-PA(单链比例约为90％)。