响应面-满意度函数优化重组大肠杆菌产NMN转移酶发酵条件

重组大肠杆菌Escherichaia coli能高效表达NMN转移酶,以此为出发菌株,以菌体生长量OD600和NMN转移酶的活力为响应值,对重组大肠杆菌产NMN转移酶的发酵条件进行优化.首先以Plackett-Burman实验设计优化筛选出3个主要影响因子:胰蛋白胨、甘油、MgSO4;随后以Box-Behnken中心组合设计建立上述3个因子对OD600和NMN转移酶活力水平的数学模型;最后通过满意度函数获得最佳发酵条件为:酵母粉30 g/L,胰蛋白胨10.5 g/L,甘油3.49 mL/L,MgSO40.45 g/L,K2 HPO440.5 g/L,KH2 PO46.0 g/L,NH4 Cl 1.5 g/L,NaCl 0.6 g/L,接种量1.5%,诱导时间12 h.在该优化条件下,菌体生长和产酶水平均获得了显著的提升.重组NMN转移酶的活力水平从8.85 U/mg提高到15.48 U/mg,菌体生长量OD600从4.85提高到6.01,提高幅度分别为74.92%和23.92%.     

Bacillus clarkii 7364 γ-环糊精葡萄糖基转移酶的可溶性表达及其催化特性分析

按照大肠杆菌偏爱密码子对Bacillus clarkii 7364来源的γ-环糊精葡萄糖基转移酶(γ-CGTase)进行优化,构建γ-CGTase原核表达菌株,摸索γ-CGTase的可溶性表达条件及纯化条件,并对其催化特性进行研究。结果表明:在28℃条件下实现了γ-CGTase的高效可溶性表达,可溶性蛋白占总蛋白表达量的63%,酶活可达3 830 U/mL。经(NH4)2SO4沉淀和α-CD-Sepharose 6B亲和柱纯化后,酶蛋白纯化了12.97倍,酶收率20.31%。使用该酶对木薯淀粉进行转化,转化产物中γ-环糊精(γ-CD)的比例可达90.9%,几乎无α-环糊精(α-CD),与天然酶的79%相比提高了15%。将该基因工程菌在20 L发酵罐中发酵,10 h后酶活达到4 375 U/mL,证实了其工业化放大的可能。该酶具有非常高的转化专一性,有非常好的工业化前景。     

多拷贝毕赤酵母重组菌表达GCL摇瓶优化和高密度发酵

目的:构建高效表达白地霉脂肪酶的毕赤酵母重组菌株,并对筛选得到的菌株进行摇瓶发酵条件优化和分批补料高密度发酵工艺研究。方法:将诱导型表达载体pPIC9K-gcl电转化至毕赤酵母GS115。通过橄榄油-罗丹明B平板和摇瓶发酵筛选高脂肪酶活力的重组菌株,运用基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR 法确定其拷贝数,并对菌株进行摇瓶发酵条件优化。在此基础上,研究重组菌在3L 发酵罐中的高密度发酵工艺。结果:筛选得到一株具有3 个白地霉脂肪酶基因拷贝的菌株GS115/pPIC9K-gcl 78#,初始酶活力为220 U/ml。当摇瓶发酵条件为甲醇诱导96 h,每24 h甲醇添加量1 %,接种量2 %,培养基初始pH 7.0,500 ml摇瓶装液量50 ml,甲醇诱导温度25℃ 时酶活力达735 U/ml。3L 发酵罐高密度发酵176.5 h,酶活力达到3360 U/ml,总蛋白含量达到4.30 g/L,且发酵过程中细胞活性一直保持在96 % 以上。结论:基因拷贝数与重组菌株的产酶水平呈正相关,摇瓶优化可显著提高重组菌株的产酶能力,为白地霉脂肪酶的工业化生产奠定了技术基础。     

基于分子动力学模拟的高γ-环糊精专一性环糊精糖基转移酶理性改造

【背景】环糊精糖基转移酶的分子动力学模拟较传统基因改造而言能有效提高改造效率,减少盲目性。【目的】探究环糊精糖基转移酶的催化专一性机理,为获得产γ-环糊精专一性更高的环糊精糖基转移酶提供高效突变菌株方法。【方法】通过分子对接和分子动力学模拟,获得3种产物类型CGTase与底物的对接模拟结构,并通过定点突变实验进行验证。【结果】分子动力学模拟结果显示α-和β-CGTase与十糖链在酶蛋白S1区域呈现闭合的形态,而γ-CGTase和十糖链在S1区域呈现更易于生成γ-环糊精的张开形态;3种CGTase与十糖链在相同位置存在氢键的氨基酸共有17个相对应位点,其中14个位点的氨基酸种类一致,不一致的3个氨基酸对应α-CGTase位点分别为Y89、D234和Y262。本研究对Y262位点进行定点突变和产物专一性实验,结果显示经过分子动力学预测的Y262L有助于提高产γ-CD专一性,从野生酶的13.7%提高到39.9%,γ-环糊精产物比例提高了3倍。【结论】分子动力学模拟结果对于指导环糊精糖基转移酶的专一性内在机理具有一定的正向指导意义。     

高产纳豆激酶液态发酵工艺的优化

通过用纳豆杆菌进行液态发酵生产纳豆激酶的培养基的优化实验,确定最佳产酶培养基组成为麦芽糖2%,酵母膏4%,CaCl20.03%,pH 7.0。在此基础上,设计发酵条件的优化实验,实验结果表明,在接种量为1%,装液量为100mL/500mL挡板瓶,200 r/min的条件下,34℃培养48 h达到产酶高峰,产酶活力可达4300U/mL发酵液。在此基础上,通过Luedking-Piret模型来描述纳豆激酶的生成,确定纳豆激酶的液态发酵属于部分生长偶联型。     

野葛糖基转移酶PIUGT2蛋白原核表达及其适宜条件探讨

通过单因素试验分别研究温度和IPTG浓度对重组大肠杆菌BL21(DE3)/pProEXHTa-PIUGT2诱导表达野葛糖基转移酶PlUGT2蛋白量的影响。利用150 ml LB液体培养基培养重组大肠杆菌BL21(DE3),并优化发酵条件。结果表明,在温度20℃和IPTG浓度为0.75 mmol/L条件下,PIUGT2蛋白表达量最高。     

共表达N-乙酰转移酶提高Aspergillus nidulans α-葡糖苷酶在毕氏酵母中的表达研究

葡糖苷酶以低聚寡糖为底物,通过切割非还原末端α-1,4糖苷键以获得葡萄糖基,同时转苷生成α-1,6糖苷键,广泛应用于低聚异麦芽糖生产、代谢生理研究、疾病预防治疗等各个领域。Aspergillus nidulans来源的α-葡糖苷酶在毕氏酵母中外源表达时存在酶活较低、蛋白质降解等问题,为进一步提高α-葡糖苷酶表达量,共表达N-乙酰转移酶(Mpr1)以降低发酵过程细胞受到的氧化胁迫,提高酶活。以实验室保藏的P. pastoris KM71/pPIC9K-AgbB为出发菌株,构建共表达菌株Pichia pastoris KM71/pPIC9K-AgbB/pPICZA-Mpr1,经过摇瓶发酵120h,α-葡糖苷酶转苷酶酶活和蛋白质含量可达22. 56U/ml和0. 52mg/ml,分别是出发菌株摇瓶产酶的1. 92倍和1. 27倍。在此基础上进行3. 6L罐发酵温度和甲醇诱导浓度优化,在25℃,以1%的甲醇浓度诱导发酵最高酶活和蛋白质含量可达128. 12U/ml和1. 81mg/ml,分别是起始菌株上罐产酶的1. 96倍和1. 50倍。     

洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)PCL-3产脂肪酶发酵条件研究

研究了洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia) PCL-3发酵产碱性脂肪酶培养条件的优化。采用单因子试验筛选出糊精为最适碳源,蛋白胨和尿素为复合氮源。通过Plackett-Burman设计试验,对影响产酶条件的8个相关因子进行评估并筛选出具有显著效应的三个因子：尿素、接种量以及初始pH值。用最陡爬坡实验逼近显著因子的最大响应区域后,采用响应面分析法,确定尿素、接种量以及初始pH值最优值分别为0.15％,3.05%和8.59。优化后液体发酵培养基中脂肪酶活力提高到48.88 U/mL,比初始酶活25.37U/ml提高了1.93倍。10 L 的发酵罐中,脂肪酶活力在52h达到最大,为47.69U/mL。     

工程酵母X4分泌表达HBscFv-IFNγ的发酵工艺优化

为提高工程菌-毕赤酵母X4诱导表达卸BscFv-IFNγ(抗乙肝病毒表面抗原单链抗体-γ干扰素,single-chin Fv against HBV surface antigen-γ-interferon)的量,本实验通过单因素和正交实验来优化发酵工艺,确定了X4表达HBscFv-IFNγ的最优工艺条件:150mL摇瓶培养84h,甲醇添加量2.2%(v/v),接种后的OD600=6.5,装液量20mL.使HBscFv-IFNγ的产量由起始的15mg/L提高到21.14mg/L,提高达40.9%.这为进一步对HBscFv-IFNγ的纯化、药效研究和高密度培养奠定了基础.     

重组大肠杆菌产γ-环糊精葡萄糖基转移酶的摇瓶发酵优化

为了实现来源于碱性芽孢杆菌Alkalophilic Bacillus clarkii 7364的γ-环糊精葡萄糖基转移酶的高效胞外表达,对OmpA信号肽介导的E.coli BL21(DE3)/pET20b(+)-γcgt基因工程菌进行发酵培养基及发酵条件的优化,并进行正交试验,获得最优培养基:甘油5g/L、蛋白胨6g/L、酵母膏24g/L、钙离子6mmol/L、镁离子2mmol/L、甘氨酸0.75%、PO₄^3- 0.1mol/L;在此基础上最适发酵条件:pH6.5、25℃培养、装液量30ml/250ml、转速220r/min、0.02%SDS、在发酵10h时利用5g/L乳糖进行诱导,使得酶活从初始的5189.2U/ml提高到20268.8U/ml。研究结果得到高效表达的培养条件,为实现该酶的工业化应用打下了基础。     

黑曲霉阿魏酸酯酶在毕赤酵母中的组成型表达

【目的】实现黑曲霉来源的阿魏酸酯酶在毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)中的组成型表达。【方法】以黑曲霉(Aspergillus niger)基因组为模板,经重叠延伸PCR扩增得到阿魏酸酯酶基因(AnfaeA),将其与载体pGAP9K相连,构建重组表达载体p GAP9KAnfae A,经SalI线性化后电转入毕赤酵母GS115中,得到重组菌株。高效液相色谱法测定发酵液中阿魏酸酯酶活力,并对重组菌进行了发酵优化。【结果】克隆得到783 bp的阿魏酸酯酶编码基因并实现了其在毕赤酵母中的组成型表达。重组菌发酵84 h后,上清液中酶活达5.72±0.10 U/m L。重组酶(reAnfaeA)经分离纯化后比酶活为59.75 U/mg,大小约为40 k D。发酵优化结果为:葡萄糖40.0 g/L,蛋白胨10.0 g/L,酵母膏30.0 g/L,CaCO_3 0.2 g/L,种龄28 h,接种量3%(体积比),装液量50 m L/250 m L。在此条件下发酵培养,酶活达15.60±0.23 U/m L。【结论】阿魏酸酯酶在毕赤酵母中的组成型表达,对研究毕赤酵母组成型表达系统和阿魏酸酯酶的发酵生产具有一定的借鉴意义。     

麦芽糖诱导软化芽孢杆菌α-环糊精葡萄糖基转移酶在枯草杆菌中的表达

通过PCR扩增软化芽孢杆菌α-环糊精葡萄糖基转移酶基因,将基因片段克隆到大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体pGJ103中,转化枯草杆菌WB600得基因工程菌进行外源表达。在1.5%的麦芽糖初始发酵培养基上摇瓶培养,48 h后重组枯草杆菌产酶活性为6.1U/ml。通过单因素分析和响应面分析对重组枯草杆菌产CGT酶摇瓶发酵条件进行优化。分析得到培养基关键组分麦芽糖,玉米淀粉和酵母粉三者最佳浓度分别为:15.5g/L,13g/L和20g/L。在此条件下,摇瓶培养36h后α-CGT酶活性为17.6U/ml,5L罐分批发酵30h后酶活达到20U/ml (水解活性为1.4×10⁴ IU/ml)。     

低温纤维素酶菌株CNY086发酵条件优化(Ⅱ)

本文是在前文(Ⅰ)确定菌株CNY086低温纤维素酶发酵培养基的基础上,通过单因素和正交实验研究温度、装液量、接种量及种龄对菌株CNY086低温纤维素酶发酵影响.最适发酵温度、装液量、接种量和种龄分别为15℃、250 mL/500 mL、15%、10 h.上述条件下CNY086菌株5 L发酵酶活力为104.36 U/mL.     

桔青霉生产核酸酶的发酵条件研究

对通过紫外线和60Co两次育种得到的桔青霉W48高产菌株培养基的单组分和发酵条件进行了优化,最后又用正交实验对培养基的各组分的浓度进行了优化。得到了产酶量最高的培养基组分(质量分数)是:KH2PO40.05%,K2HPO40.03%,酵母膏+蛋白胨0.7%,CaCl20.02%,MgSO40.04%,ZnSO40.03%,葡萄糖5%,pH5.5。最佳发酵条件是:接种量10%,装液量50 mL,摇床转速180 r/min,温度30℃,发酵时间66 h。用最佳培养基和最佳发酵条件发酵生产核酸酶的酶活力为758.10 U/mL,原始菌种产核酸酶的酶活力为272.26 U/mL,提高了2.78倍。     

低温植酸酶菌株Y1的发酵条件研究

目的:提高低温植酸酶产量.方法:通过单因素和正交实验研究温度、pH、发酵时间、接种量、装液量对菌株Y1的发酵影响.结果:最适发酵条件为温度15℃,pH 5.0,发酵时间24h,接种量10%,装液量200ml/500ml.其最终酶活力达到了162.39U/mL.结论:经单因素和正交实验研究后其低温植酸酶酶活力比优化前提高了29.43%.     

枯草芽胞杆菌甘露聚糖酶发酵条件优化

旨在以枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis J为生产菌株,发酵生产β-甘露聚糖酶,通过优化产酶条件,以达到提高β-甘露聚糖酶产量的目的。利用DNS比色法检测β-甘露聚糖酶活力,采用单因素试验,研究碳氮源种类及碳氮源浓度、温度、pH、接种量和装液量对菌株Bacillus subtilis J发酵产β-甘露聚糖酶的影响,结合响应面试验设计确定菌株Bacillus subtilis J发酵产甘露聚糖酶的最优发酵培养条件。单因素试验和响应面试验得到最优的发酵条件为魔芋粉28 g/L,胰蛋白胨21 g/L,K₂HPO₄ 6 g/L,MgSO₄·7H₂O 1 g/L,温度31℃,pH值8.5,接种量1%(体积分数),装液量50 mL/250 mL,发酵周期24 h。利用优化后的培养基生产β-甘露聚糖酶,其酶活力达到84.38 U/mL,是初始发酵培养基产酶活力的3.36倍。通过对发酵条件的优化,大幅度提高了β-甘露聚糖酶的产量,为其工业生产提供参考。     

甲醇毕赤酵母表达木质素过氧化物酶的研究

将含有黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosprium)木质素过氧化物酶基因的甲醇毕赤酵母工程菌进行了鉴定和筛选,筛选得到木质素过氧化物酶活力高的菌株PMLIP08。确定了一步法发酵的最优葡萄糖浓度,优化其发酵培养条件,结果表明葡萄糖的添加量为10g/L时,发酵条件为pH3.0,诱导温度24℃,培养时间12h,甲醇添加量1.1%,诱导时间72h后发酵液中酶活可达4888U/L。     

嗜热网球菌纤维二糖差向异构酶在枯草芽孢杆菌中的表达及发酵优化

通过化学方法合成嗜热网球菌(Dictyoglomus thermophilum)来源的纤维二糖差向异构酶基因ce,将其引入到载体pBSuL3-ce,构建重组质粒pBSuL3-ce并转化进枯草芽孢杆菌,发酵48h后测定胞内酶活为7. 5U/ml。酶学性质结果表明:该酶的最适pH为8. 5;最适温度为85℃,85℃的半衰期为120min。为降低发酵成本,对发酵培养基进行优化:以35g/L豆粕粉为氮源、5g/L甘油为碳源时,酶活力最高可达12. 3U/ml。依据摇瓶优化的条件在3L发酵罐中扩大培养,胞内酶活达到56U/ml,比摇瓶培养酶活提高了8倍。利用发酵所得酶制备乳果糖,在乳糖浓度为400g/L、反应温度为85℃、初始pH 8. 5、加酶量为20U/ml的条件下,乳果糖转化率可达51%。     

超嗜热酯酶EST2在不同宿主中的异源高效表达研究

来源于超嗜热古菌Alicyclobacillus acidocaldarius的酯酶EST2是目前报道的活性最高的超嗜热酯酶,具有极大的工业应用价值。为促进EST2的生产应用,将其分别在大肠杆菌及毕赤酵母中进行异源表达,并就不同宿主对表达情况和重组酶酶学性质的影响进行了分析。在大肠杆菌和毕赤酵母中重组表达的EST2酶学性质基本一致:最适温度分别为75℃和77.5℃,最适pH均为8.0,比活力分别为4656.6 U/mg和4078.3 U/mg,70℃水浴保温4.5 h,残余活力均在70%以上。在摇瓶发酵的基础上,于5 L发酵罐中进行了重组大肠杆菌及毕赤酵母的高密度发酵。毕赤酵母高密度发酵120 h菌体干重达68 g/L,最大表达酶活力为959.6 U/ml。大肠杆菌高密度发酵25 h菌体干重达60.8 g/L,最大酶活力14825.6 U/ml,表达量是毕赤酵母的15.4倍,单位时间产量是酵母的74.2倍。结果表明大肠杆菌发酵周期短、表达量高,更适合进行嗜热酯酶EST2的高效生产,这为促进嗜热酯酶在工业生物技术产业的应用奠定了基础。     

高产木质素酶荧光假单胞杆菌L-520的筛选及其发酵工艺优化

利用苯胺蓝鉴别培养基及产酶培养基进行菌种筛选,从甘肃兴隆山分离得到的10株菌株中筛选到一株高产木质素酶活力的菌株L-520,对该菌株进行16S rDNA鉴定,确定该菌为荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens)。分别考察了接种量、装液量,初始pH对L-520发酵产酶的影响,以及碳源、氮源对木质素酶活力的影响。结果得到最佳培养基为:蔗糖1%,NH_4Cl 0.2%,KH_2PO_4 0.1%,MgSO_4?7H_2O 0.05%。优化后的发酵条件为:初始pH 5,接种量3%,装液量50%。经发酵工艺优化后,漆酶(Lac)、木质素过氧化物酶(LiP)、锰过氧化物酶(MnP)三种酶活分别为16.43 U/L,106.32 U/L,95.89U/L,与初始酶活相比分别提高了8.7、14.74、11.09倍。本研究筛选得到的荧光假单胞杆菌有助于染料废水中偶氮染料的降解。