毕赤酵母截短PGK1启动子与不同终止子组合调控外源基因表达

【目的】调控多基因表达对于优化代谢途径和合成生物学应用至关重要,构建不同的启动子和终止子组合,可作为毕赤酵母代谢途径改造和优化外源基因表达的有力分子调控工具。【方法】首先,将毕赤酵母组成型磷酸甘油酸激酶基因的启动子P_PGK1进行截短,构建截短启动子分别调控报告基因（绿色荧光蛋白基因egfp和β-半乳糖苷酶基因lac Z）表达的毕赤酵母重组菌。检测重组菌的报告基团转录水平、荧光强度和β-半乳糖苷酶产量。然后,构建了不同强度启动子和终止子组合（共27种组合）调控egfp表达的重组菌。最后,选取能调控基因高、中、低表达的6个启动子-终止子组合,调控β-呋喃果糖苷酶基因表达,构建β-呋喃果糖苷酶分泌表达的重组菌。【结果】构建的截短启动子(P_PP、P_PE、P_PG和P_PD)的强度是野生型启动子P_PGK1的70%–190%,最强的启动子为P_PD。分别与9个终止子组合时,P_PG、P_PE和P_PD     

代谢工程改造酿酒酵母生产β-胡萝卜素

β-胡萝卜素在食品、药品和化妆品领域有广泛用途。为获得生产β-胡萝卜素的微生物细胞工厂,本研究首先在酿酒酵母BY4742中过表达甲羟戊酸(MVA)途径的限速酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)基因及二萜化合物合成的关键酶牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶(GGPS)基因,来提高牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)的供给。在酿酒酵母底盘菌BY4742-T2的基础上整合来源于成团泛菌和红法夫酵母的β-胡萝卜素合成基因,比较酿酒酵母工程菌生产β-胡萝卜素的差别。结果表明提高酿酒酵母中HMGR和GGPS酶基因的表达能将工程菌中β-胡萝卜素的产量提高26.0倍。另外,来源于真核生物红法夫酵母的合成基因相比成团泛菌,更有利于酿酒酵母生产β-胡萝卜素。最终获得的酿酒酵母工程菌BW02能生产1.56 mg/g细胞干重的β-胡萝卜素,为进一步获得高产β-胡萝卜素细胞工厂提供基础。     

高产β-胡萝卜素酿酒酵母菌株的设计与构建

酿酒酵母是一种重要的食品安全的工业微生物宿主。如何精确地控制代谢路径中相关基因的表达强度,是在酿酒酵母体内合成β-胡萝卜素的关键因素。通过在Delta位点整合红发夫酵母来源的β-胡萝卜素合成基因(crt E、crt I、crt YB),构建β-胡萝卜素生产菌库。从中挑选28株颜色较黄的菌株,通过96孔细胞培养板及摇瓶发酵,发现这些菌株β-胡萝卜素产量存在显著差异(产量从5.70mg/L到61.88mg/L动态分布)。然后以其中β-胡萝卜素产量最高的菌为出发菌(Sy BE_Sc118012),在敲除该菌株内源基因ypl062w的同时,在此位点过表达t HMG1和BTS1-ERG20融合蛋白以增加前体供应,最终使β-胡萝卜素的产量提高1.65倍,达到162.1mg/L,是目前已知的摇瓶水平最高发酵产量。因此,通过Delta位点整合和增加前体供应结合的策略来强化酿酒酵母中的异源表达具有重要的指导意义。     

双启动子对重组溶源性枯草杆菌中外源蛋白表达的增强作用

探讨了双启动子对基于溶源性噬菌体构建的重组枯草杆菌中外源蛋白表达的影响。分别将不含或含有本身启动子的α-淀粉酶基因(来源于Bacillus amyloliquefaciens)和青霉素酰化酶基因(来源于Bacillus megaterium)克隆到溶源性枯草杆菌中,得到重组菌B.subtilisAMY1,B.subtilisAMY2,B.subtilisPA1以及B.subtilisPA2。由于同源重组,所克隆的片段整合到溶源性枯草杆菌中的噬菌体基因组上,并处于噬菌体强启动子的下游。在重组菌AMY1和PA1中,在热诱导的情况下外源基因的转录只受到噬菌体启动子的作用,而在重组菌AMY2和PA2中,在热诱导下外源基因的转录同时受到噬菌体启动子和基因本身所带启动子的作用。双启动子的应用使重组α-淀粉酶的表达量提高了133%,使重组青霉素酰化酶的表达量提高了113%。     

多个调控元件调控萜类合成途径基因表达提高β-胡萝卜素的生产

强启动子对于获得目标产物最大代谢流量来说并不一定是最优的;相比之下,使用多个具有不同强度的调控元件对基因表达进行调控更有可能获得最优的表达强度.为了对比使用多个调控元件和使用强启动子调控萜类合成途径基因表达对β-胡萝卜素生产的影响,并通过对关键基因的组合调控提高β-胡萝卜素的生产.文中使用6个强度差异很大的人工调控元件,对萜类合成途径的8个基因进行调控.对于不同的基因,其最适的调控元件强度各不相同.对8个基因的调控使β-胡萝卜素产量提高1.2～3.5倍.和以前报道不一样的是,文中发现用适当强度的调控元件对dxr、ispG和ispH基因进行调控后,也能提高β-胡萝卜素的生产.对dxs和idi基因的组合调控将β-胡萝卜素产量提高了8倍,最终β-胡萝卜素产量达17.59 mg/g干重细胞.结果表明使用多个不同强度的调控元件对基因表达进行调控比仅使用强启动子调控更为有效,为提高目标产品合成能力提供了一种新的基因表达调控方案.     

绿色杜氏藻不同β-胡萝卜素羟化酶基因家族胁迫应答模式研究

β-胡萝卜素羟化酶(β-carotenoid hydroxylase, CHYB)是植物类胡萝卜素生物合成途径中的一个重要限速酶。本研究对绿色杜氏藻转录组测序数据进行分析,获得2条β-胡萝卜素羟化酶家族基因chyb1和chyb2。采用染色体步移法分别克隆并获得了绿色杜氏藻chyb1和chyb2基因的启动子序列,全长分别为1080 bp(GenBank登录号：KY012338)和1155 bp (GenBank登录号：KY012339)。利用Plantcare软件分析两个启动子的顺式作用元件,结果表明绿色杜氏藻chyb1基因启动子含有与甲基茉莉酸、花生四烯酸、水杨酸等非生物胁迫相关的顺式作用元件,而绿色杜氏藻chyb2基因启动子含有与光照相关的顺式作用元件。通过qRT-PCR分析了绿色杜氏藻CHYB基因家族在不同胁迫下的基因表达水平,结果表明该基因家族的基因表达水平与启动子调控相关,且不同的家族基因应答不同的胁迫。     

法夫酵母β-胡萝卜素转化酶(Asy)基因的克隆及可溶性表达研究

[目的]从高产虾青素的法夫酵母(Phaffia rhodozyma) 7B12菌株中克隆β-胡萝卜素转化酶基因(β-Carotene converting enzyme gene,asy),并将该基因在大肠杆菌(Escherichia coli)中进行可溶性表达,为深入研究该酶的性质及应用提供基础.[方法]采用cDNA末端快速扩增技术,克隆得到asy基因全长cDNA序列,将其克隆到表达载体pET32a中,通过优化温度和IPTG浓度提高其可溶表达量;进一步在E.coli BL21(DE3)中共表达携带asy基因的重组质粒和pACCAR 16△crtx质粒(携带由乙酰辅酶A合成β-胡萝卜素的基因链),用液相色谱分析共转化菌株中类胡萝卜素种类的变化,鉴定可溶性表达的Asy酶活性.[结果]法夫酵母7B12菌株asy基因的cDNA序列与GenBank能检索到的唯一一条asy基因mRNA序列(Accession No.DQ002007.1)一致性达到97％,该序列总长1 971 bp,最大开放阅读框为1 614 bp,编码538个氨基酸,在E.coli BL21 (DE3)中表达的Asy融合蛋白分子量约为70 kD;条件优化后转化asy基因的重组菌在26℃、0.5 mmol/L IPTG的条件下诱导时,可溶性融合蛋白比例达85％.与pACCAR16△crtx单质粒转化相比,共转化pACCAR 16△crtx及asy基因的菌株类胡萝卜素产物的成分发生了明显的变化,其中α-胡萝卜素的含量明显减少,伴随出现了3种新的色素,根据出峰时间判断其中一种为β-胡萝卜素和虾青素的中间产物——β-隐黄质.[结论]从法夫酵母中克隆得到asy基因,通过优化诱导温度及IPTG浓度等条件提高了该基因在E.coli BL21(DE3)中的可溶性表达量,经鉴定可溶性的Asy融合蛋白具有转化β-胡萝卜素的活性.     

环腺苷一磷酸对人Ⅰ型17β羟类固醇脱氢酶在绒癌细胞系中表达的调节作用

由HSD17B1基因编码的人Ⅰ型17β-羟类固醇脱氢酶(17β-hydroxysteroid dehydrogenasetype 1,简称Ⅰ型17HSD)催化雌酮与雌二醇之间的转化。本文研究环腺苷一磷酸简称(cAM-P)对该酶在培养的绒癌细胞系(JAR和JEG-3)中表达的调节作用。用8-bromo-cAMP处理两种绒癌细胞后,观察到在伴随1.3 kbⅠ型17 HSDmRNA表达的同时,Ⅰ型17 HSD蛋白浓度也显著上升。标记基因分析表明,cAMP可诱导HSD 17 B1基因启动子在JAR和JEG-3细胞系中的转录活性,参与调节这一诱导作用的区域位于HSD 17 B1基因编码区上游-659至-550处。凝胶阻滞实验显示这一区域可同JAR、JEG-3、T-47 D和HeLa细胞核抽提物形成特异的DNA-蛋白复合物。本结果首次证实cAMP激活HSD 17 B1基因启动子在绒癌细胞中的转录。     

两个不同启动子及其组合对碱性蛋白酶AprE异源表达的影响

背景:碱性蛋白酶(alkaline protease)是一种具有广泛用途的工业酶制剂,其发酵活力目前仍不能满足工业生产需要。目的:旨在通过优化启动子及其组合来提高Bacillus subtilis WB600中碱性蛋白酶AprE的产量。方法:以Bacillus subtilis WB600为出发菌株,成功构建了含有4种不同类型启动子(P1、P2、P-1-2、P-2-1)的碱性蛋白酶AprE表达菌株。结果:含不同启动子的4株重组菌均可成功表达碱性蛋白酶,发酵48h,含单一启动子P2的重组菌株表达碱性蛋白酶的活力为4 041U/ml,是P1的1. 23倍。双启动子重组菌B. subtilis WB600/P-2-1-aprE表达的酶活性最高,是双启动子P-1-2的1. 35倍,达到了6 125U/ml。结论:为工业化高产碱性蛋白酶提供了一种有效策略。     

酿酒酵母中高效积累β-胡萝卜素的代谢途径构建

β-胡萝卜素是一种橘黄色的脂溶性色素，属于类胡萝卜素家族，基于其丰富的生物学活性，在食品、医药、化妆品等领域具有广泛的应用。国内外对β-胡萝卜素市场需求量巨大，特别是天然来源的β-胡萝卜素具有广阔的市场前景，建立适合天然β-胡萝卜素生产的微生物细胞工厂显得尤为重要。本研究利用基因工程手段克隆了β-胡萝卜素生物合成途径中的三个基因，分别是来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的香叶基香叶基焦磷酸合成酶基因(ScBTS1)、红法夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)的八氢番茄红素脱氢酶基因(XdCrtI)以及同时具有八氢番茄红素合成酶和番茄红素环化酶的双功能酶基因(XdCrtYB),构建组成型表达载体pYES2-Kan-CrtI-CrtYB-BTS1,并转化至酿酒酵母MKP-o中，最终筛选获得能够生产β-胡萝卜素的酿酒酵母基因工程菌株。结果显示，此工程菌摇瓶产量达到14.53 mg/g细胞干重(DCW)且发酵周期短，不仅可以稳定高效地积累β-胡萝卜素，同时发酵过程中无需添加诱导剂，有利于节约生产成本。因此，可以将其作为一株具有较高β...     

外源ABA及其抑制剂钨酸钠对木薯块根类胡萝卜素相关基因和蛋白的影响

旨在研究外源ABA及其抑制剂钨酸钠(Na_2WO_4)对木薯块根类胡萝卜素相关基因和蛋白的影响。以木薯品种华南9号(Manihot esculenta Crantz SC9)为材料,HPLC测定块根β-胡萝卜素;Western blot分析相关蛋白表达量;QPCR分析相关基因表达量。结果显示,外源ABA及钨酸钠能提高块根β-胡萝卜素的含量;其中外源ABA与钨酸钠都提高了类胡萝卜素合成途径基因PSY2与LCYB表达,并抑制降解相关的ZEP与NCED3基因的表达,从而能够在转录水平的变化上解释β-胡萝卜素含量的变化,且LCYB与ZEP在转录与翻译水平具有一致性;与质体相关PAP1基因和FBN1a在处理下上调表达在一定程度上增加了质体小球的数量;外源ABA及钨酸钠使活性氧(ROS)相关的超氧化物歧化酶(Fe-SOD和Cu/Zn-SOD)表达量升高保护了块根中类胡萝卜素的稳定。这三者共同作用,提高了块根β-胡萝卜素的含量。     

细胞膜合成途径模块化调控与形态改造提高大肠杆菌β-胡萝卜素的积累与产量

β-胡萝卜素是类胡萝卜素家族中的典型代表,属于疏水性较强的化合物,前期研究表明,改变细胞膜形态以及增加3-磷酸甘油二酯的供给,均可容纳更多的β-胡萝卜素,从而提高其产量。然而在之前的研究中,没有对细胞膜的磷脂中主要组分磷脂酰乙醇胺的合成途径对β-胡萝卜素积累的影响进行系统的讨论。本研究将磷脂酰乙醇胺的合成途径分为上中下游3个模块,对它们的多种表达组合策略进行比较。首先过表达了上游模块1,菌株CAR016的β-胡萝卜素的产量与单位细胞的β-胡萝卜素产量均有显著提高,分别可达到44 mg/L以及13.7 mg/g DCW。与对照菌株相比,分别提高30.5%与35.6%。过表达磷脂酰乙醇胺合成的中游模块,β-胡萝卜素的产量以及单位细胞的β-胡萝卜素的产量分别为103.5 mg/L DCW与19.8 mg/g DCW。与对照菌株CAR016(pACYC184-M)相比,分别提高1.4倍与53.5%。将上游模块1与中游模块2共表达,菌株CAR016(pModule1,pModule2)单位细胞的β-胡萝卜素产量为22.3 mg/g DCW。与CAR016(pModule2)相比,单位细胞产量提高18%,与出发菌株CAR016(pTrc99A-M,pACYC184-M)相比,单位细胞的β-胡萝卜素产量提高122%。本研究找到了磷脂酰乙醇胺合成途径表达的最优组合策略,可以产生更大量的细胞膜,为储存β-胡萝卜素提供了更多的空间,从而进一步提高β-胡萝卜素的产量。细胞膜形态和合成途径的模块化改造,是今后提高类胡萝卜素产量的新方向。     

地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶异源表达研究

目的：以地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶基因（amyL）为报告基因,构建含不同启动子的枯草杆菌表达载体,转化枯草杆菌,并对重组菌的酶活进行分析,比较不同启动子对amyL基因在枯草杆菌中表达的影响。方法：以高温α-淀粉酶高产菌株B.licheniformis0204染色体DNA为模板,PCR扩增得到amyL并分别与PQ启动子和P43启动子进行连接构建表达载体pUB-PQ-amyL和pUB-P43-amyL,化学法转化枯草杆菌1A717,筛选得到重组转化子后对重组菌的表达产物进行SDS-PAGE和酶活检测。结果：重组菌摇瓶发酵105h后测定高温α-淀粉酶酶活,B.subtilis1A717（pUB-PQ-amyL）的最高酶活为280.1U/mL,B.subtilis1A717（pUB-P43-amyL）的最高酶活为190.5U/mL。结论：PQ启动子调控的高温α-淀粉酶最高表达水平是P43启动子调控的最高表达水平的1.47倍,说明PQ启动子能使amyL基因在枯草杆菌中更高效地表达。     

三七内切-β-1,4-葡聚糖酶基因PnCel1的表达及功能分析

内切-β-1,4-葡聚糖酶(endo-1,4-β-glucanases,EGases)广泛参与植物细胞壁的编辑,在组织伸长、果实成熟和脱落等过程中起重要作用。该研究采用RT-PCR方法,从三七(Panax notoginseng)中克隆了1个EGases基因(PnCel1),并对其进行表达和功能分析。结果显示:(1)外源茉莉酸甲酯、水杨酸、赤霉素、脱落酸和乙烯利处理显著诱导PnCel1的表达,而根腐病菌茄腐镰刀菌(Fusarium solani)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)以及交链格孢(Alternaria alternata)、木贼镰刀菌(Fusarium equiseti)侵染三七后显著抑制PnCel1的表达。(2)亚细胞定位分析表明,PnCel1-GFP融合蛋白定位于洋葱表皮细胞的细胞壁中。(3)采用染色体步移技术克隆出PnCel1的启动子序列[(-1)~(-828)bp],进而成功构建PnCel1启动子驱动的β-葡萄糖醛酸酶植物表达载体(pBI121-PPnCel1-GUS)并转入烟草(Nicotiana tabacum L.),经PCR筛选鉴定获得阳性转基因烟草7株。(4)GUS活性检测结果表明,5种植物激素能诱导PnCel1的启动子活性,但茄腐镰刀菌等4种病原菌侵染明显降低了PnCel1启动子的转录活性,且PnCel1启动子受三七WRKY转录因子PnWRKY5/9/12/15/27的负调控。(5)PnCel1过表达转基因烟草与野生型烟草相比,对茄腐镰刀菌的易感性增加,木质素含量降低,表明PnCel1可能参与改变细胞壁的结构。研究表明,植物激素能上调三七根中PnCel1的表达,而病原菌侵染降低了PnCel1的表达水平,并抑制PPnCel1的活性,推测三七PnCel1可能通过改变细胞壁结构而增加三七对根腐病菌的易感性。     

低温菌启动子探针质粒的构建

为了在宿主菌Acinetobacter sp.DWC6中构建低温菌蛋白表达载体,以pBR322质粒为基础,去除质粒上β-内酰胺酶基因的启动子片段,取而代之为来源于质粒pJRD215的卡那霉素抗性基因片段,并在pBR322中插入Acinetobacter菌属特异性ori的DNA片段,构建了能在Acinetobacter sp.DWC6和E.coli中正常复制的启动子探针质粒pBAP1。通过在质粒pBAP1中的β-内酰胺酶基因上游随机导入Acinetobacter sp.DWC6基因组片段,通过检测宿主细胞的氨苄青霉素抗性和β-内酰胺酶活性,来筛选强启动子片段,并分析了启动子探针质粒载体的功能及启动子的强度。     

尿黑酸双加氧酶基因工程菌的构建

为了构建不同表达类型的尿黑酸双加氧酶(Dio6)基因工程菌,本研究利用Over-lap PCR技术使双加氧酶基因在组成型启动子(P2和P_(spoⅠ-Ⅱ))的控制下表达;利用高效液相色谱(HPLC)技术测定XJ-6、XJ-6+P_(T7)、XJ-6+P2、XJ-6+P_(spoⅠ-Ⅱ)、P_(spoⅠ-Ⅱ)、P2、P_(T7)在7 d对芘的降解。研究结果表明:构建得到3种启动子控制表达的基因工程菌,协同效应研究表明工程菌在XJ-6的协助下可以在含芘的无机盐培养基中生长,并且组成型启动子工程菌的菌数远高于诱导型启动子工程菌的菌数。组成型启动子相较于诱导型启动子工程菌能更稳定表达外源双加氧酶基因,由于诱导型启动子工程菌需要诱导剂IPTG,并且表达双加氧酶基因会受到诱导剂浓度、诱导温度等条件的影响,所以在实际应用中组成型启动子工程菌优于诱导型启动子工程菌。     

大麦β-1,3-葡聚糖酶基因(GⅢ)启动子在转基因水稻中的诱导表达

将大麦β-1,3-葡聚糖酶同功酶基因(GⅢ)启动子(PGⅢ)与其报告基因gus(β-葡聚糖酸醛苷酶基因)耦联,构建植物表达载体,通过农杆菌介导法转化水稻.PCR、DNA印迹法结果显示,构建的pGⅢ-gus表达载体已整合到水稻基因组DNA中.GUS组织化学染色、RNA印迹法及荧光法结果显示,该启动子驱动的gus在水稻叶片中为低水平表达;而用水扬酸(SA)与稻瘟菌来源的激发子处理,可诱导gus的高水平表达.T1代种子的GUS组织化学染色结果也表明,SA与激发子可以诱导高水平的PGⅢ活性.这些结果表明PGⅢ是一种强诱导型启动子,并可能是一种病原菌诱导型的启动子.     

禾谷镰孢菌高产毒菌株的构建

为研究禾谷镰孢菌Fusarium graminearum Schw.单端孢霉烯族毒素生物合成基因（产毒基因）在寄主体内的表达,作者构建了带报告基因GUS（β-葡糖苷酸酶基因）的质粒pGUSTRI6P5,并通过对野生型菌株的转化获得禾谷镰孢高产毒菌株,该质粒含有由TRI5（禾谷镰隐单端孢霉的二烯合酶基因）启动子（TRI5 Prom)驱动的GUS基因编码区、潮霉素B抗性基因和拟枝孢镰孢F.sporotrichioides的产毒调控基因TRI6（FSTR16）。用pGUSTRI6P5转化野生型菌株GZ3639后,在含潮霉素B的培养基上选取抗性菌落。单孢分离获单孢菌株（转化子）。在GYEP（葡萄糖-酵母粉-蛋白胨）液体培养基上,转化子B4-1和B16-1的GUS比活力强,15-AcDON(15-乙酰脱氧雪腐镰鼠菌烯醇）产量高,且两者呈正相关（相关系数（r)分别为0.9839和0.9523)。B41-1和B16-1两个转化子可作为研究禾谷镰孢与其寄主相互作用的工具菌株。     

大麦β-1，3-葡聚糖酶基因（GIII）启动子在转基因水稻中的诱导表达

将大麦β-1,3-葡聚糖酶同功酶基因(GIII)启动子(PGIII)与其报告基因gus(β-葡聚糖酸醛苷酶基因)耦联,构建植物表达载体,通过衣杆菌介导法转化水稻。PCR、DNA印迹法结果显示,构建的pGIII-gus表达载体已整合到水稻基因组DNA中。GUS组织化学染色、RNA印迹法及荧光法结果显示,该启动子驱动的gus在水稻叶片中为低水平表达;而用水扬酸(SA)与稻瘟菌来源的激发子处理,可诱导gus的高水平表达。T1代种子的GUS组织化学染色结果也表明,SA与激发子可以诱导高水平的PGIII活性。这些结果表明PGIII是一种强诱导型启动子,并可能是一种病原菌诱导型的启动子。     

代谢工程改造甘油代谢途径提高β-胡萝卜素产量

甘油是生物柴油的副产物,因其价格低廉和高还原性,成为生物发酵的重要碳源。为了进一步提高工程菌对甘油的利用能力,从而提高萜类化合物的合成能力,本研究从β-胡萝卜素高产菌CAR015出发,对其甘油代谢途径的多个基因进行了调控。首先敲除了编码3-磷酸甘油抑制子的glp R基因,然后分别用M1-37、M1-46和M1-93三个不同强度的人工调控元件对glp FK、glp D和tpi A三组基因进行单基因调控和多基因组合调控。研究发现用M1-46调控glp D基因后β-胡萝卜素产量达到了64.82 mg/L,是CAR015的4.86倍,甘油消耗速率也提高了100%;调控tpi A基因后β-胡萝卜素产量略有提高;调控glp FK基因后β-胡萝卜素产量略有降低。说明Glp D是甘油代谢途径中的关键限速步骤。Q-PCR结果表明,降低甘油代谢途径的glp D和glp FK基因转录水平,增加tpi A基因转录水平,可以增加细胞生长速度、提高β-胡萝卜素产量,可能是因为减少了丙酮醛毒性所致。组合调控glp D和tpi A基因,获得β-胡萝卜素产量最高菌株Gly003,其β-胡萝卜素产量达72.45 mg/L、产率达18.65 mg/g每克干细胞,分别是出发菌株CAR015的5.23倍和1.99倍。总之,Glp D是甘油代谢途径中的关键限速步骤,适当强度调控glp D,可以有效提高重组大肠杆菌的β-胡萝卜素产量。