猪生长激素基因在杆状病毒载体系统中的表达

通过对猪生长激素（ｐＧＨ）基因的ｃＤＮＡ进行测序,得到ｐＧＨｃＤＮＡ的全序列,并与Ｓｅｅｂｕｒｇ等报道的序列进行了比较和讨论。然后利用具人工合成启动子和多角体蛋白ＸＩＶ启动子的转移载体质粒ｐＳＸＩＶＶＩ＾＋Ｘ３／４构建出含ｐＧＨ基因的重组质粒ｐＸ３／４－ｐＧＨ。将ｐＸ３／４－ｐＧＨ与致死缺失型线性化ＡｃＭＮＰＶ－ＯＣＣ＾－ＤＮＡ共转染Ｓｆ９细胞,构建出既能形成多角体又能表达ｐＧＨ基因的苜蓿丫纹夜蛾     

猪生长激素基因表达质粒的构建及其转基因动物研究

将猪生长激素基因（ＰＧＨ）克隆到质粒ｐＵＣ１９上,经酶切分析,确定其酶切图谱．把ＰＧＨ转录起始位点以前的序列切掉,换上羊ＭＴ－１ａ基因的启动子,构建成可以调控的表达载体ｐＳＭＴＰＧＨ,用于转基因动物的研究．采用微注射法将线状ｐＳＭＴＰＧＨ导入猪、鼠和金鱼的受精卵中,得到了相应的转基因动物．对这些动物鉴定分析表明,外源基因整合率因动物不同而异,但该基因在这３种动物中的整合率均在９％以上,其生长速度都高于对照组．     

猪生长激素cDNA在芽孢杆菌中的表达

利用随机克隆的枯草杆菌启动子-信号序列构建茅孢杆菌分泌载体pUS186。用限制酶将切除了信号序列的猪生长激素cDNA从质粒pLY3-PGH 604切下,亚克隆至pUS186,并在该cDNA的下游接上地衣杆菌α-淀粉酶基因的转录终止子,构建猪生长激素表达质粒pSGH 1864,将此质粒转化蛋白酶双缺陷的枯草杆菌DB104及短小茅孢杆菌289。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检出在发酵上清液中多出一条22kD的蛋白带,抗猪生长激素血清免疫印迹法证明这一蛋白带具有免疫活性,表明猪生长激素cDNA已在枯草杆菌及短小茅抱杆菌中表达。     

猪生长激素及其单克隆抗体的制备与纯化

本文介绍一种简便快捷提纯猪生长激素的方法。通过杂交瘤技术,首次获得抗猪生长激素的单克隆抗体,并讨论和比较从腹水纯化单克隆抗体的各种方法。     

外源猪生长激素基因在金鱼体内的整合与表达研究

自1982年Palmiter^[1]等人给小鼠受精卵雄原核注射大鼠生长激素基因培养成功“超级”鼠以来,由于人们认识到转基因技术导致动植物品种定向改良以及利用转基因动物作为生物反应器,大量合成和分泌贵重而安全的基因工程产品,因此转基因动物技术得到了迅速发展,相继开展了兔、鱼、猪、鸡、牛、羊等动物的转基因研究,并取得了一定的结果^[2,3,4]。但是在上述具有经济价值的高等脊椎动物中从事转基因研究,成本高、操作困难,而金鱼属于低等脊椎动物．具有产卵多、易获得同步卵、可控制体外受精和体外发育等特点,因而成为转基因动物研究的方便材料。生长激素是动物脑下垂体前叶分泌的单链多肽⑸,生理功能是促进碳水化合物代谢及核酸、蛋白质合成,整体效应表现为动物生长。本文以金鱼为实验材料,探讨猪生长激素基因导入其受精卵后整合、表达以及生物效应等问题,为进一步研究外源基因在高等动物内整合和表达调控机理提供参考。     

猪GM-CSF基因的克隆及其真核表达载体的构建

采用PCR方法从猪外周血液淋巴细胞cDNA中扩增出与预期设计大小相符的GM-CSF基因特异性条带,PCR产物经EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后,插入到载体pIRES2-EGFP构建成真核表达载体pIRES2-EGFP-GM-CSF.经PCR鉴定、限制性内切酶酶切分析和克隆片段序列测定、比较,证实了重组质粒的正确性.将构建好的真核表达质粒转染到山羊胎儿成纤维细胞中进行瞬时表达,荧光检测证实细胞转染成功.pIRES2-EGFP-pGM-CSF真核表达载体的成功构建为下一步在细胞水平研究GM-CSF蛋白功能以及进一步将其开发为高档疫苗佐方剂奠定了基础.     

猪细小病毒VP2蛋白主要抗原表位基因真核表达载体的构建及表达

Using a pair of specific primers designed according to the relevant nucleotide sequences from GenBank, the main antigen domain for VP2 gene of Porcine parvovirus was ampilified with PCR method using the genomic DNA as template. The PCR product was cloned into the expression vector pIREShyg to get a recombinant eukaryotic expression plasmid pIREShyg-VP2, which was then transfected into the CHO-K1 cells. The expressed product was detected by IFA after the positive cell clone was selected with hygromycin. The result revealed that the main antigen domain for VP2 gene of porcine parvovirus was stably expressed in CHO-K1 cells.     

猪细小病毒VP2蛋白主要抗原表位基因真核表达载体的构建及表达

猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)是引起母猪繁殖障碍的主要病原之一[1],可引起母猪流产、胚胎死亡、胎儿畸形、胎儿木乃伊化及不孕等,还可引起仔猪的皮炎和腹泻.PPV在我国污染非常严重,部分地区阳性率达90%以上[2].PPV能在大多数哺乳动物传代细胞系内长期潜伏感染,而且量少时不易检出,当细胞连续传代时可能引起细胞病变至细胞死亡,有可能给实验室带来较多麻烦.VP2蛋白是该病毒的主要结构蛋白之一,本研究构建含VP2蛋白的主要抗原表位基因的真核表达载体并获得其稳定表达的细胞株.     

骆驼蓬脂转移蛋白基因真核表达载体的构建及其体内外抗瘤效应的研究

目的:构建骆驼蓬脂转移蛋白(lipid transfer protein from Peganum harmala,PhLTP)基因真核表达质粒,并探讨其对黑色素瘤B16细胞在体内外的抗肿瘤作用。方法:将PhLTP基因亚克隆至pcDNA3.1上,获得重组质粒pcDNA3.1-PhLTP;用脂质体转染法将重组质粒及空载体外转染B16细胞,MTT检测其对B16细胞生长的影响。建立B16荷瘤小鼠模型,设重组质粒(pcDNA3.1-PhLTP)、空载(pcDNA3.1)、生理盐水和阳性药物(CTX)组,分别处理小鼠后测量各组肿瘤体积并称瘤重,计算抑瘤率。光镜观察鼠脾、肝等组织变化;免疫组织化学法检测各瘤体中PhLTP、血管内皮生长因子(VEGF)及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的表达。结果:pcDNA3.1-PhLTP转染B16细胞72 h后,细胞增殖能力明显受到抑制(P0.01)。注射pcDNA3.1-PhLTP组的小鼠肿瘤生长速度明显减慢,肿瘤体积小于空载和生理盐水组(P0.05)。显微镜下可见重组质粒组肿瘤细胞有不同程度的点、片状坏死,而肝、肺等无明显病理损伤。重组质粒组肿瘤组织中有PhLTP蛋白的表达,且VEGF和bFGF的阳性表达指数都低于空载和生理盐水组(P0.01)。结论:成功构建了重组表达质粒pcDNA3.1-PhLTP,体内外实验结果显示其能有效地抑制B16细胞的生长,预示了该重组质粒在治疗黑色素瘤中的潜在应用价值。     

脂质体包埋猪血红蛋白的制备及其注入小鼠体内的初步试验

 为探索一条研制猪血红蛋白 (pHb)为基础的血液代用品新途径 ,开发了干膜超声法将猪血红蛋白和别构效应剂、超氧化物歧化酶等联合包埋于脂质体的技术 .考察了氢化大豆卵磷脂、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 甲氧基聚乙二醇和维生素E等在制备脂质体包埋血红蛋白 (LEH)中的作用 .通过控制磷脂与其他成分的配比 ,制得包埋率为 10 3%,pHb浓度达 16 %的稳定的LEH ;进一步将pHb微囊通过小鼠尾静脉多次注入其体内 ,检测受试小鼠血液中红细胞和白细胞数、抗体滴度、血小板聚集率及肾脏组织学等方面的变化 .小鼠体内试验表明了所制备的LEH具有低免疫原性、对肾脏无明显损害等特点 .脂质体包埋pHb是一种极具开发前景的稳定的人工载氧系统     

人生长激素慢病毒载体的构建及其在鼠骨骼肌成肌细胞中的表达

构建能表达人生长激素(hGH)的pLentivirus6/V5-hGH载体,并实现hGH基因在骨骼肌成肌细胞中大量、长期和稳定的表达。体外培养SD鼠骨骼肌成肌细胞,并通过免疫组织化学方法鉴定所得细胞、用台酚兰染色确定培养细胞的活性并绘制生长曲线。将目的基因hGH亚克隆到真核细胞表达载体pLenti6/V5-D-TOPO载体上,构建重组质粒pLentivirus6/V5-hGH。将pLenti6/V5-hGH及阳性对照质粒pLenti6/V5-EGFP分别用Lipofectamin2000介导转染体外培养的SD乳鼠骨骼肌成肌细胞。在激光共聚焦扫描显微镜下计数,确定阳性对照质粒的转染数,从而估计该基因的转染效率。加入筛选试剂以获得稳定表达异源生长激素(GH)的成肌细胞。收集转染及筛选后的细胞培养基,用放射免疫分析法(RIA)检测重组人生长激素(rhGH)的表达水平。聚合酶链式反应法(PCR)及DNA测序显示hGH基因成功地插入到pLenti6/V5-D-TOPO载体中;阳性对照质粒转染细胞24h后,在激光共聚焦显微镜下观察,其转染效率达40%以上。检测收集的上清,与对照组相比,有极显著差异(P<0.01),观察至第8周,rhGH仍持续稳定表达。通过检测培养的chang-liver肝细胞上清中胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的水平,验证了rhGH的生物学活性。实验通过培养高纯度的成肌细胞,构建了能在真核细胞内表达hGH的重组质粒pLenti6/V5-hGH,实现了hGH基因在骨骼肌成肌细胞中大量、长期和稳定的表达,并且获得的rhGH具有较强的促进肝细胞分泌IGF-1的能力。     

生长激素释放肽的合成及促生长活性

用固相多肽合成法合成了生长激素释放肽(GHRP),这是一种含D-型氨基酸的外源性激素,具有促进脑下垂体分泌生长激素功能的人工合成六肽,其氨基酸序列为His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH₂.观察了使用不同剂量的GHRP对不同日龄小鼠的促生长效应,当使用最佳剂量(1000μg/kg)时,可使25日龄小鼠体重较对照组增加14.8%,同时发现鼠龄越小对GHRP越敏感,当使用剂量高达10mg/kg时仍然安全无毒.     

脂质体介导外源基因体外转染牛胎儿成纤维细胞条件的优化

通过脂质体（FuGENE-6）介导,将真核表达载体pEGFP-C1成功导入体外培养的牛胎儿成纤维细胞,探讨影响外源基因转染效率的参数,如DNA和脂质体的用量、转染的细胞数量以及细胞暴露于DNA与脂质体复合物的时间长度。通过实验发现,绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）基因的表达随DNA、脂质体量的增加而增加,延长细胞暴露时间反而使转染效率下降,转染细胞数适当才能得到较高的转化率。 Optimization of Parameters of Exogene Transfection of Bovine Fetal Fibroblasts in vitro Mediated by Liposome LI Yang,WU Kai-feng,GUO Xu-dong,GUO Ji-tong,BOU Shor-gan The Research Center for Laboratory Animal Science of Inner Mongolia University,The Key Laboratory of Ministry of Education of China for Mammal Reproduction Biology and Biotechnology,Huhhot 010021,China Abstract:pEGFP-C1 eucaryon expression vector was successfully transfected by liposome into bovine fetal fibroblasts.We investigated the effect of parameter such as the dose of DNA and liposome,number of cell transfected and exposure time of the cell to the DNA-liposome complexes.It was indicated that GFP（green fluorescent protein）expression was enhanced as the dose of DNA and liposome increased and on decline as the exposure time was prolonged.The improvement of transfection efficiency depent on the suitable cell number. Key words：liposome; GFP; bovine fetal fibroblasts; transfection     

人角质细胞生长因子2真核表达载体的构建及功能验证

目的:构建人角质细胞生长因子2(KGF-2)基因真核表达载体,探索KGF-2的上皮细胞迁移功能。方法:以人乳腺cDNA文库为模板,PCR扩增KGF-2基因片段,将其插入pXJ-40-myc,经双酶切和测序验证后,将重组质粒转染HEK-293T细胞,采用Western印迹检测重组蛋白;转染人肠上皮细胞FHC,采用细胞划痕实验检测细胞迁移能力。结果:PCR扩增获得627 bp的DNA产物,插入pXJ-40-myc载体,双酶切及测序结果证明重组质粒含有目的序列;转染HEK-293T细胞,Western印迹检测到相对分子质量约23×103的目的蛋白;细胞划痕实验显示,转染Myc-KGF-2的FHC细胞较未转染或转染空载体的细胞迁移能力强。结论:构建了人KGF-2基因真核表达载体,并验证了其促进细胞迁移的功能。     

疏水修饰聚阳离子高分子SP-Chol 在COS-7 细胞中转染和毒性的研究

目的:研究以精胺为单体,以乙二醇二氯甲酸酯作为连接剂,以胆固醇氯甲酸酯作为疏水基团连接剂合成的疏水修饰聚阳离子高分子SP-Chol对非洲绿猴肾癌细胞COS-7的转染活性和细胞毒性的影响。方法:以荧光素酶质粒为报告基因,研究SP-Chol与DNA的复合物在COS-7细胞的转染活性,用MTT方法研究SP-Chol对COS-7细胞的毒性。结果:COS-7细胞实验显示,SP-Chol具有低于PEI 25kDa的细胞毒性,同时也具有高效输送DNA的能力。结论:SP-Chol是一种新型的高效、低毒,在基因治疗领域有潜在应用价值的非病毒基因输送载体。     

人胰岛素样生长因子-1真核双顺反子表达载体pIRSES2-EGFP-hIGF-1的构建与鉴定

目的:利用基因工程原理构建人胰岛素样生长因子1(hIGF-1)全长基因的真核表达栽体pIRES2-EGFP-hIGF-1,并观察其在人胚肾293细胞中的表达.方法:应用PCR方法从人肝细胞文库中提取人hIGF-1全长cDNA序列,克隆入T-pMD18载体中,经测序证实序列正确后,利用XhoI/EcoRI进行双酶切并定向插入真核表达载体pIRES2-EGFP中,利用双酶切、电泳和PCR进行鉴定证实插入片段的正确性.应用高效转染试剂X-treme GENE HP DNA Transfection reagent介导真核表达载体pIRES2-EGFP-hIGF-1转染人胚肾细胞(HEK293),转染后利用倒置荧光显微镜与RT-PCR观察目的基因在靶细胞中的表达.结果:经酶切和测序证实重组质粒栽体构建正确,转染后48小时可观察到绿色荧光的表达,RT-PCR结果证实转染pIRES2-EGFP-hIGF-1后可有hIGF-1基因靶细胞中表达.结论:成功构建真核表达载体pIRES2-EGFP-hIGF-1,目的基因与标记基因可同时在靶细胞中表达,为后续研究奠定基础.     

疏水修饰聚阳离子高分子SP-Chol在COS-7细胞中转染和毒性的研究

目的：研究以精胺为单体,以乙二醇二氯甲酸酯作为连接剂,以胆固醇氯甲酸酯作为疏水基团连接剂合成的疏水修饰聚阳离子高分子SP-Chol对非洲绿猴肾癌细胞COS-7的转染活性和细胞毒性的影响。方法：以荧光素酶质粒为报告基因,研究SP-Chol与DNA的复合物在COS-7细胞的转染活性,用MTT方法研究SP-Chol对COS-7细胞的毒性。结果：COS-7细胞实验显示,SP-Chol具有低于PEI 25kDa的细胞毒性,同时也具有高效输送DNA的能力。结论：SP-Chol是一种新型的高效、低毒,在基因治疗领域有潜在应用价值的非病毒基因输送载体。     

人生长激素基因逆转录病毒载体的构建及其对3T3和ES细胞的转化与表达

为了研究生长激素基因在异源细胞中的表达,构建了携带人生长激素基因（ｈＧＨ）的逆转录病毒载体ｐＩＮＳ－ＧＨ,并将其导入小鼠成纤维细胞３Ｔ３和小鼠胚胎干细胞（ＥＳ细胞）ＣＣＥ中。ｐＩＮＳ－ＧＨ转化３Ｔ３细胞,获得了高效表达的克隆,即用放射免疫法检测到克隆培养基中有大量的人生长激素蛋白富积,如ＧＨＳＮＣ２０,富积率高达３７８４ｎｇ／ｍｌ,而且外源基因的整合很稳定。不同的３Ｔ３转化克隆的表达率有显著的差异,Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交的结果表明,这种差异与外源基因整合的拷贝数无关。ｐＩＮＳ－ＧＨ转化ＣＣＥ细胞没有获得明显表达的克隆,而且外源基因的整合也不稳定。转化的ＥＳ细胞克隆总ＤＮＡ的Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果表明,ｈＧＨ基因的确整合到细胞基因组中。目前尚未发现明显的外源ＤＮＡ重排的迹象。     

D-甘露糖修饰黄芩苷阳离子脂质体的制备及其对肺癌A549细胞增殖的抑制作用

目的:制备一种D-甘露糖修饰的黄芩苷阳离子脂质体[Baicalin cationic liposome,BC-Lipo(+)],并考察其对肺癌A549细胞增殖的抑制效果。方法:用乙醇注入法制备BC-Lipo(+),并考察其药剂学性质;以肺癌A549细胞为模型,采用MTT法考察其对肿瘤细胞的抑制效果。结果:透射电镜下可见BC-Lipo(+)呈圆形或类圆形,平均粒径(111.3±2.7)nm,Zeta电位(9.6±0.3)m V,包封率(95.4±0.8)%;体外释药行为符合Ritger-Peppas方程(lnQ=0.3497lnt-1.6611,r=0.9924);A549细胞的增殖抑制率可达(88.3±5.7)%。结论:处方和制备工艺合理,BC-Lipo(+)包封率较高,粒径分布均匀,带一定的正电荷,具有明显的体外缓释特性,抑制肺癌A549细胞增殖效果显著,为深入研究肺靶向BC纳米脂质体制剂奠定了基础。     

奥利亚罗非鱼促性腺激素释放激素cDNA的原核表达及其免疫原性研究

促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasinghormone,GnRH)是下丘脑分泌产生的神经激素,对脊椎动物生殖的调控起重要作用。为研究GnRH对奥利亚罗非鱼性腺发育的作用,构建了GnRHcDNA的原核表达载体并进行融合表达。利用RT-PCR方法从丘脑中扩增出长约400bp的目的序列GnRH基因,克隆至T载体中,经酶切鉴定和序列测定分析确认序列的正确性后将此片段克隆到表达载体pMAL-c2x中构建重组表达质粒pMAL-GnRH,并在大肠杆菌TB1中获得了高表达,目的蛋白约占菌体总蛋白的41.6%。菌体经溶菌酶裂解,制备无细胞抽提液,Amylose-sepharose柱层析后得到分子量为56kD单一条带的目的蛋白。目的蛋白经FactorXa酶切裂解,Amylose-sepharose过柱纯化后得到纯化的GnRH前体蛋白。以80μg/只的剂量4次免疫ICR小鼠,免疫小鼠可以检测到特异性针对GnRH前体蛋白的血清抗体应答,免疫组抗体水平显著高于空白组(P<0.05),且加强免疫第5周后抗体效价为0.707±0.320,达到高峰值,说明表达产物具有免疫原性,可以刺激机体产生免疫应答。