骨形态发生蛋白9通过p38激酶途径调控间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化

前期研究发现骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)具有较强的诱导间充质干细胞成骨分化的能力.为进一步揭示其诱导和调控间充质干细胞成骨分化的机理,利用BMP9重组腺病毒感染间充质干细胞C3H10T1/2,通过体外细胞实验和体内动物实验,初步分析BMP9是否可通过p38激酶途径调控间充质干细胞成骨分化.结果发现,BMP9可以通过促进p38激酶磷酸化而导致其活化,p38抑制剂SB203580可抑制由BMP9诱导的C3H10T1/2细胞的碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)活性、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)表达和钙盐沉积,而且利用抑制剂SB203580抑制p38激酶活性后,BMP9诱导的Smad经典途径的激活也相应受到抑制,RNA干扰导致p38基因沉默同样也可抑制BMP9诱导的ALP活性、OPN表达、钙盐沉积以及裸鼠皮下异位成骨.因此,BMP9可通过活化p38激酶途径调控间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化.     

研究报告：骨形态发生蛋白9通过p38激酶途径调控间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化

前期研究发现骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)具有较强的诱导间充质干细胞成骨分化的能力.为进一步揭示其诱导和调控间充质干细胞成骨分化的机理,利用BMP9重组腺病毒感染间充质干细胞C3H10T1/2,通过体外细胞实验和体内动物实验,初步分析BMP9是否可通过p38激酶途径调控间充质干细胞成骨分化.结果发现,BMP9可以通过促进p38激酶磷酸化而导致其活化,p38抑制剂SB203580可抑制由BMP9诱导的C3H10T1/2细胞的碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)活性、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)表达和钙盐沉积,而且利用抑制剂SB203580抑制p38激酶活性后,BMP9诱导的Smad经典途径的激活也相应受到抑制,RNA干扰导致p38基因沉默同样也可抑制BMP9诱导的ALP活性、OPN表达、钙盐沉积以及裸鼠皮下异位成骨.因此,BMP9可通过活化p38激酶途径调控间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化.     

BMP9经JNK激酶途径调控间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化

为了证实JNK激酶在骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic proteins 9,BMP9) 诱导间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化中的作用,利用重组腺病毒将BMP9导入间充质干细胞C3H10T1/2. 通过碱性磷酸酶(ALP)活性测定、钙盐沉积实验、荧光素酶报告基因检测、Western印迹和组织化学染色等方法,检测BMP9是否可经JNK激酶途径调控间充质干细胞C3H10T1/2向成骨分化.动物实验验证在RNA沉默JNK蛋白激酶后,对BMP9诱导间充质干细胞C3H10T1/2向成骨分化的影响．结果发现,BMP9可以增强JNK 激酶的磷酸化;利用JNK抑制剂SP600125抑制JNK激酶活性后,BMP9诱导的间充质干细胞C3H10T1/2的早期成骨指标ALP活性和晚期指标钙盐沉积均受到抑制,而且经典SMAD信号的活化也相应受到抑制;RNA干扰沉默JNK基因表达后,同样也可抑制BMP9 诱导的C3H10T1/2细胞的ALP活性和裸鼠皮下异位成骨．因此表明,BMP9可活化JNK激酶途径从而诱导间充质干细胞C3H10T1/2向成骨分化．     

Shh信号参与调控BMP9诱导的间充质干细胞成骨分化

目的：观察sonic hedgehog（Shh）信号通路在骨形态发生蛋白9（BMP9）诱导的小鼠间充质干细胞（MSCs）C3H10T1/2和C2C12成骨分化中的作用,并初步探讨其作用机制。方法：Shh信号通路抑制剂Cyclopamine和激活剂Purmorphamine以及过表达Shh腺病毒分别作用于BMP9处理的C3H10T1/2和C2C12细胞,碱性磷酸酶（ALP）检测早期成骨指标ALP,茜素红S染色检测晚期成骨指标钙盐沉积,RT-PCR检测Shh信号相关基因以及成骨关键转录因子的表达,Western blot检测Shh的表达,荧光素酶报告基因检测Smad1/5/8的转录调控活性。结果：BMP9促进Shh信号相关基因的表达,激活Shh信号可增强BMP9诱导的C3H10T1/2和C2C12细胞早晚期成骨分化并促进了BMP9诱导的Smad荧光素酶活性,抑制Shh信号后作用相反。结论：激活Shh信号通路可促进BMP9诱导的小鼠MSCs成骨分化,抑制其活性后作用相反。     

DLX1对BMP9诱导的间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化的影响

目的:分析和确认转录因子DLX1在骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)诱导的间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化中的作用。方法:首先,BMP9腺病毒感染C3H10T1/2细胞,RT-PCR和Western blot检测DLX1表达变化;随后,利用重组腺病毒技术分别过表达DLX1和RNA干扰(RNA Intenference,RNAi)抑制DLX1的表达,并利用碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)染色、钙盐沉积实验(茜素红染色),免疫细胞化学检测骨钙素(osteocalcin,OCN)表达和裸鼠皮下异位成骨实验分析DLX1对于BMP9诱导的C3H10T1/2细胞成骨分化的影响。荧光素酶报告基因实验和Western blot分析DLX1对于BMP9诱导的C3H10T1/2细胞Smad1/5/8信号途径的影响。结果:BMP9可以促进C3H10T1/2细胞中DLX1基因和蛋白表达水平;过表达DLX1在体外可进一步促进BMP9诱导的C3H10T1/2细胞的ALP活性、钙盐沉积以及OCN的表达,过表达DLX1亦可促进BMP9诱导的裸鼠皮下异位成骨;反之,RNAi抑制DLX1表达后,由BMP9诱导的C3H10T1/2细胞的ALP活性、钙盐沉积、OCN表达和裸鼠皮下异位成骨均相应受到抑制。过表达DLX1可进一步增强BMP9诱导的C3H10T1/2细胞中Smad/1/5/8的转录调控活性,RNAi降低DLX1表达则可抑制BMP9诱导Smad/1/5/8的转录调控活性。但是,无论过表达DLX1和RNAi降低DLX1表达均不会对BMP9诱导的Smad/1/5/8磷酸化造成影响。结论:DLX1可以调节BMP9诱导的间充质干细胞C3H10T1/2细胞成骨分化,其调节作用可能是通过影响Smad1/5/8信号的转录调控活性而实现的。     

RUNX2对BMP9诱导的间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化的影响

目的:研究和确认RUNX2在骨形态发生蛋白9(BMP9)诱导的间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化中的作用。方法:通过Western blot、RT-PCR、荧光素酶活性分析检测BMP9对RUNX2表达的影响;分别在过表达RUNX2和RNA干扰抑制RUNX2表达的情况下,利用碱性磷酸酶(ALP)活性测定和染色、钙盐沉积实验,免疫细胞化学和裸鼠皮下异位成骨实验分析RUNX2对于BMP9诱导的间充质干细胞成骨分化的影响。结果:BMP9可以促进RUNX2的表达;RUNX2体外可促进BMP9诱导的C3H10T1/2的ALP活性和钙盐沉积,却抑制了OCN表达,RUNX2还可促进BMP9诱导的裸鼠皮下异位成骨;而在降低RUNX2表达后,BMP9诱导的C3H10T1/2细胞的ALP活性、钙盐沉积、OCN表达和裸鼠皮下异位成骨均受到抑制。结论:RUNX2可以促进BMP9诱导的间充质干细胞C3H10T1/2细胞成骨分化。     

Hey1基因参与调控BMP9诱导的C3H10T1/2细胞成骨分化

目的:观察发状分裂相关增强子Hey1在骨形态发生蛋白9(BMP9)诱导的小鼠间充质干细胞(MSCs)C3H10T1/2成骨分化中的作用。方法:包装Hey1、BMP9以及GFP的过表达慢病毒,并分别作用于C3H10T1/2细胞,RT-PCR和Western blot检测Hey1、BMP9以及GFP的慢病毒是否包装成功,碱性磷酸酶(ALP)检测早期成骨指标ALP的变化,茜素红S染色检测晚期成骨指标钙盐沉积,MTT检测Hey1对BMP9调控的C3H10T1/2细胞增值的影响,流式细胞术检测Hey1对BMP9调控的C3H10T1/2细胞周期的影响。结果:Hey1、BMP9以及GFP的慢病毒包装成功;在成骨分化早期,过表达Hey1基因可促进BMP9调控的C3H10T1/2细胞的成骨分化与增殖;在成骨分化晚期,过表达Hey1基因可促进BMP9诱导的C3H10T1/2细胞的成骨分化,并将BMP9调控的C3H10T1/2细胞周期阻滞在G1期。结论:Hey1基因可参与调控BMP9诱导的小鼠C3H10T1/2细胞的早晚期成骨分化,并对细胞的增殖与周期有一定的影响。     

INH-α对BMP9诱导间充质干细胞成骨分化的作用

为了研究抑制素α亚基(inhibinα-subunit INH-α)对骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein9,BMP9)诱导的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成骨分化的影响,本研究采用细胞化学染色法检测第3天、第5天、第7天细胞中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性的变化。利用RT-PCR和Western blotting检测细胞中的成骨分化早期标志物(Runx2)和晚期标志物(OPN)的mRNA含量及蛋白表达水平。茜素红S染色法检测第21天细胞中的钙盐沉积变化。发现BMP9组ALP活性明显增高,INH-α组ALP活性与对照组相比无明显变化,但联合运用BMP9和INH-α组ALP活性较BMP9组明显降低。此外,BMP9组Runx2和OPN的mRNA含量和蛋白表达水平明显增高,而联用BMP9和INH-α组中的Runx2和OPN水平较BMP9组显著下降(p<0.01)。同样,在茜素红S染色实验中,BMP9组钙盐结节明显增多,染色深;而在联合运用BMP9和INH-α组钙盐结节较BMP9组明显减少,染色变浅。说明INH-α能够抑制BMP9诱导间充质干细胞成骨分化作用。     

MiR-21协同BMP9促进间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化

目的:探讨miR-21与BMP9之间的关系,明确miR-21在BMP9诱导间充质干细胞成骨分化中的作用。方法:(1)Ad-BMP9感染C3H10T1/2细胞,Real-time-PCR检测miR-21表达。RT-PCR检测ALP的表达。(2)MiR-21转染C3H10T1/2细胞,Real-time-PCR检测miR-21和BMP9表达。(3)MiR-21和BMP9-CM处理C3H10 T1/2细胞,ALP活性和染色实验检测C3H10 T1/2细胞早期成骨能力。茜素红S染色实验检测钙盐沉积情况。(4)MiR-21和BMP9-CM处理C3H10 T1/2细胞,Real-time-PCR检测成骨分化相关因子ALP,OCN的表达。(5)MiR-21和BMP9-CM处理C3H10T1/2细胞,Western blot检测p-Smad1/5蛋白水平的表达。结果:(1)BMP9暂时降低miR-21的表达。MiR-21也可以暂时降低BMP9的表达。(2)MiR-21可以协同BMP9增强ALP和钙盐沉积。(3)MiR-21协同BMP9增加了p-Smad1/5蛋白水平的表达。结论:MiR-21与BMP9存在相互关系,两者可以互相调节表达。MiR-21可以协同BMP9促进间充质干细胞C3H10T1/2细胞成骨分化,这一过程与增强BMP9/Smad信号的激活程度有关。     

Runx1促进BMP9诱导的间充质干细胞MEFs的成骨分化

目的:研究Runx1在骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic proteins 9,BMP9)诱导小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)成骨分化中的作用。方法:用BMP9腺病毒感染MEFs细胞,利用RT-PCR和Western blot分别在mRNA和蛋白质水平检测Runx1的内源性表达;构建过表达Runx1的重组腺病毒Ad-Runx1,并在mRNA和蛋白质水平验证Ad-Runx1的效果;用Ad-Runx1和BMP9条件培养基共处理MEFs,检测成骨早期指标碱性磷酸酶(ALP)染色和活性,茜素红S染色检测成骨晚期指标钙盐沉积;RT-PCR和Western blot分别检测成骨关键转录因子Runx2在mRNA和蛋白质水平的变化。结果:Ad-BMP9处理MEFs细胞后,可使Runx1在mRNA和蛋白质水平表达上调;构建的Ad-Runx1处理MEFs后,可使Runx1在mRNA和蛋白质水平表达上调;Ad-Runx1处理BMP9诱导的MEFs细胞后,增强了ALP活性和钙盐沉积以及Runx2在mRNA和蛋白质水平的表达。结论:Runx1可以促进BMP9诱导的间充质干细胞MEFs的成骨分化。