原核表达系统T7RNA聚合酶/启动子在真核细胞中表达目的基因的实验研究

将目前高表达水平强大的原核表达系统之一T7RNA聚合酶 启动子表达系统通过一系列改进引入真核细胞。通过转染真核细胞实验表明 ,采用真核启动子CMV调控T7RNA聚合酶的表达和在T7启动子下游插入EMCVIRES序列两种解决方案能使该原核表达系统在真核细胞高效表达目的基因 ,且能适应不同的真核细胞环境 ,是一良好的细胞类型非依赖的表达体系。     

原核表达系统T7RNA聚合酶/启动子在真核细胞中表达目的基因的实验研究

将目前高表达水平强大的原核表达系统之一T7 RNA聚合酶/启动子表达系统通过一系列改进引入真核细胞.通过转染真核细胞实验表明,采用真核启动子CMV调控T7 RNA聚合酶的表达和在T7启动子下游插入EMCV IRES序列两种解决方案能使该原核表达系统在真核细胞高效表达目的基因,且能适应不同的真核细胞环境,是一良好的细胞类型非依赖的表达体系.     

T7 RNA聚合酶表达系统的真核化及其偶联表达系统的建立

为了使T7RNA聚合酶(T7RNAP)表达系统真核化,首先,利用两种方法建立能够表达T7RNAP的真核细胞:(1)共转染表达T7RNAP的真核表达重组质粒于靶细胞;(2)利用稳定表达T7RNAP的BHK-21细胞系。然后,将FMDV内部核糖体进入位点(IRES)序列和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因定向克隆进原核载体pET-40a-c( )的T7启动子下游,得到的重组质粒pIERS-EGFP-E。用该质粒分别转染上述两种细胞,在紫外显微镜下都能够观察到绿色荧光,表明真核化的T7RNAP偶联表达系统建立。并利用流式细胞仪对偶联表达水平进行了分析。这为利用该系统真核高效表达外源蛋白奠定了坚实的基础。用实验证明了FMDV5′端含有IERS具有介导非帽依赖性的翻译的功能,为以IERS为基础的双顺反子表达系统的建立及深入研究IERS与相关蛋白的功能奠定了基础。T7RNAP偶联表达体系是一种良好的外源基因表达体系。     

原核表达系统的真核化

Ｔ7噬菌体ＲＮＡ聚合酶显著的特点是只识别其自身ＤＮＡ序列中特定的启动子[1] ;而Ｔ7噬菌体启动子属于组成型的启动子 ,又只能被相应的Ｔ7噬菌体的ＲＮＡ聚合酶 (约 10 0ｋＤ的单链蛋白质 )所识别 ,并且被Ｔ7ＲＮＡ聚合酶所启始的转录非常活跃[2 ,3] ,宿主细胞的ＲＮＡ聚合酶所进行的转录根本无法同其竞争 ,这样宿主细胞中几乎所有的转录都被Ｔ7ＲＮＡ聚合酶所操纵。另外 ,Ｔ7ＲＮＡ聚合酶几乎能完整地转录在Ｔ7启动子下游的所有ＤＮＡ序列。基于这些优点 ,1986年Ｓｔｕｄｉｅｒ和Ｍｏｆｆａｔ建立了一套新的原核表达系统———Ｔ7ＲＮＡ聚…     

重组痘苗病毒(RVV)表达载体系统研究进展

天花是烈性传染病,曾在历史上给人类带来过极大的苦难。早在1798年,英国医生Jenner首次报导采用牛痘病毒进行皮肤划痕,可以予防天花病毒的感染。这一发现为全球消灭天花发挥了极为重要的作用。     

用表达T7RNA聚合酶细胞系拯救麻疹病毒微复制子

构建稳定表达T7RNA聚合酶的细胞系,用于提高拯救麻疹病毒微复制子效率.PCR扩增T7RNA聚合酶基因,克隆到真核表达载体,转染Vero细胞,用G418筛选到稳定表达的细胞株Vero/pcDNA3-T7.用Westernblotting证明了T7RNA聚合酶在细胞中的表达.将T7启动子控制绿色荧光蛋白表达的质粒转染该细胞后,绿色荧光蛋白在细胞株中得到表达.反向插入报告基因的微复制子转染感染麻疹病毒的Vero/pcDNA3-T7细胞后,细胞中能够检测到报告基因的表达.用细胞系取代痘苗病毒系统,可以提高拯救效率.     

EIAV env基因在痘苗病毒中的表达及其免疫效果的观察

将马传贫驴白细胞弱毒疫苗及其亲本株env基因克隆到痘苗病毒表达载体pSC65的pE／L启动子下游,通过同源重组插入到痘苗病毒天坛株基因组TK区,经蓝白斑筛选获得重组痘苗病毒rvv—DINenv和rvv—LNenv,Westem blot检测目的蛋白的表达,结果表明重组痘苗病毒能够有效表达完整的EIAV Env蛋白,其肌肉接种免疫小鼠后,表达的目的蛋白具有良好的免疫原性,能够诱导机体产生有效的体液和细胞免疫应答,其中以细胞免疫效果更为显著,CTL特异性裂解最高可达28％。本研究为EIAV基因工程疫苗的开发研制奠定了基础。     

大肠杆菌等受体tRNALeu的T7 RNA聚合酶转录

用化学方法合成编码2个大肠杆菌tRNALeu(tRNALeu1和tRNALeu2)的基因和T7启动子,分别克隆到pUC19载体上,并在纯化的T7 RNA聚合酶的体外转录系统中转录出不含修饰核苷酸的tRNALeu.在T7转录体系中,亚精胺对转录有负影响.在最适转录条件下,可以得到有活力的RNA转录物的量是模板DNA的250倍左右.在大肠杆菌亮氨酰-tRNA合成酶的催化下,2种经体外转录产生的未修饰等受体tRNALeu(tRNALeu1和tRNALeu2)的亮氨酸接受能力基本相同,但只有从体内纯化对应的tRNALeu的四分之一左右,表明修饰核苷酸在tRNALeu氨酰化过程中起着较为重要但非关键的作用.     

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶cDNA在T7 RNA多聚酶/启动子系统中专一性表达的研究

用PT7和pGP1—2质粒偶联表达系统,通过温度诱导(30～42℃),使温度敏感基因CI875失活;加入利福霉素选择性抑制E.coliRNA多聚酶的表达,从而使外源PEP羧化酶cDNA得到专一性的表达。产物经SDS—PAGE和Wesern杂交分析,表明该系统表达出两条PEP羧化酶带,分子量分别是78kD和80kD。     

High Level Expression of Grass Carp Reovirus VP7 Protein in Prokaryotic Cells

Sequences analysis revealed Grass carp reovirus （GCRV） s10 was 909 nucleotides coding a 34 kDa protein denoted as VP7, which was determined to be a viral outer capsid protein （OCP）. To obtain expressed OCP in vitro, a full length VP7 gene was produced by RT-PCR amplification, and the amplified fragment was cloned into T7 promoted prokaryotic expression vector pRSET. The recombinant plasmid, which was named as pR/GCRV-VP7, was then transformed into E.coli BL21 host cells. The data indicated that the expressed recombinant was in frame with the N-terminal fusion peptide. The over-expressed fusion protein was produced by inducing with IPTG, and its molecular weight was about 37kDa, which was consistent with its predicted size. In addition, the fusion protein was produced in the form of the inclusion body with their yield remaining steady at more than 60% of total bacterial protein. Moreover, the expressed protein was able to bind immunologically to anti-his-tag monoclonal antibody （mouse） and anti-GCRV serum （rabbit）. This work provides a research basis for further structure and function studies of GCRV during entry into cells     

用T7RNA聚合酶体外转录合成大鼠肝tRNA~(Ile)

采用PCR技术从rec M1 3mp1 8中扩增出 1 2 0bp的大鼠肝tRNAIle合成基因片段 ,经限制性内切酶BstNⅠ酶切后作为模板 ,利用T7RNA聚合酶在体外无细胞体系转录由T7启动子带动的大鼠肝tRNAIle基因 ,生成不含修饰碱基的tRNAIle,并对体外转录反应条件进行了优化 ,回收的tRNA产量可达DNA模板量的 4 0倍     

pcDNA3.1/CXCR7真核细胞表达载体的构建及其在内皮细胞中的表达鉴定

目的:CXCR7是基质衍生因子1(stroma derived factor-1,SDF-1)的新受体,且该受体在血管新生部位的内皮细胞中表达上调,故本研究拟构建CXCR7的真核表达载体pcDNA3.1/CXCR7,并检测其在人脐静脉内皮细胞中的表达.方法:采用RT-PCR法从人肝癌细胞HepG2的cDNA中扩增出约1100 bp的CXCR7基因片段.采用KpnI、XbaI将目的基因和载体pcDNA3.1进行双酶切,将酶切产物加入T4 DNA连接酶16℃连接过夜.将连接产物转化到感受态大肠杆菌中.挑取阳性克隆、提质粒,用双酶切、质粒DNA PCR扩增及DNA序列分析鉴定正确后,采用阳离子脂质体LipofectamineTM 2000将其转染人脐静脉内皮细胞(HUwc),通过western-blot检测目的基因在内皮细胞中的表达.结果:阳性克隆经双酶切法鉴定含有CXCR7基因片段,质粒DNAPCR扩增出与CXCR7同等大小的基因片段,基因测序结果与GenBank中序列相同.转染HUVEC后,细胞中CXCR7的表达水平显著上升.结论:成功构建了CXCR7的真核表达栽体,可在内皮细胞中正常表达并.为进一步研究其作用机制奠定了基础.     

T7启动子在哺乳类动物细胞中启动外源基因表达的研究

人低密度脂蛋白（LDL）受体基因cDNA和氯霉素已酞转移酶基因（CAT）及PolyA信号序列被克隆进pGEM4载体的T7噬茵体启动子下游,构建成质粒pT7LDLR和pT7CAT．两个重组质粒转化CHO细胞．PCR和CAT酶实验显示：两个基因被T7噬菌体启动子所启动．结果证实真核生物RNA聚合酶能够识别T7启动子,转录外源基因．常用的含有T7启动子的质粒可同时作为原核生物和真核生物的表达载体．     

利用重组噬菌体诱导表达的大肠杆菌表达系统

将编码噬菌体T7RNA聚合酶的基因克隆至噬菌体M13mpl8RFDNA中,置于lac启动子的控制之下,得到了可表达T7 RNA聚合酶的重组噬菌体M13HEP。利用该噬菌体感染含T7启动子表达质粒的宿主菌以提供T7RNA聚合酶,可以诱导T7启动子控制下的外源基因的表达。该噬茵体诱导表达系统已成功地表达了多种外源基因,特别是一些表达产物对宿主菌有毒性的基因。同时,通过细菌接合将F',因子从大脑杆菌XL1-blue转至大肠杆菌HMS174,构建了新的大脑杆菌菌株HMSl74F,,使得T7表达质粒构建、表达及单链制备可以在同一菌株中完成,得到了一个完整的T7表达系统。     

T7启动子-11碱基突变对转录影响的研究

T7噬菌体启动子能被T7RNA聚合酶和真核生物RNA聚合酶Ⅱ系统启动转录 ,为研究两个系统转录的关键碱基 ,将合成的T7噬菌体启动子 1 1变异体与报道基因CAT基因连在一起。体内CAT和体外狭缝RNA杂交实验显示 : 1 1碱基是T7RNA聚合酶和真核生物RNA聚合酶Ⅱ系统启动T7启动子的关键碱基之一。