FGFR2IIIc重组慢病毒载体的构建及其在肌原细胞L6中的表达

目的:构建人FGFR2IIIc重组慢病毒表达系统,感染并筛选获得大鼠肌原细胞L6表达人FGFR2IIIc的重组细胞株,初步研究FGFR2IIIc对L6细胞的作用。方法:从人胎盘组织中获得FGFR2IIIc基因,并克隆到Gateway慢病毒系统的入门载体pENTR-11,采用LR重组酶将重组的pENTR-FGFR2IIIc和表达载体pLenti6/V5-DEST进行重组反应得到pLenti6/V5-DEST-FGFR2IIIc。将该重组表达载体和Viral Packaging Mix包装质粒通过阳离子脂质体共转染293FT细胞,待细胞完全裂解后收集重组慢病毒颗粒上清液;取适量上清液感染L6细胞,杀稻瘟毒素筛选2~4周,挑单克隆细胞进一步扩大培养并建立重组细胞株。RT-PCR、间接免疫荧光和Western blot鉴定重组细胞株中目的基因FGFR2IIIc的表达,bFGF和硫酸乙酰肝素共同诱导各重组L6细胞株后流式细胞术分析细胞周期,形态观察检测成肌分化水平,并通过相关信号通路抑制剂分析与各信号通路的关系。结果:构建了含人FGFR2IIIc基因的重组慢病毒表达载体,获得的重组慢病毒颗粒能高效感染L6细胞,RT-PCR和间接免疫荧光实验说明正确表达目的基因;流式细胞术结果表明L6中高表达FGFR2IIIc的重组细胞株的G1/G0期的细胞增多;各重组细胞株分别加入Erk1/2和p38通路抑制剂抑制诱导2天,发现重组细胞株发生不同的形态变化。结论:通过慢病毒表达系统,成功构建高表达FGFR2IIIc的重组L6细胞株,FGFR2IIIc通过Erk1/2和p38通路影响了L6细胞的形态发生,该结果为下一步在大鼠L6细胞中研究FGFR2IIIc基因与成肌分化功能相关性奠定基础。     

人成纤维细胞生长因子受体2IIIc及其突变型重组腺病毒的获得和在乳腺癌细胞中的表达

获得人成纤维细胞生长因子受体2Ⅲc(FGFR2Ⅲc)及其S252W突变型重组腺病毒,感染乳腺癌细胞MDA-MB-231,为下一步研究FGFR2Ⅲc基因的功能和作用机制奠定基础。以本实验室保存的含FGFR2Ⅲc基因的质粒为模板,PCR扩增得到FGFR2Ⅲc基因,重叠延伸法PCR获得FGFR2ⅢcS252W突变型基因;分别将上述野生型和突变型基因克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上,得到重组穿梭质粒pAdTrack-FGFR2Ⅲc和pAdTrack-FGFR2ⅢcS252W,DNA测序证实。Pme I酶切后分别与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化BJ-5183感受态细菌同源重组,得到的重组表达质粒Ad-FGFR2Ⅲc和Ad-FGFR2ⅢcS252W Pac I酶切线性化后转染HEK293A细胞进行重组腺病毒的包装和扩增,通过GFP报告基因观察病毒表达情况。收集重组病毒颗粒并测定滴度,进一步感染乳腺癌细胞MDA-MB-231,RT-PCR和Western blotting方法检测目的基因的表达,3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法和流式细胞术分析细胞增殖情况。结果表明,成功构建了人FGFR2Ⅲc及其S252W突变型基因的重组腺病毒表达载体,获得的重组腺病毒颗粒能高效感染MDA-MB-231细胞,并表达目的基因。MTT结果显示FGFR2Ⅲc和S252W均能抑制MDA-MB-231细胞增殖,S252W抑制效果更加明显。流式细胞术表明FGFR2Ⅲc和S252W均能使MDA-MB-231细胞周期停滞于G0/G1期,抑制细胞增殖。     

人成纤维细胞生长因子受体2Ⅲc及其突变型重组腺病毒的获得和在乳腺癌细胞中的表达

获得人成纤维细胞生长因子受体2Ⅲc(FGFR2Ⅲc)及其S252W突变型重组腺病毒,感染乳腺癌细胞MDA-MB-231,为下一步研究FGFR2Ⅲc基因的功能和作用机制奠定基础。以本实验室保存的含FGFR2Ⅲc基因的质粒为模板,PCR扩增得到FGFR2Ⅲc基因,重叠延伸法PCR获得FGFR2ⅢcS252W突变型基因;分别将上述野生型和突变型基因克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上,得到重组穿梭质粒pAdTrack-FGFR2Ⅲc和pAdTrack-FGFR2ⅢcS252W,DNA测序证实。Pme I酶切后分别与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化BJ-5183感受态细菌同源重组,得到的重组表达质粒Ad-FGFR2Ⅲc和Ad-FGFR2ⅢcS252W Pac I酶切线性化后转染HEK293A细胞进行重组腺病毒的包装和扩增,通过GFP报告基因观察病毒表达情况。收集重组病毒颗粒并测定滴度,进一步感染乳腺癌细胞MDA-MB-231,RT-PCR和Western blotting方法检测目的基因的表达,3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法和流式细胞术分析细胞增殖情况。结果表明,成功构建了人FGFR2Ⅲc及其S252W突变型基因的重组腺病毒表达载体,获得的重组腺病毒颗粒能高效感染MDA-MB-231细胞,并表达目的基因。MTT结果显示FGFR2Ⅲc和S252W均能抑制MDA-MB-231细胞增殖,S252W抑制效果更加明显。流式细胞术表明FGFR2Ⅲc和S252W均能使MDA-MB-231细胞周期停滞于G0/G1期,抑制细胞增殖。     

抑癌基因NDRG2对人结肠癌细胞系Caco-2增殖的影响

目的:采用重组慢病毒系统,在过表达和抑制NDRG2 (N-myc downstream regulated gene 2)基因后,检测人结肠癌细胞系Caco-2的增殖情况.方法:分别采用NDRG2过表达慢病毒载体pLenti6-NDRG2和NDRG2干涉慢病毒载体pLKO.1-shNDRG2制备病毒并感染Caco-2细胞,经14天耐药的筛选,获得稳定感染的细胞株;采用Real time RT-PCR和Western blot方法明确NDRG2在稳转细胞株中的表达情况,同时采用MTT方法检测细胞的增殖能力,通过流式细胞仪检测细胞周期变化情况.结果:Real time RT-PCR和Western blot结果表明,在慢病毒pLenti6-NDRG2稳定感染的Caco-2细胞中,NDRG2表达上调;pLKO.1-shNDRG2稳定感染的Caco-2细胞中,NDRG2的表达下调.MTT实验结果表明,NDRG2过表达细胞株中细胞的增殖能力下降,而pLKO.1-shNDRG2慢病毒感染Caco-2后细胞的增殖能力明显增加;流式细胞术结果显示,过表达NDRG2使Caco-2细胞在G0/G1期细胞增多而S期的细胞减少,抑制细胞内源性NDRG2后G0/G1期细胞减少而S期细胞增多.结论:通过过表达和抑制NDRG2基因,验证了NDRG2作为抑癌候选基因能够有效抑制结肠癌细胞Caco-2的增殖.     

可分泌性GLP-1重组慢病毒的构建

目的:为了探讨使用基因治疗在体内分泌表达胰高血糖素样肽-1(GLP-1)方法治疗糖尿病的可行性,构建可分泌表达GLP-1的重组慢病毒.方法:1.将已构建成功的NT4-GLP-1融合基因插入慢病毒包装质粒pLenti6V5D-TOPO中,构建pLenti6V5D-TOPO/NT4-GLP-1重组慢病毒包装质粒.2.用慢病毒包装辅助质粒plp1、plp2、plp/VSVG,及重组慢病毒包装质粒pLenti6V5D-TOPO/NT4-GLP-1,四质粒磷酸钙共沉淀法转染80%融合的293细胞系,包装慢病毒.3.通过免疫组化法染色确定重组慢病毒效应.结果:重组质粒经BamHI和XhoI联合酶切,10g/L琼脂糖凝胶电泳可见在342bp处有一目的片段.该值与NT4-GLP-1融合基因片段的大小一致,说明NT4-GIP-1融合基因已经成功重组于慢病毒包装质粒pLenti6V5D-TOPO内.免疫组化结果显示,实验组细胞内出现大量棕黄色颗粒,阳性细胞达到70%以上,对照组中没有阳性细胞,所以说明NT4-GLP-1重组慢病毒在细胞中可以正确地分泌表达GLP-1.结论:NT4-GLP-1重组慢病毒包装质粒构建正确,病毒包装成功.     

慢病毒介导稳定表达FRT-LacZ基因的MDCK细胞株构建

[目的]通过慢病毒载体系统获得稳定表达FRT-LacZ基因的MDCK细胞株。[方法]PCR扩增FRT-LacZ基因,亚克隆至慢病毒载体p LVX-PGK-Puro。经四质粒包装系统共转染293FT细胞包装重组慢病毒并检测病毒滴度,获得的慢病毒感染MDCK细胞,经嘌呤霉素筛选和β-半乳糖苷酶原位染色检测筛选鉴定转基因细胞株。[结果]测序证实,成功构建重组慢病毒质粒p LVX-FRT-LacZ-PGK-Puro。包装产生的慢病毒滴度为4.04×107TU/m L,重组慢病毒感染MDCK细胞后筛选获得稳定表达FRT-LacZ基因的MDCK细胞株。[结论]构建了稳定表达FRTLacZ基因的MDCK细胞株。     

TRAIL 慢病毒载体构建及其在肝癌细胞中的表达

目的:构建携带TRAIL基因的慢病毒表达载体并实现其在肝癌细胞株HepG2中的稳定高表达。方法:构建TRAIL重组慢病毒表达载体pCDH-CMV-TRAIL-EF1-GFP-T2A-Puro,脂质体法将重组慢病毒载体和包装质粒混合物共转染293T细胞,包装产生慢病毒颗粒,纯化并测定病毒滴度。利用Western blotting检测TRAIL蛋白在HepG2中的表达。结果:酶切以及测序证实,成功构建TRAIL基因重组慢病毒载体,纯化的慢病毒滴度为1.02×104ifμ/μL。利用嘌呤霉素筛选获得稳定表达TRAIL的细胞系,经Western blot方法检测到TRAIL蛋白的稳定高表达。结论:成功构建了带有TRAIL基因的慢病毒载体,并实现其在HepG2的稳定高表达。     

人肾脏相关基因Nox4过表达慢病毒载体的构建与定位检测

目的:克隆Nox4基因入pLenti6.3慢病毒表达载体,为探索Nox4基因在ROS产生中的作用提供实验基础。方法:根据NCBI人Nox4 mRNA序列设计引物,再利用酶切连接反应将Nox4插入到入门载体pENTR3C中,成功构建pENTR3C-Nox4后,通过LR反应,将Nox4和EGFP tag插入到慢病毒表达载体pLenti6.3中,经酶切和测序验证正确后,将重组表达质粒转染入人Hela细胞,通过Western-Blot验证Nox4的表达情况,免疫荧光验证Nox4在细胞内的定位情况。结果:入门载体及表达质粒测序比对完全正确,转染Hela细胞后可见明显的表达条带,并且主要定位于细胞器内质网中。结论:成功构建了带有EGFP tag的Nox4基因慢病毒重组表达载体,转染Hela细胞后,其能正确表达并定位于内质网中,为研究Nox4在调节ROS产生中的作用奠定了基础。     

FGFR2Ⅲc胞外段的原核表达及其对前列腺癌细胞增殖的抑制作用

将FGFR2Ⅲc胞外段基因转入pEt3c载体,并通过大肠杆菌使其以包涵体形式表达.经透析法复性和肝素亲和层析纯化,得到纯度95%以上的目的蛋白.通过免疫共沉淀方法证实复性后的FGFR2Ⅲc胞外段与FGF2之间可特异性结合,并对前列腺癌DU145细胞的增殖具有明显的抑制作用(MTT法).免疫印迹结果显示FGFR2Ⅲc胞外段可显著下调DU145细胞膜上FGFRs的磷酸化水平,提示由于有效阻断FGFs的细胞内信号通路,从而导致FGFR2Ⅲc胞外段对肿瘤细胞增殖的抑制.     

人Hes1-shRNA，Hes5-shRNA慢病毒表达载体的构建、包装及鉴定

目的构建人Hesl-shRNA和Hes5-shRNA慢病毒表达载体,为Notch—Hes信号通路的相关研究奠定基础。方法根据人Hes1,Hes5基因mRNA序列分别设计、合成多对互补的DNA单链寡核苷酸,退火后克隆至pENTR／U6入门载体。通过入门载体瞬时转染神经胶质瘤U251细胞筛选有效干扰序列。将含有效干扰序列的入门载体与pLenti6／BLOCK—iT—DEST载体进行LR重组构建Hesl—shRNA和Hes5-shRNA慢病毒表达载体,经脂质体介导入293FT细胞,包装成慢病毒。用该慢病毒感染U251细胞,Western印迹法分别检测Hes1,Hes5蛋白的表达。结果分别构建了针对Hes1和Hes5基因的特异性shRNA慢病毒表达载体,其包装获得慢病毒可有效感染U251细胞并分别对HeM,Hes5蛋白的表达有显著抑制作用。结论成功构建了Hesl—shRNA和Hes5-shRNA慢病毒表达载体。     

MPST基因慢病毒载体的构建及在SH-SY5Y细胞中的表达

为构建MPST基因慢病毒表达载体,获得稳定表达外源MPST基因的SH-SY5Y细胞株,本研究通过PCR扩增出MPST目的基因,将其克隆到慢病毒表达载体p EB-GFP (T2A) PURO上,将重组慢病毒表达载体和慢病毒包装质粒系统(pLP/VSVG, pLP1, p LP2)共转染293T细胞,用获得重组的慢病毒液感染SH-SY5Y细胞,嘌呤霉素筛选稳定表达MPST基因的(SH-MPST)细胞株。采用Real-time PCR和Western blotting以及ELISA等方法对筛出来的SH-MPST中的MPST的表达及功能进行鉴定。与空转染组(SH-PEB)相比,SH-MPST细胞中MPST mRNA及蛋白的表达水平显著增加,且细胞内MPST酶活性、酶含量及细胞释放硫化氢的水平均显著增加(p0.05)。以上研究表明,MPST基因慢病毒表达载体成功构建,并获得稳定表达外源MPST基因的SH-SY5Y细胞株,这将为MPST功能的深入研究提供依据。     

LIM结构域蛋白FHL1C抑制Notch信号途径的转录激活研究

目的：克隆人表达FHL1C基因以及建立真核表达载体和慢病毒载体。方法：从人的骨骼肌细胞来源的cDNA中扩增并克隆人FHL1C基因的编码区,连接至pMD-18T载体酶切鉴定后测序。序列测定确认后,双酶切pMD18T-FHL1C回收片段,插入真核表达载体,构建真核表达载体pCMV-Myc-FHL1C酶切鉴定正确后,转染Hela细胞及Cos7细胞,用Western Blot检测其在转染细胞中的表达,用双荧光素报告基因系统检测其对Notch信号作用。构建FHL1C-IRES-GFP表达单元,建立慢病毒表达载体plen-ti6/V5-FHL1C-IRES-GFP,包装慢病毒后感染培养的细胞,用免疫荧光显微镜、Western Blot检测分析其在被感染的细胞中的表达。结果：通过PCR方法成功扩增了人FHL1C基因的编码区。通过转染Hela及Cos7细胞,使用Western Blot检测其蛋白水平表达,双荧光报告基因系统分析均能够下调激活的Notch信号。成功构建了FHL1C慢病毒表达载体pLenti6/V5-FHL1C-IRES-GFP,包装慢病毒,把获取的慢病毒感染细胞后通过荧光显微镜证实被感染的细胞绿色荧光蛋白正确表达,Western Blot检测证实其表达。结论：成功建立起FHL1C真核表达载体及慢病毒表达系统,为研究急性T淋巴细胞白血病与Notch信号转导通路之间的关系奠定了基础。     

LIM结构域蛋白FHL1C抑制Notch信号途径的转录激活研究

目的:克隆人表达FHL1C基因以及建立真核表达载体和慢病毒载体。方法:从人的骨骼肌细胞来源的cDNA中扩增并克隆人FHL1C基因的编码区,连接至pMD-18T载体酶切鉴定后测序。序列测定确认后,双酶切pMD18T-FHL1C回收片段,插入真核表达载体,构建真核表达载体pCMV-Myc-FHL1C酶切鉴定正确后,转染Hela细胞及Cos7细胞,用Western Blot检测其在转染细胞中的表达,用双荧光素报告基因系统检测其对Notch信号作用。构建FHL1C-IRES-GFP表达单元,建立慢病毒表达载体plen-ti6/V5-FHL1C-IRES-GFP,包装慢病毒后感染培养的细胞,用免疫荧光显微镜、Western Blot检测分析其在被感染的细胞中的表达。结果:通过PCR方法成功扩增了人FHL1C基因的编码区。通过转染Hela及Cos7细胞,使用Western Blot检测其蛋白水平表达,双荧光报告基因系统分析均能够下调激活的Notch信号。成功构建了FHL1C慢病毒表达载体pLenti6/V5-FHL1C-IRES-GFP,包装慢病毒,把获取的慢病毒感染细胞后通过荧光显微镜证实被感染的细胞绿色荧光蛋白正确表达,Western Blot检测证实其表达。结论:成功建立起FHL1C真核表达载体及慢病毒表达系统,为研究急性T淋巴细胞白血病与Notch信号转导通路之间的关系奠定了基础。     

慢病毒介导的HTRA1 基因稳定过表达人脑血管平滑肌细胞株的建立

目的:构建并包装针对HTRA1基因以及其1091TC突变基因(HTRA1-Mut)的过表达慢病毒载体,以及建立稳定表达HTRA1及HTRA1-Mut基因的人脑血管平滑肌细胞(HBVSMC)株。方法:采用RT-PCR方法扩增HTRA1及HTRA1-Mut基因片段并将其连接于GV287载体质粒,采用慢病毒包装三质粒系统(GV287/p Helper 1.0/p Helper 2.0)转染293T细胞,收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液并标定病毒滴度,慢病毒感染经培养和鉴定的HBVSMC细胞株。结果:成功构建含HTRA1及HTRA1-Mut基因的慢病毒重组载体,PCR鉴定阳性的克隆进行测序和BLAST比对分析显示与源基因序列一致,并能够有效的感染并在293T细胞中表达。表达载体包装后测定病毒滴度为:2E+8 TU/mL。过表达慢病毒感染后HBVSMC有荧光表达,并且荧光率达80%以上,细胞生长良好传后细胞几乎无死亡现象。结论:成功构建了过表达HTRA1及HTRA1-Mut基因的慢病毒表达载体,得到了较高滴度的病毒悬液,建成了稳定表达HTRA1及HTRA1-Mut基因的HBVSMC细胞株,为进一步探讨HTRA1基因及突变后细胞的功能变化提供了良好的研究工具。     

短发夹RNA慢病毒载体稳定抑制NLRP3表达的HepG2细胞的构建

目的:构建针对NLRP3基因的短发夹RNA(sh RNA)慢病毒表达载体,在Hep G2细胞中鉴定该载体对NLRP3的抑制效果。方法:设计针对NLRP3基因的sh RNA序列,将其插入慢病毒表达载体p WPT-U6-sh RNA-CMV-GFP中,将载体与包装质粒ps PAX2、p MD2.G共转染293T细胞,进行病毒包装;得到的病毒原液浓缩后系列稀释为9个浓度递减的病毒液,分别转染293T细胞后进行滴度测定;用获得的慢病毒液感染人肝癌细胞系Hep G2,获得稳定沉默NLRP3的细胞株;利用实时定量PCR和Western印迹检测稳定细胞株中NLRP3的沉默效应。结果:构建了具有沉默效应的慢病毒干扰载体;稀释法测定干扰病毒滴度为2×108TU/m L;实时定量PCR和Western印迹实验均证实慢病毒转染后,细胞株中NLRP3表达水平明显降低。结论:构建了人NLRP3基因特异性慢病毒干扰载体,获得NLRP3基因稳定干扰的Hep G2细胞株。     

利用Gateway技术构建慢病毒载体及其在鸡囊胚细胞中的表达

目的:建立慢病毒载体介导的外源基因在动物中表达的模式。方法:通过PCR扩增出带EGFP基因和特异性结合位点的DNA序列,并应用Gateway技术构建了带EGFP基因的pLenti6/v5-DEST慢病毒载体。利用磷酸钙介导慢病毒4质粒系统在包装细胞中转染,收集并浓缩产生的病毒颗粒,通过感染293FT细胞测定慢病毒滴度。结果:通过PCR扩增后测序分析,表明慢病毒载体构建正确。病毒滴度测定结果为2×107TU/mL。并用慢病毒对鸡囊胚细胞进行感染,获得了较强的表达效果。结论:慢病毒载体系统所产生的病毒颗粒对动物细胞具有较强的感染能力,为慢病毒载体在转基因家禽研究中的应用奠定了基础。     

慢病毒介导稳定表达MCM7、CDC6细胞株的建立

[目的]构建包装微小染色体维持蛋白7(Mcm7)、细胞分裂周期蛋白6(Cdc6)过表达慢病毒,并筛选Hep G2和LO2稳定过表达细胞株。[方法]通过PCR获得人的mcm7、cdc6基因,采用双酶切法构建重组慢病毒过表达载体。慢病毒过表达载体与ps PAX2、p MD2. G包装质粒共转染293T细胞后包装出慢病毒。慢病毒感染Hep G2和LO2后,通过有限稀释法筛选获得稳转细胞株,再经q PCR以及Western Blot鉴定过表达效果,FACS检测周期分布。[结果]成功构建并包装出了慢病毒,慢病毒滴度为1. 3×106TU/m L,感染Hep G2和LO2细胞后筛选获得稳转细胞株,并从mRNA和蛋白水平验证,Mcm7稳转株过表达效率超过0. 4倍,Cdc6稳转株过表达效率超12倍,稳转株周期分布与母代细胞没有显著差异(P 0. 05)。[结论]Mcm7、Cdc6稳转株构建成功,稳转株过表达效果明显,Mcm7、Cdc6的稳定过表达没有扰乱细胞周期进程。     

慢病毒GFP质粒的构建及脂质体介导鸡胚细胞中瞬时表达动力学初步研究

GFP(green fluorescent protein)是一种用于检测细胞的基因表达和蛋白定位的报告基因,pLenti6/V5-D-TOPO是高效的慢病毒类表达载体.实验利用PCR(polymerase chain reaction)从质粒pEGFP-N1中扩增了EGFP 基因片段,再利用高效、快速、定向的TOPO克隆法将扩增片段克隆到pLenti6/ V5-D-TOPO载体中,构建了既能高效转染细胞又能方便观察蛋白表达情况的pLEGFP重组载体.通过PCR法鉴定及瞬时转染,结果显示,GFP基因正确地插入载体中,并能够在Hela细胞及鸡胚X期细胞中瞬时表达,但重组和对照质粒瞬时转染效果存在明显差异.通过该研究证实分子量大小、质粒和脂质体比例是影响转染的关键因素,也为转基因的研究提供了一种方法.     

RNA干扰USE1基因慢病毒载体的构建及鉴定

旨在构建泛素结合酶USE1基因的RNA干扰慢病毒载体,并在细胞中检测该基因的抑制表达水平,以期寻找Uba6-USE1特异性泛素化通路对应的下游底物并研究其功能。选取并合成靶向USE1基因的特异性shRNA序列,将其克隆至pLL3.7慢病毒抑制表达载体上,构建抑制USE1基因表达的重组慢病毒质粒并鉴定。将鉴定成功的重组质粒与psPAX2、VSVG慢病毒包装载体共转染至HEK-293细胞,收集病毒上清,测定病毒滴度并确定最佳感染稀释倍数,通过qPCR和Western Blot方法检测病毒感染HEK-293细胞后对USE1基因的抑制程度,获得能有效抑制USE1基因的慢病毒上清。结果显示,成功构建3种靶向USE1基因的RNA干扰慢病毒载体,获得滴度符合要求的3种慢病毒包装上清液,感染HEK-293细胞后发现,第2、3号shRNA序列均有明显抑制表达USE1基因效果,基因表达抑制率约50%(*P0.05)。利用RNA干扰技术成功构建了特异性抑制泛素结合酶USE1基因表达的慢病毒载体,并经mRNA和蛋白水平检验得到2种能够显著抑制USE1表达的慢病毒上清及其shRNA序列。