弱激光对大鼠海马神经元钠通道特性的影响

利用波长670nm、功率5mW的半导体激光器照射急性分离的大鼠海马CA3区锥体神经元,应用全细胞膜片钳技术研究其电压门控Na 通道的特性.实验发现:弱激光作用5min时,Na 通道激活电位和峰值电位开始向负电位方向移动,7min激光作用达稳定;激光照射对Na 通道电流峰值无影响,对照组和激光照射组峰值电流密度分别为(-383.51±26.93)pA/pF和(-368.36±33.14)pA/pF(n=8,P>0.05);激光作用降低了Na 通道的激活阈值电位和峰值电位,对照组通道电流在-40mV激活,-30mV达峰值,激光照射组通道电流在-60mV激活,-40mV达峰值;激光照射改变了Na 通道半数激活电压和斜率因子,对照组和激光照射组的半数激活电压分别为(-42.091±1.537)mV和(-54.971±1.846)mV(n=8,P<0.01),斜率因子分别为(1.529±0.667)mV和(2.634±0.519)mV(n=8,P<0.05).结果表明,弱激光照射海马神经元可改变Na 通道的激活特性,从而影响动作电位的去激化过程,进而会引起神经元细胞生理功能发生变化.     

KCNJ11基因E23K基因多态对纽胞膜电流的影响

目的：KCNJ11基因E23K多态与心血管疾病、糖尿病等相关联,本实验通过研究人KCNJll基因外显子处E23K多态对细胞膜电流密度的影响,探讨其与相关疾病关联的机制。方法：普通PCR法扩增KCNJll基因外显子,重叠延伸PCR法使多态位点G—A突变,基因重组法将KCNJll基因外显子（分别含23E和23K等位基因）插入pcDNA3．1／Cr-GFP真核表达载体,脂质体转染法分别将重组质粒pcDNA3．1-KCNJll（E）和pcDNA3．1-KCNJll（K）转入HEK293T细胞。采用全细胞膜片钳技术,检测转染不同质粒的细胞膜电流密度。结果：PCR扩增获得长度为1173bp的KCNJll基因外显子,成功构建pcDNA3．1-KCNJ11（E）和pcDNA3．1-KCNJll（K）重组表达载体。全细胞膜片钳检测结果显示,两组转染不同质粒的HEK293T细胞表面均检测到正电流和负电流,细胞表面翻转电压均为50rTlV。两组细胞相比,转染pcDNA3．1-KCNJ11（E）质粒的细胞表面电流明显高于转染pcDNA3．1-KcNJ11（K）质粒的细胞（P〈0．05,n=10）。结论：KCNJll基因外显子E23K多态能导致细胞膜电流发生改变,为进一步研究多态位点与相关疾病的关联机制提供实验基础。     

稳定表达hHCN2基因 HEK293细胞系的建立

目的：培育稳定表达hHCN2基因的细胞系,建立一种表达研究心肌离子通道的有效模型。方法：通过脂质体转染的方法,将重组pcDNA3-hHCN2真核表达载体导入人胚肾细胞（HEK293细胞）,以G418压力筛选转染细胞,并对其进行全细胞膜片钳记录。结果：经600μg／ml压力筛选后,获得抗性细胞克隆,并用全细胞膜片钳技术记录到克隆hHCN2通道编码电流。结论：本实验采用脂质体转染法成功地培育出G418抗性HEK293细胞。为进一步研究克隆离子通道结构和功能的关系奠定基础。     

急性缺氧增强豚鼠小脑前下动脉平滑肌细胞外向电流并抑制缝隙连接

本文旨在研究急性缺氧对微动脉血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)膜电生理特性的影响。分离出豚鼠小脑前下动脉(anterior inferior cerebellar artery,AICA)段,胶原酶A消化后用显微镊去除微动脉外层结缔组织,然后给予无糖低氧的灌流液,同时应用全细胞膜片钳技术观察VSMCs膜电流的变化。结果显示:(1)当钳制电压在40mV时,急性缺氧引起一个反应幅度为(36.4±9.2)pA的外向电流,细胞静息膜电位从(33.2±1.9)mV超极化到(38.4±1.5)mV。急性缺氧电压依赖性地增强VSMCs外向电流,主要增强0～+40mV电压区间的激活电流幅度,+40mV激活电流幅度从(650±113)pA增加到(1900±197)pA。背景灌流K+通道阻断剂tetraethylammonium(TEA,1mmol/L)后,急性缺氧对VSMCs外向电流的增强作用显著减小。(2)急性缺氧使AICA上VSMCs的细胞膜电阻(R input)从(234±63)MΩ增加到(1211±201)MΩ,细胞膜电容(C input)从(279.3±83.2)p...     

HERG钾通道在细胞容量调节中的作用

目的:研究HERG钾通道在细胞容量调节中的作用,并探讨其作用机制。方法:全部试验应用稳定转染HERG-HEK293细胞和HEK293细胞。应用全细胞膜片钳技术记录HERG钾电流。结果:1当HERG-HEK293细胞处于低渗状态,指令电压为0 mV时,Istep增加60%(n=12,P0.05);如指令电压为+30 mV,Itail增加72.1%(n=11,P0.01),增大的HERG电流可被特异性HERG钾电流阻断剂Cisapride(100nM)抑制,Istep被抑制97.2%(n=6,P0.01),Itail被抑制174.1%(n=6,P0.01)。2在低渗状态,指令电压为0 mV时,容量调节性氯通道阻断剂尼氟灭酸(NFA,10 nmol/L)使Istep抑制46.2%(n=12,P0.01),Itail抑制48.5%(n=11,P0.01);给以容量调节性氯通道阻断剂DIDS 100μmol/L时,Istep抑制45.9%(n=12,P0.01),Itail抑制51.1%(n=11,P0.01)。结论:HERG通道部分参与调节性细胞容量下降过程。其参与的细胞容量调节与容量调节性氯通道的激活相伴随。     

自发性高血压大鼠和Wistar大鼠淋巴细胞Kv通道表达差异

本研究采用全细胞膜片钳技术、实时荧光定量PCR技术及Western blot技术检测自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat,SHR)和Wistar大鼠外周血淋巴细胞电压依赖性钾通道(voltage dependent potassium channel,Kv)电流密度及Kv1.3mRNA和蛋白表达水平,探讨淋巴细胞Kv通道在高血压病中的变化,为高血压病淋巴细胞激活提供证据。结果显示:(1)SHR淋巴细胞Kv峰值(取自阶跃电压中+60mV)电流密度为(119±10)pA/pF(n=30),Wistar大鼠为(56±9)pA/pF(n=40),SHR淋巴细胞Kv峰值电流密度明显高于Wistar大鼠(P0.05);(2)与Wistar大鼠相比,SHR淋巴细胞Kv1.3 mRNA表达增多(P0.05);(3)SHR淋巴细胞Kv1.3蛋白表达水平高于Wistar大鼠(P0.05)。结果提示,SHR淋巴细胞上有更多功能性Kv通道,Kv通道可能与SHR淋巴细胞激活有关。     

人P2X7真核表达载体的构建及稳定转染细胞株的建立

目的：构建人P2X7基因的真核表达载体,并通过转染获得稳定表达P2X7分子的HEK293细胞株。方法：以人脑组织P2X7cDNA为模板扩增出P2X7基因,插入到真核表达载体pEGFP-N1中,构建重组质粒pEGFP-N1/P2X7。用X-fect试剂盒将重组质粒转染HEK293细胞,通过G418辅助荧光筛选建立稳定表达P2X7-EGFP细胞株。经流式细胞仪、Western blot和激光共聚焦显微镜检测,了解人P2X7在HEK293细胞中的表达水平及细胞内定位。结果：重组质粒pEGFP-N1/P2X7构建正确,建立了稳定表达人P2X7的HEK293细胞系。Western blot和流式细胞仪检测证实,P2X7在HEK293细胞系中成功表达,激光共聚焦显微镜检测显示P2X7-EGFP定位在细胞膜上。结论：重组载体pEGFP-N1/P2X7构建成功并建立了稳定表达人P2X7的HEK293细胞系,为进一步研究P2X7离子通道结构和功能奠定基础。     

成年蜜蜂脑神经细胞的培养和电生理特征

为了研究杀虫剂等对蜜蜂毒性作用的神经机制,需在体外建立成年蜜蜂脑神经细胞的分离培养和电生理记录技术并研究其正常电生理特征,而对成年蜜蜂脑神经细胞的分离培养和电生理特性的研究报道甚少。我们采用酶解和机械吹打相结合的方法获得了数量较多且活力较好的成年意大利蜜蜂Apis mellifera脑神经细胞,并用全细胞膜片钳技术研究了成年意大利蜜蜂脑神经细胞对电流和电压刺激的反应,获得了成年意蜂脑神经细胞的基本电生理特征以及钠电流和钾电流的特性。全细胞电流钳的记录结果表明,在体外培养条件下,细胞无自发放电发生,注射电流后仅引起细胞单次放电,引起细胞放电的阈电流平均为60.8±63 pA; 细胞动作电位产生的阈电位平均为−27.4±2.3 mV。用全细胞电压钳记录了神经细胞的钠电流和钾电流。钠电流的分离是在电压刺激下通过阻断钾通道和钙通道实现。细胞的内向钠电流在指令电压为−40～−30 mV左右激活,−10 mV达峰值,钠通道的稳态失活电压V_1/2为−58.4 mV; 外向钾电流成份至少包括较小的快速失活钾电流和和较大的缓慢失活钾电流（占总钾电流的80%）,其半激活膜电位V_1/2为3.86 mV,无明显的稳态失活。结果提示缓慢失活钾电流的特征可能是细胞单次放电的机制之一。     

大鼠肥厚心肌细胞钙电流及 Na~ /Ca~(2 )交换电流的研究(英文)

本文观察了心肌肥厚对大鼠心肌细胞Na ／Ca2 交换电流的影响。我们采用Goldblatt两肾一夹方法诱发大鼠心肌肥厚,应用全细胞膜片钳技术记录电流。结果表明：肥厚心肌细胞的Ni2 -敏感Na ／Ca2 交换电流密度大于正常细胞。在钳制电压为＋50mV时,正常细胞的外向交换电流密度为1．53±0．31pA／pF,而肥厚细胞则为2．62±0．53pA／pF（P＜0．01）;钳制电压为-100mV时,正常细胞的内向交换电流密度为0．42±0．14pA／pF,肥厚细胞达1．12±0．33pA／pF（P＜0．001）。这些结果提示,肥厚心肌细胞的Na ／Ca2 交换电流发生了改变,其意义有待进一步探讨。     

大鼠CB1基因真核表达载体的构建及其对CaSki细胞凋亡的影响

目的构建大鼠CB1(r CB1)基因真核表达载体,检测r CB1基因在细胞中的表达,研究r CB1对人宫颈癌Ca Ski细胞凋亡的影响。方法从大鼠脑组织中提取总RNA,RT-PCR扩增r CB1基因,通过酶切、纯化、连接PCR纯化产物与p CDNA 3.1(+)质粒,构建pc DNA3.1(+)-r CB1。脂质体法将其转染到HEK293和Ca Ski细胞,Western blot及细胞免疫荧光联合激光扫描共聚焦方法检测r CB1的表达及定位,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western blot与实时荧光定量PCR检测r CB1、Bcl-2、Bax、Bad表达。结果酶切重组质粒获得5300 bp的载体片段和1500 bp的目的片段,测序结果和r CB1基因序列(NM_012784.4)一致。转染HEK293细胞后,r CB1在HEK293细胞细胞膜和细胞质表达。转染Ca Ski细胞后,r CB1使细胞凋亡率增加(P0.05);r CB1基因上调Bax、Bad的表达,同时抑制Bcl-2的表达,与空白组比较,其差异具有显著性(P0.05)。结论成功构建了pc DNA3.1(+)-r CB1真核表达载体,r CB1表达于细胞膜和细胞质,r CB1可以明显促进宫颈癌Ca Ski细胞凋亡,其机制是上调Bax、Bad和抑制Bcl-2表达。     

hKCNE4 inhibits the hKCNQ1 potassium current without affecting the activation kinetics

All five members of the KCNE beta-subunit family are capable of modulating the KCNQ1 potassium current. We have previously published that the murine variant of KCNE4 inhibits the human KCNQ1 current [J. Physiol. 542 (2002) 119]. Recently, this finding has been challenged by Teng et al., stating that the human variant of KCNE4 does not attenuate the KCNQ1 current but does slightly modulate the activation kinetics of the channel after expression in Xenopus laevis oocytes [Biochem. Biophys. Res. Commun. 303 (2003) 808]. In the present study, a detailed investigation on the ability of human and murine KCNE4 to affect either human or murine KCNQ1 currents has been performed. We find that the hKCNE4 subunit drastically inhibits the hKCNQ1 current after expression in X. laevis oocytes. This inhibitory effect is also observed for both hKCNE4 and mKCNE4 when either of these subunits is co-expressed with mKCNQ1. Analyses of the current properties of hKCNQ1 revealed that activation kinetics are independent of the presence of hKCNE4. hKCNE4 has, however, the ability to prevent the inactivation observed for the KCNQ1 current. Based upon previous studies and the present results, it is concluded that both hKCNE4 and mKCNE4 have a drastic inhibitory impact on both hKCNQ1 and mKCNQ1 currents.     

Modeling of the adrenergic response of the human IKs current (hKCNQ1/hKCNE1) stably expressed in HEK-293 cells

Stable coexpression of human (h)KCNQ1 and hKCNE1 in human embryonic kidney (HEK)-293 cells reconstitutes a nativelike slowly activating delayed rectifier K+ current (HEK-I(Ks)), allowing beta-adrenergic modulation of the current by stimulation of endogenous receptors in the host cell line. HEK-I(Ks) was enhanced two- to fourfold by isoproterenol (EC50 = 13 nM), forskolin (10 microM), or 8-(4-chlorophenylthio)adenosine 3',5'-cyclic monophosphate (50 microM), indicating an intact cAMP-dependent ion channel-regulating pathway analogous to the PKA-dependent regulation observed in native cardiac myocytes. Activation kinetics of HEK-I(Ks) were accurately fit with a novel modified second-order Hodgkin-Huxley (H-H) gating model incorporating a fast and a slow gate, each independent of each other in scale and adrenergic response, or a "heterodimer" model. Macroscopically, beta-adrenergic enhancement shifted the current activation threshold to more negative potentials and accelerated activation kinetics while leaving deactivation kinetics relatively unaffected. Modeling of the current response using the H-H model indicated that observed changes in gating could be explained by modulation of the opening rate of the fast gate. Under control conditions at nearly physiological temperatures (35 degrees C), rate-dependent accumulation of HEK-I(Ks) was observed only at pulse frequencies exceeding 3 Hz. Rate-dependent accumulation of I(Ks) at high pulsing rate had two phases, an initial staircaselike effect followed by a slower, incremental accumulation phase. These phases are readily interpreted in the context of a heterodimeric H-H model with two independent gates with differing closing rates. In the presence of isoproterenol after normalizing for its tonic effects, rate-dependent accumulation of HEK-I(Ks) appeared at lower pulse frequencies and was slightly enhanced (approximately 25%) over control.