随机聚合酶链反应检测未知病毒方法学的建立

目的 探索并建立一种用于快速检测未知病毒的分子生物学方法。 方法 分别以乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus, HCV）为假定的未知DNA、RNA病毒,验证随机聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）检测未知病毒的可行性。分离HBV、HCV的阳性血清,去除宿主DNA后,提取病毒核酸。锚定随机引物经Klenow酶处理（模板为DNA）或反转录酶作用（模板为RNA）退火至模板,随后用锚定特异引物对模板进行非特异性扩增。扩增产物经纯化后克隆、测序,最后与BLAST进行比对。结果 经BLAST比对证实,插入序列中有HBV和HCV的基因组片段,在病毒拷贝数为1&;#61620;106拷贝/ml时,被检测克隆的阳性率约为15%。目前我们利用本法能达到的检测低限大致为1&;#61620;104拷贝/ml。 结论 成功建立了一种基于随机PCR的未知病毒检测方法,其优点在于不依赖病毒的细胞培养及其核酸序列信息。此种方法的建立为快速诊断不明原因疾病和新发传染病病原体提供了新的思路。     

逆转录聚合酶链反应检测Ⅱ型登革病毒基因

本文应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测Ⅱ型登革病毒基因。所设计引物在E基因区,引物1位于碱基序列的1566—1586,引物2位于1437—1458。引物在黄病毒属中为Ⅱ型登革病毒特有,它是Ⅱ型各株保守区。反应产物为150bp,内含一个HindⅢ酶位点,酶切后有111bP和39bp两个片段。使用本法对一系列稀释的培养液进行检测,可检出少至5TCID_(50)的病毒RNA。此外还检测了10份经病毒分离与免疫萤光分型证实为Ⅱ型登革热病人的血清和14份疑似Ⅱ型登革热病人但病毒分离阴性的急性期血清。证明本法敏感性明显高于病毒分离。     

应用聚合酶链反应检测口蹄疫病毒的实验研究

聚合酶链反应用于直接检测口蹄疫病毒(FMDV),可快速、灵敏地检出乳鼠组织或细胞繁殖的病毒的核酸。其灵敏度可达0.062pg,整个检测过程可缩短至4～5个小时内完成,比其它检测方法都敏感和快速。本文还探讨了直接用PCR扩增合成生物素化核酸探针检测口蹄疫病毒核酸的存在。     

聚合酶链反应技术检测沙门菌的研究进展

聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术用于沙门菌检测发展迅速,本文就：①沙门菌检测中的引物设计;②沙门菌ＤＮＡ提取方法;③检测沙门菌的ＰＣＲ方法;④ＰＣＲ扩增产物的检测;⑤各种ＰＣＲ方法检测沙门菌的特异性、敏感性及注意事项等方面简述该技术在沙门菌检测中的应用进展。     

PCR法快速检测临床标本中结核杆菌DNA

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）快速检测临床标本（脑脊液、胸水、腹水、血、痰液）中的结核杆菌ＤＮＡ,特异性扩增片段１２３ｂｐ,为结核杆菌的特异性重复序列ＩＳ６１１０部分基因。ＰＣＲ检测人型结核杆菌的敏感性达１０ｆｇＤＮＡ。临床标本的ＰＣＲ检测阳性率（２３．３％）明显高于抗酸染色涂片（２．９％）和细菌培养（５．７％）的阳性率（Ｐ〈０．０５）。通过设立对照系统及对扩增产物酶切分析,表明该法无假阴性结果（特异     

用聚合酶链反应检测产蛋下降综合症病毒核酸的研究

根据对ＥＤＳ－ＤＮＡ重组质粒ｐＴＥＺＰ３和ｐＴＥＺＰ２８的核酸序列分析结果,设计了两对引物,它们均能从ＥＤＳ－ＤＮＡ上扩增出一个特异片段,其长度分别为２３８ｂｐ和２０９ｂｐ。经比较,ＰＣＲ比血球凝集试验至少灵敏２００倍,比核酸杂交试验灵敏千万倍,对１００份自然发病鸡的肛拭子,血液和软壳蛋样品的检测结果表明;ＰＣＲ的阳性出率远高于酸杂交试验,并用病毒分离方法证实了ＰＣＲ对野外病料的检出结果是可信的。     

逆转录——聚合酶链反应技术诊断丙型肝炎病毒感染

本文采用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术对２１２例住院及门诊病人其中肝病患者９８例（慢性肝炎４３例、肝炎后肝硬化４７例、原发性肝细胞癌８例）进行ＨＣＶ－ＲＮＡ检测。结果９８例慢性肝病患者血清中ＨＣＶ－ＲＮＡ－ＰＣＲ阳性２７例（２７．６％）,１１４例非肝病患者血清中ＨＣＶ－ＲＮＡ－ＰＣＲ阳性９例（７．９％）,两组间差异非常显著（Ｐ〈０．０１）,各种肝病患者的ＨＣＶ－ＲＮＡ－ＰＣＲ阳性率均高于     

三重聚合酶链反应检测STD病原体

本文对100例性罪错人员应用三重聚合酶链反应（PCR）一次扩增快速检测淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体混合感染,三种病原体的检出率分别为24％、38％、37％,混合感染率为22．22％,提示在STD诊治中必须重视多种病原体混合感染．另外,对三重PCR法与常规方法和经典PCR进行比较有良好的符合率,显示其在临床检测方面的优势。     

聚合酶链反应(PCR)用于丙肝病毒的检测研究

丙型肝炎是一种严重危害人们健康的传染性疾病之,如何提高其确诊率是近年来流行病学及基础医学研究的热门课题,本文就聚合酶链反应(PCR)技术应用于丙型肝炎研究方面的进展作一综述。     

多聚酶链反应技术诊断结核病的进展

多聚酶链反应（ＰＣＲ）技术在结核病诊断上发展迅速。本文就①结核菌ＤＮＡ提取技术;②引物的设计;③用于诊断结核的ＰＣＲ方法;④ＰＣＲ产物的检测方法;⑤ＰＣＲ的敏感性和特异性;⑥ＰＣＲ临床应用和注意事项等方面,简述该技术在结核病诊断中应用的进展和需要进一步研究的问题。     

聚合酶链反应技术在脑脊液病毒学诊断中的应用

近年来中枢神经系统病毒感染性疾病发病率上升,确诊的主要依据是脑脊液的病原学诊断,但脑认中病毒含量甚低,其病毒培养检测不但费时,费力,而且敏感性和特异性很差,远远不能满足临床要求,建立在聚合酶链反应技术基础上的各种分子生物学诊断技术,逐渐成为生物医学领域最有价值的研究手段和病毒学诊断方法,已经越来越多地应用于中枢神经系统病毒学的基因诊断,本文对近几年聚合酶链反应技术的研究进展进行了综述。     

精子介导鱼类基因转移和聚合酶链反应检测技术

金鱼精子与美洲大绵ｗｅｉ的抗冻蛋白基因一起保温３０分钟后,再与卵子受精,共获得１４５尾成鱼和若干胚胎。从胚胎和成鱼中提取ＤＮＡ经聚合酶链反应（ＰＣＲ法）扩增和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分子杂交表明,外源的抗冻蛋白基因进入了部分受体鱼的染色体组内。测定了４５尾一年龄实验鱼中,有１２尾显示出明确的杂交带,阳性率为２６％。     

聚合酶链反应筛选阳性重组体

聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术已广泛用于ＤＮＡ基础研究和临床诊断。本文介绍用它来鉴定靶序列，从而进一步筛选阳性重组体。由于引物Ｔｍ较高，采用二温段扩增法，确实扩增出１０ｂｐ靶序列。文章还讨论了扩增较小片段要注意的条件。     

聚合酶链反应在牛血清支原体检测中的应用

为了探讨聚合酶链反应在牛血清支原体检测上的应用价值,以支原体高度保守的rRNA操纵子(支原体基因组中16SrRNA的编码区序列)设计引物,采用碱裂解法提取牛血清中支原体DNA作为模板进行聚合酶链反应。结果表明,阳性、阴性和内控对照都扩增出了预期的条带,聚合酶链反应与支原体培养法比较,有灵敏、快速、特异性高的特点,可用于牛血清中支原体的常规检测。