鸭胚胎干细胞分离与鉴定

采用药勺法分离仙湖3号肉鸭鸭胚的胚盘细胞,并以鸭胚成纤维细胞作为饲养层,培养鸭胚胎干细胞。在此基础上,通过对体外培养的鸭胚胎干细胞形态观察,碱性磷酸酶染色(AKP)以及胚胎阶段表面特异性抗原(SSEA-1)免疫组化等方法,分离与鉴定鸭胚胎干细胞。结果表明传至第3代的鸭胚胎干细胞经AKP和SSEA-1鉴定均为阳性,AKP染色为深蓝色,SSEA-1染色呈绿色荧光,表明培养至第3代的鸭胚胎干细胞仍保持干细胞未分化特性,具有胚胎干细胞的特征。结果提示本试验分离、培养的鸭胚盘细胞为鸭胚胎干细胞。     

新型鸭呼肠孤病毒的分离与鉴定

本研究从临床表现为出血性坏死性肝炎的病死鸭肝脾中分离到病毒。病原特性鉴定显示,分离毒能致死番鸭胚和鸡胚;人工感染1日龄雏番鸭、雏半番鸭均能复制出与临床自然发病鸭相同的临床症状和病理变化,并能回收到病毒。分离毒能在MDEF等多种细胞中增殖并产生细胞病变。电镜下病毒在细胞浆中呈大量散在、成堆和晶格状排列,病毒粒子呈球形、无囊膜、双层衣壳、直径70nm左右。在SDS-PAGE中具有禽呼肠孤病毒10个RNA片段的特征,但M1-3和S1-4片段的迁移率明显不同于番鸭呼肠孤病毒(MDRV)。分离毒S3基因全序列与禽呼肠孤病毒(ARV)、火鸡呼肠孤病毒(TRV)和MDRV的核苷酸同源性分别为60%～60.2%,61.9%,62.3%～62.7%,氨基酸同源性分别为68.2%～69%,68.2%,69.3%～70.1%;S3基因编码的σB蛋白属于单独的进化分支,提示分离毒S3基因具有不同于ARV和MDRV的特征。结果表明鸭出血性坏死性肝炎的病原是一种属于呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属新型鸭呼肠孤病毒。     

鹅源鸭疫里默氏杆菌的分离、鉴定与生物学特性研究

【目的】从疑似鸭疫里默氏杆菌病的病死雏鹅分离病原菌进行鉴定。【方法】根据细菌培养特性、生化特性、动物试验、血清型鉴定及分子生物学特性对分离菌株进行鉴定。【结果】分离菌株为革兰氏阴性菌,不发酵糖类和醇类,尿素酶试验和氧化酶还原试验为阳性,致病,不同分离株的16S rRNA基因经多重序列比对分析,结果显示鹅源分离株与鸭源鸭疫里默氏杆菌处于同一进化支上,与鸡源鸭疫里默氏杆菌进化关系稍远,血清型鉴定为1型。【结论】分离菌株为血清1型的鸭疫里默氏杆菌,对鸭和鹅均有高致病性,自家疫苗能够较好地保护雏鹅。     

鸭细小病毒04Nb株的分离鉴定与rep基因测序与分析

采集浙江宁波地区以腹泻、呼吸困难为主要症状的病鸭肝组织,接种正常鸭胚尿囊腔增殖病毒.雏鸭感染试验显示发病症状及病理变化明显,死亡率为75%.电镜下可见纯化病毒直径约20nm左右的球形病毒粒子.免疫琼脂扩散实验结果显示与鸭细小病毒(duckparvovirus DPV)标准株阳性血清有明显沉淀线.经SDS-PAGE呈现3条结构蛋白带,与DPV标准株一致;参照GenBankDPV非结构蛋白基因序列设计引物,PCR扩增反应获得目的条带,克隆测序后,与DPV代表株序列同源性达98%.根据上述实验结果,确定引起本次鸭场疫病的病原为DPV.为进一步研究该分离株rep基因的序列特征,对其rep基因克隆测序,与GenBank中两株DPV、两株鹅细小病毒(GPV)进行序列比对,结果显示rep基因核苷酸序列与DPV参考毒株同源性为98%以上,与GPV同源性为80%左右.     

鸭细小病毒04Nb株的分离鉴定与rep基因测序与分析

采集浙江宁波地区以腹泻、呼吸困难为主要症状的病鸭肝组织,接种正常鸭胚尿囊腔增殖病毒。雏鸭感染试验显示发病症状及病理变化明显,死亡率为75%。电镜下可见纯化病毒直径约20nm左右的球形病毒粒子。免疫琼脂扩散实验结果显示与鸭细小病毒(duckparvovirusDPV)标准株阳性血清有明显沉淀线。经SDS-PAGE呈现3条结构蛋白带,与DPV标准株一致;参照GenBankDPV非结构蛋白基因序列设计引物,PCR扩增反应获得目的条带,克隆测序后,与DPV代表株序列同源性达98%。根据上述实验结果,确定引起本次鸭场疫病的病原为DPV。为进一步研究该分离株rep基因的序列特征,对其rep基因克隆测序,与GenBank中两株DPV、两株鹅细小病毒(GPV)进行序列比对,结果显示rep基因核苷酸序列与DPV参考毒株同源性为98%以上,与GPV同源性为80%左右。     

鸭疫里默氏杆菌流行菌株的分离鉴定及生物学特性

【背景】鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)是引起雏鸭、鹅、火鸡等多种家禽、野禽发生传染性浆膜炎的病原,在全世界范围内广泛存在,危害养禽业发展,造成严重的经济损失。【目的】了解国内RA的流行现状,探究该菌的生物学特性,更好地指导防控鸭疫里默氏杆菌病。【方法】对2020-2021年从山东省、河北省、广东省、山西省等地分离的RA疑似菌株进行PCR、生化和血清型鉴定,并根据药物敏感性结果分析耐药现象,根据半数致死量(median lethal dose,LD₅₀)测定结果分析致病力差异。【结果】共鉴定78株RA分离株,其中,血清1型4株、2型21株、10型11株、6型3株、7型17株,1株有交叉凝集现象,21株血清型未定型;药敏结果显示78株分离株对多粘菌素B、磷霉素、克林霉素等的耐药性最强,对头孢拉定、多西环素、呋喃唑酮、氟苯尼考等抗生素最为敏感,并且78株分离株均存在多重耐药性,其中77株耐药5重及以上;动物试验结果显示,RA的分离株致病力普遍较强,而且不同地区分离株、同地区不同分离株之间均存在差异,数株RA分离株的LD₅₀在10⁴-10⁷ CFU不等。【结论】RA在国内流行表现了强致病力及严重耐药情况,本研究结果为更好地预防控制、临床用药及后续致病机制研究提供了参考依据。     

四川省鸭坦布苏病毒的分离鉴定及遗传进化分析

本研究从四川省什邡市某发病养鸭场采集到疑似鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu virus,DTMUV）感染的病料,将病料组织研磨,无菌处理后接种鸭胚连续传代培养,分离获得一株病毒,并通过PCR鉴定以及电镜形态观察,确定该分离株为黄病毒属坦布苏病毒,命名为SCS01。将SCS01株全基因组进行PCR分段扩增测序发现,SCS01株全基因组全长为10 992bp。在线BLAST比对检索,结果显示,SCS01株全基因组与国内鸭源坦布苏分离株同源性最高可达97.94%,进化树分析显示,SCS01株属于中国流行I群毒株,与多数分离自北方地区的中国II群毒株相比,具有较为明显的地方特性。分离株与所有参考毒株的E基因核苷酸和氨基酸相似性均在90%以上,其中与重庆分离株CQW1的相似性最高。这一鸭源坦布苏病毒的分离及其全基因组的测定为进一步探究坦布苏病毒的地区流行提供了材料。     

北京鸭胚胎后肾间充质干细胞分离培养及鉴定

建立禽类后肾间充质干细胞(Metanephric mesenchymal stem cells,MMSCs)体外培养体系,研究其生物学特性和多向分化潜能。采用酶消化法分离北京鸭胚胎MMSCs,绘制生长曲线,通过免疫荧光和RT-PCR对MMSCs进行鉴定,诱导MMSCs向脂肪细胞和胰岛细胞分化。结果表明,鸭胚胎MMSCs具有良好的增殖活力,表达间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)特异性标志物,并诱导分化为脂肪细胞和胰岛细胞。北京鸭胚胎MMSCs在体外具有较强的自我更新能力及多向分化潜能,可作为组织工程的种子细胞进行保存。     

番茄化学成分的分离与鉴定

采用机械破碎法和果胶酶酶解法,使成熟番茄果实细胞内含物充分释放,上清液经D-101大孔树脂富集吸附后,再经一系列柱色谱分离得到6个化合物,根据其理化性质和波谱分析,分别鉴定为:芦丁(1)、槲皮素(2)、木犀草素(3)、番茄皂苷A(4)、豆甾醇(5)、熊果酸(6)。其中,化合物1、2、3、5、6为首次从该植物中分离得到。     

红花化学成分的分离与鉴定

目的:对菊科植物红花(carthmus tinctorius L.)的干燥花的化学成分进行研究。方法:运用硅胶柱色谱﹑Sephadex LH-20柱色谱﹑ODS柱色谱、制备HPLC等分离手段进行化学成分的分离纯化,根据理化性质及波谱数据鉴定其结构。结果:从红花体积分数70%乙醇水溶液的提取物中分离得到3个化合物,分别鉴定为(+)-松脂酚((+)-pinoresinol)(1)(+)-表松脂酚((+)-epipinoresinol)(2)槲皮素(3)结论:化合物1、2为首次从红花属植物中分离得到。     

预知子化学成分的分离与鉴定

研究预知子中的非三萜类化学成分。综合运用大孔吸附树脂HP-20、Sephadex LH-20、硅胶柱色谱、反相硅胶柱色谱及高效液相等色谱方法进行分离纯化,利用波谱学方法对得到的化合物进行结构鉴定。从预知子甲醇提取物中分离鉴定了14个非三萜类化合物:酪醇(1)、咖啡酸(2)、原儿茶酸(3)、对羟基苯甲酸(4)、阿魏酸(5)、红景天苷(6)、羟基酪醇葡萄糖苷(7)、反式松柏苷(8)、紫丁香苷(9)、木通苯乙醇苷B(10)、3-咖啡酰基奎宁酸(11)、4-咖啡酰基奎宁酸(12)、5-咖啡酰基奎宁酸(13)、1,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸(14)。其中,化合物5～10、12～14为首次在预知子中得到。     

仙客来病毒的分离与鉴定

仙客来(cyclanaen Persicum Mill),是一种中外闻名的珍贵花卉,近年来,因患病致使花叶变型,品种退化,严重时则完全丧失观赏价值,以致影响出口。1982年我们从天津花圃中,首次从自然发病的仙客来分离到一株病毒,现经鉴定为黄瓜花叶病毒(简称 CMV—CP)。试验材料和方法试验是在防虫温室中进行。用于栽培寄主植物的花盆和土壤均经高温消毒。     

樱草花叶病毒的分离与鉴定

樱草(Primula obconica),又称报春花,是早春季节人们喜爱的一种花卉。近年来,患病严重,病株的叶片呈现花叶、畸型、翻卷等症状,影响观赏。关于樱草花叶病毒在国内未见报道。本文简要报道樱草花叶病毒的分离与鉴定(以下简称PMV)。     

鸭β-防御素5基因的分离、鉴定及其生物学作用

为克隆与表达鸭β-防御素5 (AvBD5)基因及测定其生物学特性,采用RT-PCR方法从鸭肺脏组织中扩增到鸭AvBD5,将测得的序列与已发现的禽β-防御素和部分哺乳类动物β-防御素的氨 基酸序列构建进化树进行同源性分析.结果显示鸭AvBD5 cDNA大小为201 bp,编码66个氨基酸残基,内含6个位置保守的半胱...     

肠道病毒ECHO13中国分离株的基因特征

为研究ECHO13病毒中国分离株的分子特征及其与世界其它分离株之间的基因关系,对1998年、2000年从中国福建省分离到2株ECHO13病毒进行基因序列对比分析.2株病毒分别命名为Fujian98-1和Fujian00-1,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出VP1蛋白编码基因全长861个核苷酸片段并进行序列测定,将2株ECHO13病毒的VP1序列与所有已发表的ECHO13病毒VP1基因全长进行同源性比较.结果显示,福建分离株之间核苷酸同源性为79.6%,氨基酸同源性为93.4%;与遗传距离最近的法国CF1089-91(AJ537604)毒株的核苷酸同源性分别为80%和88%,与代表株Del Carmen的核苷酸同源性分别为75.8%和77.9%.通过VP1基因分析,福建2株病毒均属于ECHO13病毒,与血清中和试验鉴定结果一致.下载所有已发表的ECHO13病毒VP1序列并构建进化树,发现福建2株病毒分属不同的分枝,提示这2株病毒来自不同的病毒传播链.进一步分析发现,整个ECHO13病毒可划分为3个不同的基因型:A、B和C基因型.福建Fujian98-1和Fujian00-1分别被划分在基因型B和C中,各基因型之间的核苷酸差异均大于20%.为验证该分型方法,将26株来自不同国家和时间的ECHO13病毒和2株福建分离ECHO13病毒部分VP1基因序列进行对比分析,建立进化树.结果显示,所有ECHO13病毒被分在A、B和C3个基因型中,而2株福建分离病毒仍然被分在B和C基因型中.除了B基因型1株病毒以外,所有3个基因型之间的核苷酸差异均大于15%,与VP1全长分型结果基本一致,说明部分VP1序列的基因分析也能用于对ECHO13病毒进行规律和分子流行病学的研究中.该研究首次报道了ECHO13病毒中国分离株的VP1蛋白基因全长序列,并推荐按VP1基因全长核苷酸差异≥20%作为划分基因型的标准,将已知的ECHO13病毒划分为A、B和C3个基因型.同时也可用病毒VP1基因5′端部分序列替代VP1全长序列来划分基因型.     

肠道病毒ECHO25河南分离株基因特征分析

首次对ECHO25病毒进行分子生物学分析,阐明ECHO25(Entric Cytopathic Human Orphanviruses Type25)病毒河南分离株的分子生物学特征及其与世界其它分离株的基因关系。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出VP1蛋白编码基因并进行序列测定,将所测4株ECHO25病毒的VP1序列与GenBank上已发表的ECH-O25病毒VP1区进行同源性比较及遗传进化分析发现:河南省4株ECHO25与标准株JV-4核苷酸同源性为79.2%～80.1%,氨基酸同源性为89.0%～92.4%;河南省4株ECHO25核苷酸同源性为93.0%～99.0%,氨基酸同源性为92.4%～97.5%;HN-01分离株与HN-26分离株高度同源,其核苷酸同源性达99.0%;河南省4株ECHO25同属B1基因亚型。     

人肠道病毒分型方法和鉴定技术的研究进展

近年来,随着分子生物学和生物信息学的进步,人肠道病毒基因序列分析应用广泛,基因测序自动化发展迅速,促进了人肠道病毒分型方法和鉴定技术的发展。鉴于新型肠道病毒不断被报道,人肠道病毒的范围目前明显扩大,本文就人肠道病毒分型方法和鉴定技术研究进展作一综述。     

乌头根腐病病原菌的分离与鉴定

【背景】四川江油地区栽培乌头极易发生根腐病,植株染病后枯萎死亡,最终影响药材产量。因发病因素和致病菌多样,乌头根腐病的防治向来困难。【目的】鉴定四川江油地区栽培乌头根腐病病原菌,为病害诊断和防治提供理论基础。【方法】采用组织分离法进行病原菌分离;按照Koch’s法则对分离的病菌进行致病性验证;通过形态学观察和真菌r DNA-ITS序列分析,鉴定病原菌种类。【结果】从具有根腐病症状的乌头根部分离得到47株真菌,其中菌株GF3-3、GF3-6和GF6-1是乌头根腐病的致病菌;通过形态特征结合rDNA-ITS序列分析将菌株GF3-3、GF3-6和GF6-1分别鉴定为Fusariumsolani、F.oxysporum和F.proliferatum。【结论】茄腐镰刀菌(F.solani)、尖孢镰刀菌(F. oxysporum)和层出镰刀菌(F. proliferatum)是乌头根腐病的主要病原菌,其中层出镰刀菌引起乌头患根腐病为首次报道。     

小果博落回的生物碱分离与鉴定

以D101大孔吸附树脂为吸附剂,将对小果博落回全草的酸水提取物分为50%乙醇洗脱部分和丙酮洗脱部分.对两部分洗脱物分别进行硅胶柱色谱分离,由50%乙醇洗脱部分得到5个生物碱:二氢血根碱(1),二氢白屈菜红碱(2),6-乙氧基血根碱(3),6-丙酮基血根碱(4)和Bocconarborine A (5).由丙酮洗脱部分得到原阿片碱(6),α-别隐品碱(7),β-别隐品碱(8)和小檗红碱(9).采用波谱分析对化合物进行了结构表征,结果表明,化合物3、4、5、9是首次从该植物中分离得到.