PDGF-C 3'UTR区荧光素酶报告基因载体构建

目的:构建不同长度包含目的片段的PDGFC 3`UTR双荧光素酶报告基因载体,为进一步研究PDGF-C mRNA的上游miRNA调节做准备。方法:培养人乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞,提取腺癌细胞系MDA-MB-231细胞的基因组DNA,以提取的基因组为模板,通过PCR扩增不同长度的PDGFC 3`UTR片段,经胶回收后,将回收的目的片段插入报告基因载体SV40-p GL3中,再经转化将克隆好的载体转入细菌内扩增(先在固体培养基上扩增为菌落,然后再接种进液体细菌培养管中扩增),扩增细菌后进行质粒提取,并进行菌落PCR及双酶切鉴定,最后送公司进行基因序列检测鉴定。结果:成功构建了不同长度目的片段的PDGFC 3`UTR的双荧光素酶报告基因载体。结论:本实验构建了不同长度的PDGF-C mRNA的3’UTR区的双荧光素酶报告基因载体,为进一步研究PDGF-C mRNA的上游miRNA调节打下了基础。     

bax转录调控pGL3-Basic荧光素酶报告基因载体的构建

目的:构建能用来检测bax转录调控作用的报导基因载体.方法:采用PCR方法克隆出bax 5'UTD基因,构建载体后利用酶切与测序进行鉴定.然后将该基因亚克隆至pGL3-Basic报告基因载体上.结果:克隆基因产物酶切结果与理论预测值一致,测序未出现一个碱基突变.PCR鉴定发现,bax5'UTD正确连接到了pGL3-Basic报告基因载体上,构建了pGL3-Basic-Baxregular载体.结论:bax 5'UTD报导基因载体的构建为进一步研究bax转录调控作用提供了载体资源.     

组蛋白变体H2A.Z的转录调控功能与动态作用机制

H2A.Z是组蛋白H2A常见的组蛋白变体。近年来,人们通过多学科手段探究了H2A.Z对于基因转录的激活或抑制作用。本文在概述组蛋白变体和H2A.Z发展史的基础上,重点阐述了H2A.Z不同亚型、不同翻译后修饰和基因组分布在转录调控过程中的作用,明确了其生物学意义和在肿瘤发生发展、神经系统分化发育过程中的病理生理学意义,并总结了H2A.Z在染色质沉积或者移除的动态调控机制方面的研究进展,以期为深入了解组蛋白变体的多样性,并为寻找相关疾病诊疗的新靶点提供参考。     

小鼠T-bet启动子荧光素酶报告基因载体的构建及活性鉴定

为了研究T-bet在T细胞中的转录调控机制,并研究其在多发性硬化症中的信号通路,本研究构建小鼠TBX21(编码T-bet)基因启动子区和增强子区萤火虫荧光素酶报告基因载体。在对小鼠TBX21基因5?侧翼区进行详尽生物信息学特征分析后,设计相应引物,用PCR的方法从小鼠基因组中扩增出TBX21基因5?侧翼区–1 000 bp-28 bp片段长为1 028 bp的启动子区(以翻译起始点ATG为+1)和–3 308 bp-–2 000 bp片段长为1308 bp的非编码区保守序列(No-coding conserved sequence,CNS),再用定向克隆的方法将这两个片段定向重组入专门用于启动子活性研究的萤火虫荧光素酶报告基因载体(p GL4.10)中,构建出包含小鼠TBX21基因启动子区和CNS区的萤火虫荧光素酶报告基因载体(p GL4.10-TBX21pr-CNS),电泳与测序鉴定,最后再将p GL4.10-TBX21pr-CNS与内参p RL-TK用lipofectamine 2000共转染293T细胞和Jurkat细胞中,通过双荧光素酶报告基因检测系统鉴定p GL4.10-TBX21pr-CNS的启动子和增强子活性,并用独立样本t检验方法进行统计分析。对照组共转染p GL4.10与内参p RL-TK。结果表明,成功构建出荧光素酶报告基因重组质粒p GL4.10-TBX21pr-CNS。与转染空质粒p RL-TK组相比,293T细胞(P=0.012 2)和Jurkat细胞(P=0.002 2)中转染p GL4.10-TBX21pr-CNS组荧光素酶活性升高。研究结果表明在293T细胞和Jurkat细胞中p GL4.10-TBX21pr-CNS可以表现出启动子活性,为后续小鼠T-bet转录调控研究提供了基本材料。     

含G0S2基因启动子的荧光素酶报告基因载体的构建

目的:克隆人G0S2基因启动子并构建荧光素酶报告基因载体,为进一步研究G0S2基因转录调控提供质粒。方法:利用PCR技术从人胚肾293A细胞基因组DNA中克隆获得G0S2基因启动子的DNA片段,将其克隆至pGL3-basic表达载体中,并转化人大肠杆菌DH5α,经限制性内切酶酶切、PCR及测序鉴定得到确认;将重组载体质粒与半乳糖苷酶表达质粒psV-β-Galactosidase共转染至大鼠血管平滑肌细胞(VSMC),检测细胞中荧光素酶的活性。结果:pGL3-G0S2-Promoter重组质粒插入片段和相邻序列正确,克隆的G0S2基因片段有启动子活性(P0.05)。结论:成功构建了pGL3-G0S2-Promoter报告基因质粒,为进一步研究G0S2基因的表达奠定了基础。     

基于组蛋白甲基化信息的H2A.Z和H2A核小体识别

组蛋白H2A的变体H2A.Z在基因的表达过程中发挥着重要的作用。根据H2A.Z和H2A核小体中组蛋白甲基化修饰方式的不同,作者应用多样性增量二次判别方法(increment of diversity with quadratic discriminant,IDQD)成功地对H2A.Z和H2A核小体进行了识别,说明了以组蛋白甲基化信息作为特征参数的IDQD模型对H2A.Z和H2A核小体识别的有效性。通过计算DNA序列的柔性,发现H2A.Z核小体对应的DNA序列的平均柔性比常规H2A核小体对应的DNA序列的平均柔性弱。     

表达荧光素酶和绿色荧光蛋白双报告基因重组非洲猪瘟病毒的构建

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染家猪和野猪引起的一种高致病性传染病,家猪感染ASFV强毒株后死亡率接近100％.为了研究ASFV的致病机制,利用绿色荧光蛋白(EGFP)作为报告基因构建重组病毒已经广泛应用,但易于定量检测且适用于高通量筛选的重组ASFV目前没有报道.本研究以ASFVHLJ/18分离株为亲本病毒,采用CRISPR/Cas9基因编辑技术和同源重组技术将表达Gaussia荧光素酶(Gluc)和EGFP的报告基因表达盒插入到ASFV的K145R基因的位置,构建可以同时表达Gluc和EGFP的重组ASFV(rASFV-Gluc-EGFP).通过PCR鉴定、Gluc和EGFP表达的检测,确定获得的重组ASFV能够感染猪肺泡巨噬细胞且表达Gluc和EGFP.对构建的重组病毒和亲本病毒进行生长曲线比较,结果表明插入的报告基因不影响病毒在猪肺泡巨噬细胞中的复制.F5、F10和F15代重组病毒基因鉴定和报告基因表达检测结果表明,重组病毒能稳定表达插入的双报告基因.本研究成功构建了表达Gluc和EGFP的重组ASFV,可以针对报告基因进行定量检测和高通量筛选,为ASFV的感染和致病机制研究奠定坚实的基础.     

含p27启动子的荧光素酶报告基因的构建和活性测定

目的:克隆p27基因的启动子,插入荧光素酶报告基因载体中,并检测其活性。方法:采用PCR技术从人乳腺癌细胞系MCF-7基因组中扩增出p27启动子,插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,确定所扩增的DNA序列,在293T细胞中检测其活性。结果:测序结果显示扩增的p27启动子序列正确,活性实验表明构建的报告基因具有启动子活性,雌激素受体(ER)α能以剂量依赖的方式升高p27报告基因的转录。结论:克隆了p27启动子,为ERα共调节子的功能研究提供了重要基础。     

含p21启动子的荧光素酶报告基因的构建和活性测定

目的:克隆p21基因的启动子,插入荧光素酶报告基因载体中,并检测其活性。方法:采用PCR技术从人乳腺癌细胞系MCF-7基因组中扩增出p21启动子,插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,确定所扩增的DNA序列,在293T细胞中检测其活性。结果:测序结果表明扩增的p21启动子序列正确,活性实验表明构建的报告基因具有启动子活性,雌激素受体(ER)α能以剂量依赖的方式升高p21报告基因的转录。结论:克隆了p21启动子,为ERα共调节子的功能研究提供了重要基础。     

小鼠Daintain/AIF-1 基因启动子的克隆及其荧光素酶报告基因 载体的构建

目的:对Daintain/AIF-1(大炎肽/同种异体移植炎症因子-1)基因启动子进行克隆并构建荧光素酶报告基因载体,为进一步研究Daintain/AIF-1的转录调控作用提供了质粒资源。方法:提取单核巨噬细胞系RAW264.7基因组DNA,以其为模板采用PCR方法克隆出Daintain/AIF-1基因5’端UTR区1.6 kb DNA序列,将该序列同源重组到pGL3-Basic载体上,转化感受态DH5α并酶切鉴定和测序。结果:PCR产物片段与预期结果一致,Daintain/AIF-1基因5’端UTR区1.6 kb DNA序列连接到pGL3-Basic载体上,构建成pGL3-Basic-Daintain/AIF-1(pGL3-Basic-DT)载体,酶切结果与理论预测值一致,经测序证实无碱基突变。结论:Daintain/AIF-1基因报告基因载体的构建为进一步研究Daintain/AIF-1转录调控作用提供了载体资源。     

非典型E2F转录因子对细胞周期的调控及其功能

E2F家族转录因子是细胞周期调控网络中的重要环节之一,对细胞的增殖、分化和凋亡进行调节,并参与多种生理和病理过程。近年来,关于哺乳动物中E2F转录因子的生物学作用研究取得了很大进展,并鉴定出两个非典型的E2F家族成员：E2F7和E2F8。与典型的E2F转录因子相比,非典型E2F蛋白结构中含有两个相同的DNA结合域,对靶基因转录的调控不依赖于二聚化蛋白。非典型E2F蛋白进入细胞核后,通过与经典的E2F靶基因启动子结合,发挥转录抑制作用并调节细胞周期的进程,从而对细胞的大小、多倍化、增殖、分化和凋亡进行调控。随着基因敲除模型的建立和完善,使得进一步研究非典型E2F转录因子在不同组织或器官中的生物学作用成为可能。非典型E2F在胚胎发育、血管发生及造血系统中均发挥重要作用。另外,肿瘤细胞中典型E2F和非典型E2F的表达比例发生改变,说明非典型E2F成员还参与肿瘤的发生发展。该文综述了近年来关于非典型E2F转录因子的表达、调节及其生理病理作用的研究进展。     

靶向E2F1的shRNA抑制眼内视网膜母细胞瘤生长

视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,RB)中由于Rb基因缺失或失活,转录调控因子E2F1始终处于活化状态,细胞不断增殖,E2F1活性增加是恶性肿瘤的普遍现象．根据人E2F1基因设计了3段shRNA,构建RNA干扰表达载体pSilencer-shE2F1,瞬时转染人视网膜母细胞瘤细胞株HXO-Rb-44和人肝癌细胞株SMMC-7721,通过荧光定量PCR检测E2F1表达水平的变化,PI (碘化丙锭)染色检测细胞周期各时相细胞数量以检测其对细胞周期的影响．根据筛选出的有效shRNA序列构建腺病毒载体并包装出腺病毒Ad-shE2F1,在裸鼠前房模型中,体外按50 moi的感染系数感染稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)的人视网膜母细胞瘤细胞株48 h后,收集细胞,将2×10⁵细胞注射到裸鼠眼前房内,连续观察眼内肿瘤细胞生长情况并拍照记录．通过转染肿瘤细胞株检测E2F1转录水平,筛选到1个能明显抑制肿瘤细胞内E2F1表达的shRNA序列,并使细胞周期中S期细胞数减少．经Ad-shE2F1感染的RB肿瘤细胞与对照相比较,其在裸鼠眼前房内肿瘤生长减缓．结果说明,有效抑制hE2F1表达的shRNA具有抑制体内外人视网膜母细胞瘤生长的作用．     

转录因子E2F1蛋白纯化及甲基化鉴定

目的:构建人E2F1基因原核表达质粒p GEX-KG-E2F1,并在大肠杆菌中诱导表达。随后验证纯化得到的E2F1蛋白可作为底物被甲基化转移酶修饰。方法:构建原核表达质粒p GEX-KG-E2F1,在大肠杆菌BL-21中经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,利用GST亲和层析法纯化表达的E2F1蛋白。随后将纯化的E2F1蛋白作为底物,组蛋白甲基化转移酶SET7/9作为酶进行体外同位素标记放射自显影实验,检测纯化的E2F1蛋白能否被甲基化。结果:酶切鉴定和测序结果证明成功构建了原核表达载体p GEX-KG-E2F1,SDS-PAGE检测结果证明实现了人E2F1基因在大肠杆菌中的可溶性表达,放射自显影证明纯化得到的E2F1蛋白可作为底物被甲基化转移酶SET7/9甲基化。结论:成功构建了转录因子E2F1体外甲基化体系,为筛选新的能甲基化E2F1的酶奠定基础。     

DNA-damage response control of E2F7 and E2F8

Here, we report that the two recently identified E2F subunits, E2F7 and E2F8, are induced in cells treated with DNA-damaging agents where they have an important role in dictating the outcome of the DNA-damage response. The DNA-damage-dependent induction coincides with the binding of E2F7 and E2F8 to the promoters of certain E2F-responsive genes, most notably that of the E2F1 gene, in which E2F7 and E2F8 coexist in a DNA-binding complex. As a consequence, E2F7 and E2F8 repress E2F target genes, such as E2F1, and reducing the level of each subunit results in an increase in E2F1 expression and activity. Importantly, depletion of either E2F7 or E2F8 prevents the cell-cycle effects that occur in response to DNA damage. Thus, E2F7 and E2F8 act upstream of E2F1, and influence the ability of cells to undergo a DNA-damage response. E2F7 and E2F8, therefore, underpin the DNA-damage response.