IEX-1相互作用蛋白的筛选与鉴定

骨肉瘤即原发于骨的恶性肿瘤,易发生早期肺转移且预后差,恶性程度高.本研究小组前期研究发现,IEX-1在骨肉瘤中具有重要作用.为了阐明其作用机制,本研究运用酵母双杂交技术筛选其相互作用蛋白,共鉴定出12个IEX-1相互作用蛋白,包括生物氧化相关酶类、分子伴侣、信号转导相关蛋白等.并首次证实clusterin(CLU,又名载脂蛋白J)与IEX-1存在相互作用,两者在细胞中具有很好的共定位.采用RNAi干扰减低骨肉瘤细胞中内源性CLU表达水平,显著抑制了细胞增殖与细胞侵袭能力.为阐明IEX-1在骨肉瘤发生发展中的作用机制提供了重要的线索,为骨肉瘤的早期诊治及预后监测提供了新的靶点.     

鼻咽癌下调新基因NOR1相互作用蛋白的筛选和鉴定

NOR1基因是新的鼻咽癌相关基因,该基因在鼻咽癌细胞系HNE1和鼻咽癌组织中表达下调．在鼻咽癌细胞HNE1中恢复NOR1基因表达抑制了鼻咽癌细胞的生长和增殖能力．为了探讨NOR1基因的生物学功能,以NOR1基因为诱饵运用酵母双杂交技术在人胎脑文库中筛选其交互作用蛋白,挑选阳性克隆,进行DNA序列分析和同源检索,阳性克隆编码7个不同的蛋白质,其中一个阳性克隆编码线粒体ATP合成酶亚基OSCP蛋白．瞬时转染pCMV-myc-NOR1质粒进入鼻咽癌5-8F细胞,通过密度梯度离心法分离线粒体蛋白,Western blot检测表明myc-NOR1蛋白分布于线粒体与胞浆．免疫荧光检测表明在鼻咽正常上皮细胞NP69中内源性NOR1蛋白与线粒体存在明显共定位．随后采用特异性酵母双杂交、免疫荧光共定位、免疫共沉淀技术证实了NOR1与OSCP在线粒体内存在交互作用．提示,NOR1是一个新的线粒体蛋白,可能通过结合OSCP蛋白调控细胞能量代谢,为深入探讨其功能提供了重要线索．     

应用酵母双杂交筛选与CUEDC2相互作用的蛋白质

目的：应用酵母双杂交技术,筛选与包含CUE结构域的人CUEDC2发生相互作用的蛋白质。方法：应用酵母双杂交系统,以CUEDC2为诱饵筛选人乳腺cDNA文库,寻找能与之相互作用的蛋白质,并运用营养缺陷型培养和X-alpha-Gal等实验提供的信息,筛除假阳性克隆。结果：以CUEDC2为诱饵最终筛出了2个阳性克隆,经测序及生物信息学分析,这2个克隆同为GADD34。结论：CUEDC2可以和GADD34发生相互作用,它们的相互作用有可能与CUEDC2的功能调控相关。     

CHK1相互作用蛋白的筛选

将CHK1基因克隆入酵母双杂交载体中,转化入酵母菌AH109,将转化有CHK1基因的酵母菌AH109培养并再转化人前列腺cDNA库质粒,检测报告基因的表达情况,筛选与CHK1相互作用的蛋白。共转化子中有4个β-半乳糖苷酶活性分析和α-半乳糖苷酶活性分析结果为阳性的克隆,但测序结果其中有2个克隆为相同序列。本实验筛选到3个与CHK1相互作用的蛋白,此结果为进一步研究与CHK1相互作用的蛋白奠定了基础。     

与抗辐射性相关蛋白AA12相互作用蛋白的筛选

将AA12基因克隆入酵母双杂交载体中,转化入酵母菌AH109,Western印迹检测其在酵母中的表达;将转化有AA12基因的酵母菌AH109培养再转化人前列腺cDNA库质粒,检测报告基因的表达情况。Western印迹结果表明AA12可以在酵母菌AH109中表达。共转化子中有2个β-半乳糖苷酶活性分析和d-半乳糖苷酶活性分析结果为阳性的克隆,但测序结果为相同序列。本实验筛选到1个与AA12相互作用的蛋白,此结果为进一步研究新基因AA12的功能奠定了基础。     

转录因子X-box结合蛋白1相互作用蛋白的筛选和鉴定

X-box 结合蛋白 1 是一种重要的转录因子,参与体内多项信号转导过程. 为进一步研究 XBP1 的生物学功能,运用酵母双杂交技术在肝细胞文库中筛选 XBP1 的结合蛋白. 首先运用 PCR 技术扩增获得 XBP1 的编码序列,克隆至 pGEM-T 载体,经测序鉴定后,亚克隆至诱饵载体 pGBKT7 中,转化酵母 AH109(a type). 免疫印迹检测诱饵质粒 pGBKT7-XBP1 在AH109 酵母中的表达之后,含有诱饵质粒的酵母 AH109 与含有肝细胞 cDNA 文库质粒 pACT2 的酵母 Y187(αtype)配合,配合后的二倍体酵母生长在含有 X-α-gal 的营养缺陷型培养基上 (SD/-Trp-Leu-His-Ade) 进行选择和筛选,经测序和序列比对确定阳性克隆的开放读码框 ORF,得到 7 种不同的蛋白质. 为了进一步验证这些筛选蛋白质与 XBP1 的相互作用,克隆其中一种蛋白质 MT1E,并运用 GST pulldown 和免疫共沉淀技术成功检测了 MT1E 和 XBP1 的相互作用(体外 / 体内),结果提示,MT1E 可能是 XBP1 的一个新的调节蛋白. 通过酵母双杂交技术筛选得到的 7 种蛋白质分别与肝细胞基础代谢、蛋白质的合成与运输、细胞的增殖与凋亡密切相关. 上述结果有助于揭示 XBP1 的生物学功能,为进一步探讨 XBP1 的表达和调控机制提供新线索.     

从小鼠11.5d胚胎cDNA文库中筛选Dishevelled2相互作用蛋白

Dishevelled (Dvl)是个多功能、进化上非常保守的蛋白,在Wnt信号传导通路中起着重要的作用。为了研究Dishevelled介导Wnt信号传递的分子机制,利用GAL4酵母双杂交系统筛选了小鼠11．5d胚胎cDNA库,发现了15个可与小鼠Dvl2 DEP结构域和羧基端相互作用的蛋白质。将阳性库质粒测序并对测序结果做BLAST分析,发现其中一个阳性克隆是编码Gli3蛋白氨基端(6—122aa)的cDNA片段,从而暗示Gli3蛋白可能与Dishevelled一起作用并参与某些生物学过程。     

采用酵母双杂交法筛选HbMyb1相互作用蛋白

HbMyb1是橡胶树死皮病相关基因,为了进一步研究HbMyb1的功能,采用酵母双杂交方法,从胶乳cDNA文库中筛选出10个与HbMyb1发生相互作用的蛋白,包括已知的橡胶延伸因子和橡胶小粒子蛋白等,其中4个分别与3-羟酰基-ACP-脱氢酶、NAD-依赖的山梨糖醇脱氢酶、氧化还原酶、假定的富含亮氨酸重复蛋白具有同源性的蛋白,其余4个为未知蛋白。     

mPem蛋白相作用分子的筛选与鉴定

mPem是同源异型框基因,其C末端编码同源异型域。为进一步研究mPem蛋白在胚胎发育和生殖组织发育过程中的作用,利用GAL4酵母双杂交系统筛选小鼠7d胚胎cDNA文库,共获得3个与mPem蛋白相作用的分子。其中之一为Mdfic,一种新的转录调控因子。进一步的酵母双杂交和体外GST_Pulldown试验再次确认两者之间的相互作用。Mdfic与mPem蛋白之间的相互作用暗示两者有可能组成转录调控复合体,共同参与胚胎分化的调控,为两种蛋白功能的研究提供新的思路。     

PML coiled-coil结构域与RAN结合蛋白9相互作用的验证

目的验证前髓细胞性白血病的卷曲螺旋结构域（PML—C）和RAN结合蛋白9（RANBP9）之间的相互作用。方法构建分别表达诱饵蛋白PML—C和靶蛋白RANBP9的载体pGBKT7-PML-C和pACT2-RANBP9,然后转人酵母AH109,培养3～5d后对其是否有胞内相互作用进行检测。将目的片断PML-C和RANBP9再次构建于真核生物表达载体pCMV—HA和pCMV—myc里,然后共转染人胚肾293细胞里（HEK293）,最后对其是否有体外相互作用通过免疫共沉淀和免疫印迹进行分析。结果在共转化了质粒pGBKT7-PML—C和pACT2-RANBP9的AH109酵母平板里观察到蓝色菌落生长。用抗HA多克隆抗体对共转染过重组质粒的HEK293细胞的蛋白提取物进行免疫共沉淀,再用抗myc单克隆抗体作为一抗进行免疫印迹,最终检测出融合蛋白myc—RANBP9条带。结论酵母双杂交实验验证了PML—C和RANBP9之间存在胞内相互作用,同时免疫共沉淀实验也从体外验证了它们之间的相互作用。     

大规模酵母双杂交技术研究蛋白质相互作用的应用

简介了酵母双杂交技术原理, 总结了酵母双杂交技术大规模筛选蛋白质相互作用的基础、应用及存在的问题。因为大规模酵母双杂交技术结果有大量假阳性及假阴性问题, 因此, 有条件情况下有必要同时开展其他方法的大规模蛋白相互作用研究, 以构建规模更大可信度更高的蛋白质相互作用网络图。     

凋亡蛋白和Nmi的相互作用及作用位点的筛选鉴定

为研究来源于鸡贫血病毒的小分子蛋白质———凋亡蛋白 (apoptin)诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制 ,利用酵母双杂交系统从人白细胞cDNA文库筛选凋亡蛋白相互作用蛋白质 ,核苷酸序列分析及同源性检索表明 ,其中一个约为 1.2kb的克隆与Nmi(N Mycinteractionprotein)高度同源。细胞免疫共沉淀实验结果显示 ,在哺乳动物细胞水平仍能够检测到凋亡蛋白与全长Nmi的特异相互作用。利用构建好的分别缺失C端 11个氨基酸、中间 33～46位氨基酸和二者均缺失的 3个凋亡蛋白突变体进行相互作用位点研究 ,结果表明凋亡蛋白的 33～ 46位氨基酸(核外运信号 )对于凋亡蛋白与Nmi的相互作用是必需的 ,而C端核定位信号 /DNA结合序列对于凋亡蛋白与Nmi的相互作用不是充分必要的     

用酵母双杂交系统筛选与痢疾杆菌侵袭素IPaC相互作用的蛋白

利用酵母双杂交技术筛选与IpaC相互作用的真核细胞蛋白。首先将IpaC全长基因克隆到诱饵蛋白载体pGBKT7中 ,以构建的pGBKT IpaC为靶蛋白质粒 ,筛选人HeLa细胞cDNA文库。在 2× 10 6个克隆中得到 2 2个阳性克隆。其中 2个阳性克隆编码人胶原酶蛋白片段。并且进一步证明与胶原酶片段相互作用的IpaC结构域在 6 2aa～ 170aa之间。提示IpaC可能在胶原酶参与的生物学过程中发挥作用。     

利用酵母双杂交系统筛选水稻类受体激酶OsWAK50胞内域相互作用蛋白

细胞壁连接的类受体激酶(wall-associated kinase,WAK)是植物细胞中一类特有的类受体激酶基因亚家族,因其胞外域与细胞壁紧密相连而得名．水稻中共有125个OsWAK基因,OsWAK50编码的蛋白质具有胞外域、跨膜域和激酶域,呈现典型的WAK样受体激酶特征．首先通过对OsWAK50-GFP融合蛋白的观察发现OsWAK50定位于细胞膜并且与细胞壁偶联．进而通过酵母双杂交系统筛选到了20个可能与OsWAK50胞内域相互作用的候选蛋白,并通过一对一酵母转化验证了OsSK4、OsSWIB和OsSWI3C全长均可与OsWAK50胞内域相互作用．进一步分析显示,OsSWIB能够直接与OsWAK50激酶域互作,而OsSK4和OsSWI3C与OsWAK50胞内域的互作是依赖于OsWAK50 C端的．研究还表明,OsSK4和OsSWIB亦能与OsWAK50同源基因OsWAK53a结合,而OsSWI3C则不能与OsWAK53a结合．双分子荧光互补实验证明,OsSK4与OsWAK50和OsWAK53a能够在植物体内发生互作．以上结果为阐明OsWAK50发挥功能的分子机制提供了重要线索．     

肝细胞生成素在睾丸组织中的相互作用蛋白

肝细胞生成素（HPO）具有复杂的生理功能,在睾丸中的高表达提示其在生殖活动中的重要性,而不仅局限于肝再生.构建了酵母表达载体pGBKT7-HPO,采用酵母双杂交系统,以HPO为诱饵蛋白,从人睾丸cDNA文库中寻找能够与HPO相互作用的蛋白质.经过筛选、验证阳性克隆,并进行PCR、测序和序列比对,得到4种相互作用蛋白质：NADH脱氢酶1、钠/钾ATP酶β3亚基、磷脂酶C δ1以及附睾分泌蛋白.提示HPO可能参与了细胞的蛋白质合成,能量代谢等.通过对候选蛋白的研究,为探讨HPO对睾丸组织细胞功能的调节机制提供了重要的线索.     

利用酵母双杂交筛选豌豆叶绿体镁离子螯合酶D亚基相互作用蛋白

植物叶绿体镁离子螯合酶是四吡咯化合物生物合成途径中合成叶绿素分支(镁分支)的第一个酶,它催化镁离子螯合到原卟啉IX中,形成镁原卟啉IX. 镁离子螯合酶是1个由3个亚基H、D和I组成的多亚基酶,3个亚基均由细胞核编码,进入叶绿体发挥功能.该酶不仅控制着叶绿素的合成,其各个亚基还具有很多其它的功能：H亚基既是ABA受体,又参与叶绿体到细胞核的反向信号传导;D亚基也与叶绿体到细胞核的反向信号传导有关. 本文利用酵母双杂交技术,将编码豌豆镁离子螯合酶D亚基的cDNA片段构建到诱饵载体pGBKT7中,分别用共转化的方法筛选豌豆叶片细胞核编码的均一化cDNA文库和用Mating的方法筛选豌豆叶片叶绿体编码的均一化cDNA文库,共得到121个候选克隆,其中有60个克隆共编码21个叶绿体蛋白质,19个来自于核基因编码,2个来自于叶绿体基因编码. 这些候选蛋白参与叶绿素合成、卡尔文循环、叶绿体蛋白质翻译和叶绿体基因转录等多个代谢过程. 酵母点对点和GST-pull down对其中的4个蛋白做了进一步的验证.这些结果将为D亚基的功能研究提供进一步的线索.     

基于膜上的酵母双杂交系统及其在药物开发中的应用

蛋白质是生命活动的基础.生物体内的蛋白质之间都存在着复杂的相互关系.由于蛋白质中的膜蛋白在各种各样重要细胞过程中起着关键的作用,如光合作用、呼吸作用、信号传导、免疫反应和营养物质的吸收等,因此越来越受到研究者们的重视.对膜蛋白的研究也越来越多.但因为膜蛋白具有疏水性,所以常常用传统的生物化学和遗传学方法,难以对膜蛋白之间以及膜蛋白与胞质蛋白之间的关系进行分析和鉴定.而传统的酵母双杂交系统又因其局限性,不能广泛地用于研究膜蛋白的相互作用.对研究膜蛋白之间及膜蛋白与胞质蛋白之间关系的一种有效方法—基于膜上的酵母双杂交系统,以及该方法在药物开发设计领域中的运用进行了介绍和综述.     

Yeast two-hybrid方法筛选VISA相互作用蛋白

病原微生物感染对人类健康构成巨大威胁,先天免疫系统是生物体在长期进化过程中建立起来的天然保护系统。VISA(MAVS,CARDIF,IPS-1[1-3])是连接胞浆dsRNA受体RIG-I与下游信号转导通路的一个接头蛋白,研究结果表明VISA无论在TLR3非依赖的或者TLR3介导的抗病毒IFN信号途径中都具有关键作用,但目前对VISA信号转导的详细机制还不十分清楚。更多VISA相互作用蛋白的发现以及它们之间的作用机制的研究能完善我们对VISA参与的信号转导机制的认识。利用酵母双杂交系统,用VISA蛋白的全长做诱饵(Bait)筛选293 T细胞c DNA表达文库,并结合免疫共沉淀实验,双荧光素酶报告基因系统验证筛选到的阳性克隆和VISA作用的真实性。通过酵母双杂交系统成功筛选到Sec13L1候选基因并验证了其与VISA的全长蛋白相互作用,在293 T细胞中过表达该基因,研究结果显示Sec13L1过表达能促进VISA对IFNβ的诱导,并存在剂量效应。