首页 | 本学科首页   官方微博 | 高级检索  
相似文献
 共查询到20条相似文献,搜索用时 15 毫秒
1.
自动化质粒提纯 Applied Biosystems公司向其Genepure341Nucleic Acid Purification System和Model340A系统中引入自动质粒DNA纯化方法,该方法可产生纯度与CsCl-带制品相似的质粒DNA,且更省时。纯化的质粒DNA适用于所有的标准实验,包括自动荧光测序、手工测序、PCR和限制性消化。此新方法进一步扩大了Genepare的适用性,也能用于提纯基因组DNA和总RNA。该方法全部自动化,使研究人员腾出手来做更多的工作。公司说这是一个封闭系统,排除了暴露于毒性试剂和使样品感染的可能性。App-  相似文献   

2.
<正>Real-time QuantitativePCR Detecting System,即实时定量核酸扩增检测系统,也称为实时定量基因扩增检测系统,简称定量PCR(qPCR)。荧光定量PCR一般分为非特异性荧光定量PCR和特异性荧光定量PCR。本文主要介绍一种应用非特异性荧光定量PCR(以SYBR Green I为例)方法对小RNA进行定量分析。SYBRGreen I qPCR分析小RNA的优点为:实验设计简单,一般需要一条特异性反转录引物,一条特异性正向PCR引物,反向PCR引物可通用于所有小RNA分析,无需象TaqMan方法那样专门设计探针;实验成本相对较低;可通过溶解曲线分析来检测扩增反应的特异性。这些特点有利于初学者掌握该技术,而对于一般的分析也可以完全达到实验目的。操作方法如下:  相似文献   

3.
检测HIV-1载量的荧光实时定量PCR技术的建立及其应用   总被引:2,自引:0,他引:2  
准确测定HIV-1的前病毒载量和病毒载量的技术,在感染者预后和艾滋病患者药物治疗效果的评价以及艾滋病的其它研究方面,都具有十分重要的应用价值。以定量的HIV-1DNA和RNA为标准外参照,利用SYBRGreen荧光染料和GeneAmp5700 Sequence Detection System(5700系统),建立了测定HIV-1的前病毒载量和病毒载量的荧光实时定量PCR技术。以病毒感染细胞和培养上清为材料,测定了三种化合物(AZT,GL和WT)对细胞内的前病毒载量和培养上清中的病毒载量的抑制活性,并与合胞体形成抑制方法测定化合物抗病毒活性的结果进行了比较。根据病毒载量、前病毒载量和合胞体形成计算出的三种化合物的治疗指数均依次变小,提出以荧光实时定量PCR技术测定前病毒载量,会在评价药物在体内外根除或减少存在于CD4休止或记忆T淋巴细胞中的HIV-1前病毒方面有特别的价值。  相似文献   

4.
准确测定HIV-1的前病毒载量和病毒载量的技术,在感染者预后和艾滋病患者药物治疗效果的评价以及艾滋病的其它研究方面,都具有十分重要的应用价值。以定量的HIV-1 DNA和RNA为标准外参照,利用SYBR Green荧光染料和GeneAmp5700Sequence Detection System(5700系统),建立了测定HIV-1的前病毒载量和病毒载量的荧光实时定量PCR技术,以病毒感染细胞和培养上清上材料,测定了三种化合物(AZT,GL和WT)对细胞内的前病毒载量和培养上清中的病毒载量的抑制活性,并与合胞体形成抑制方法测定化合物抗病毒活性的结果进行了比较,根据病毒载量、前病毒载量和合胞体形成计算出的三种化合物的治疗指数均依次变小,提出以荧光实时定量PCR技术测定前病毒载量,会在评价药物在体内外根除或减少存在于CD4休止或记忆T淋巴细胞中的HIV-1前病毒方面有特别的价值。  相似文献   

5.
小麦硫转运蛋白基因半定量RT-PCR检测方法的建立   总被引:5,自引:0,他引:5  
为进一步研究干旱胁迫下小麦硫转运蛋白基因(ST)的表达,选用小麦-αT ubu lin基因(T a)为内参照,提取小麦根系总RNA,反转录cDNA,同批异管对2个基因片段进行PCR扩增.通过对PCR体系中M g2 浓度、退火温度及循环次数的优化和对体系重复性、准确性的分析,最终建立了一个稳定、方便的半定量RT-PCR体系.该体系可用于比较不同小麦样品间硫转运蛋白基因的表达,且因为两对引物均垮内含子,其稳定RT-PCR体系,也为实验室建立小麦mRNA反转录体系提供了参考依据.  相似文献   

6.
有两家公司提出了解决聚合酶链反应(PCR)实验中DNA交叉感染问题。美国的Oncor和爱尔兰的Safetech发明了具有紫外线(UV)光源装置的清洁工作柜,以防止DNA污染。 Safetech设计的Genesphere UV100是一种轻便的圆形顶盖,安装在底座上面。该装置可防止样品在利用Hepa滤器经过Class100清洁空气环境时被空气污染。该装置中保持一个正压力系统,为了防止DNA样品交叉感染,在其顶篷上安装了3个水银灯。该公司对这一球型工作室申请了专利,当采用紫外消毒法时,所有的工作区都能被照射到。紫外光将破坏99.99%的污染DNA分子。  相似文献   

7.
大多数转基因植物中使用花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus,CaMV)35 S作为启动子,因此可通过检测该启动子来判断植物样品中是否含有转基因成分。实验将高灵敏度电化学发光PCR方法用于检测转基因烟草中的CaMV35 S启动子,将该启动子的PCR产物与生物素标记的探针杂交,可以起到特异性筛选产物的作用;与发光标记物——三联吡啶钌标记的探针杂交,从而实现电化学发光检测。两种探针同时与待测样品的PCR产物进行杂交,进一步对样品进行特异性筛选,从而提高了检测的准确性,避免了假阳性结果的产生。实验结果表明:该法可以准确的区分待测样品中是否含有35 S启动子,从而区别转基因烟草和非转基因烟草。电化学发光PCR方法灵敏度高,可靠性强,操作简便,结果准确,有望成为一种高效的转基因植物检测方法。  相似文献   

8.
以伪狂犬病毒(PRV)保守的gE基因序列为参考,设计、优化出一对特异的PCR引物和一条TaqMan荧光探针,结合RotorGene检测系统,建立一种快速定量检测伪狂犬病毒的荧光定量PCR技术。该方法线形范围为1.0×102-1.0×107拷贝/μL,灵敏度达102拷贝/μLDNA,比常规PCR高10倍。检测的特异性明显高于常规PCR,同时避免了常规PCR因电泳造成的污染。应用该技术检测66例猪组织或鼻咽拭子样品,阳性42份,阳性检出率为63.6%(42/66)。与病毒分离培养、常规PCR相比较结果显示,该方法具有快速、灵敏、特异、重复性好和能定量检测等优点,该方法可用于猪场PRV感染的快速定量检测和肉类食品进出口检疫。  相似文献   

9.
对鸡胴体淋洗液样品进行沙门菌检测,样品经过前增菌和选择性增菌后,分别采用4种不同的方法进行检测,即普通PCR方法、实时荧光PCR方法、免疫学方法(VIDAS)和传统的微生物检验方法。共检测了56份样品,普通PCR检出阳性样品34份,实时荧光PCR阳性样品36份,VIDAS阳性样品28份;PCR和实时荧光定量PCR均无假阳性和假阴性结果。结果显示该3种检测方法均可以用于鸡胴体中沙门菌的快速检测。  相似文献   

10.
目的:建立一种检测马尔尼菲青霉菌的实时荧光定量PCR的方法。方法:针对马尔尼菲青霉菌5.8S rRNA设计特异性PCR引物,采用核酸荧光染料SYBR GreenⅠ进行实时荧光定量PCR检测,探讨该方法的灵敏度和特异性,并进行临床样品检测验证。结果:该方法的特异性较好,与该菌属内的其他细菌间无交叉反应;灵敏度可检测出10个细胞/mL全血,在检测范围内线性良好,相关系数R2=0.981。临床样品检测和传统的培养方法结果完全相符。结论:该方法特异性好,灵敏度高,操作简单,检测时间短;临床样品检测具有很好的准确性,从本研究的结果显示实时荧光定量PCR方法在检测马尔尼菲青霉菌中的应用可以大大缩短临床的诊断时间,提高临床诊断的准确度和效率。  相似文献   

11.
以伪狂犬病毒(PRV)保守的gE基因序列为参考,设计、优化出一对特异的PCR引物和一条TaqMan荧光探针,结合RotorGene检测系统,建立一种快速定量检测伪狂犬病毒的荧光定量PCR技术.该方法线形范围为1.0×102-1.0×107拷贝/μL,灵敏度达102拷贝/μLDNA,比常规PCR高10倍.检测的特异性明显高于常规PCR,同时避免了常规PCR因电泳造成的污染.应用该技术检测66例猪组织或鼻咽拭子样品,阳性42份,阳性检出率为63.6%(42/66).与病毒分离培养、常规PCR相比较结果显示,该方法具有快速、灵敏、特异、重复性好和能定量检测等优点,该方法可用于猪场PRV感染的快速定量检测和肉类食品进出口检疫.  相似文献   

12.
为建立同步检测布鲁氏菌和贝纳氏柯克斯氏体的双重PCR方法,根据GenBank上公布的布鲁氏菌Bp26基因和贝纳氏柯克斯氏体IS1111a基因,利用Primer premier 5.0软件各设计一对特异性引物,分别扩增出219 bp和130 bp的目的片段,通过优化PCR反应体系和扩增条件,建立起了能够同步快速检测布鲁氏菌和贝纳氏柯克斯氏体的双重PCR方法,该方法具有较好的特异性、可重复性和较高的灵敏性。利用该双重PCR方法对流产牛抗凝全血、血清、流产胎儿及奶液等172份临床样品进行检测,共检测到布鲁氏菌感染阳性样品53份,贝纳氏柯克斯氏体感染阳性样品10份,混合感染阳性样品2份,阳性检出率分别为30.8%、5.8%、1.2%。初步临床应用结果表明,该方法可用来安全、同步、快速、灵敏地对布鲁氏菌和贝纳氏柯克斯氏体进行检测。  相似文献   

13.
烟草碱法提取基因组DNA的改进   总被引:1,自引:0,他引:1  
为能够快速高效的对大量转基因烟草样品进行DNA提取,对碱法提取烟草组织DNA的方法进行了改进。采用0.01mol/L的Na OH溶液为提取液,破碎转基因烟草叶片组织后无需经过加热煮沸中和等步骤,上清液可直接用作PCR反应的模板。结果表明,0.01-0.1 mol/L之间的Na OH溶液制备的DNA模板均能成功扩增,该方法制备的DNA模板不依赖特殊的反应条件,多种品牌的PCR Mix均能成功进行扩增反应。与传统SDS提取法和试剂盒提取法获得的DNA相比,PCR结果没有明显差异。此提取方法在小麦、高粱、水稻、玉米等作物上也取得了很好的实验效果。通过本方法制备的DNA模板,其PCR扩增的产物可直接用来测序分析。该方法使用仪器少,样品消耗少,快速、简便、成本低,没有交叉污染,能够在短时间内处理大量样品,因此能够对大量的转基因烟草样品进行DNA的快速提取和鉴定。  相似文献   

14.
<正>多聚酶链反应(PCR)类似体内DNA复制过程,在待扩增的“靶”或“模板”DNA双链分子的的两端各接一个引物,经一次循环后,可得到两个相同的双链靶DNA分子。DNA分子数随循环次数呈几何级数增长,30次循环后,靶DNA被放大2~(30)倍,其拷贝数可达10~9以上,在100ul PCB反应混合物中约产生2~3μ DNA。扩增的靶DNA分子长达10~18kb,但4kb抗更短的靶DNA最适宜PCR扩增,PCR能测出10~6基因组中的一个DNA拷贝。  相似文献   

15.
目的:建立马、牛、猪、鸭肉四重聚合酶链式反应(PCR)反应体系,为牛肉掺假检测提供参考。方法:选取马、牛、猪、鸭肉阳性样本,根据线粒体基因组中细胞色素b(cytochrome b)序列,设计多重PCR引物,同时对马、牛、猪、鸭肉进行PCR及电泳检测,建立四重PCR反应体系,并运用该体系对市场40份牛肉制品进行检测。结果:引物比例为马:牛:猪:鸭=1:1:2:1时,46℃退火温度下反应35个循环,四重PCR效果较好;建立四重PCR反应体系,四重PCR条带清晰且亮度较为一致,几乎没有二聚体产生,扩增灵敏度高。根据样品检测结果,烤牛肉串、牛肉丸的掺假率较高,分别为36.4%、75%,牛排未检出除牛肉外的三种动物源成分,但不排除有其他动物源成分的掺入。结论:四重PCR反应体系可用于牛肉掺假检测。  相似文献   

16.
为建立一种能够快速、灵敏、特异的检测甘蔗杆状病毒(sugarcane bacilliform virus, SCBV)的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,针对SCBV的基因序列,设计了特异性扩增引物,利用构建的标准品建立和优化针对SCBV的荧光定量PCR检测方法,并对该方法进行了特异性、稳定性、灵敏性等的测试,随后用于田间样品的检测。结果表明:将含有SCBV基因组序列的重组质粒进行梯度稀释制成标准品,利用标准品进行荧光定量PCR,获得标准曲线y=-3.482 1x+37.264,相关系数r~2=0.999 9,说明CT值与反应起始模板数量呈线性关系,可进行准确定量;组内和组间变异系数在0.19%~1.68%之间,表明检测方法重复性良好;建立的荧光定量PCR方法最低可检测到10个拷贝重组质粒/μL,是常规PCR检测灵敏度的100倍。使用建立的荧光定量PCR方法和常规PCR方法对采集的90份甘蔗叶片样品进行检测,常规PCR检出53份阳性样品,荧光定量PCR检出56份阳性样品,表明所建立的荧光定量PCR方法较常规PCR敏感性高,且准确性高。本研究建立的SCBV荧光定量PCR检测方法重复性好,灵敏度高,为构建甘蔗健康种苗体系提供了一种高效检测方法。  相似文献   

17.
为定量检测现场样品中东海原甲藻的细胞色素b(cytochrome b,Cytb)基因,本研究设计了该基因的特异性引物,并对现场样品反转录反应体系中加入的模板数量和定量PCR反应条件进行了优化.结果表明:设计的引物具有较好的特异性,可有效区分不同的藻类;针对现场样品,在20μL的反转录体系中,适宜加入的RNA模板的量为50 ~ 200 ng;PCR模板稀释10倍或向定量PCR反应体系中加入终浓度为0.2μg·μL-1的牛血清蛋白(BSA)均能有效降低现场样品中抑制物的抑制作用,减小干扰.该方法的建立对从分子水平探讨东海原甲藻暴发和消亡的内在机制具有重要意义.  相似文献   

18.
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染可导致致命性肺炎,且极具传染性。自2019年年末在我国出现以来,已在全球蔓延。为了建立一种灵敏、快速检测SARS-CoV-2的分子检测方法,本研究使用金纳米颗粒配合普通PCR检测方法,针对SARS-CoV-2核衣壳蛋白建立了SARS-CoV-2 NanoPCR新型分子检测方法。特异性结果显示,该方法对猪流行性腹泻病毒、牛冠状病毒、犬冠状病毒、水貂冠状病毒、猫传染性腹膜炎病毒均无交叉反应,表明该方法的特异性良好。敏感性结果显示,该方法的最低检测量为3.69×104拷贝/μL,高于普通PCR最低检测量10倍,表明该方法的敏感性良好。使用建立的方法对3份临床样品进行检测,该方法与普通PCR方法结果一致,10倍稀释样品后,NanoPCR相比较普通PCR条带仍然具有较高辨识度。综上,本研究建立的灵敏、特异的NanoPCR方法可以对临床样品进行快速诊断和鉴定。  相似文献   

19.
根据GenBank中的猪圆环病毒2型(PCV2)ORF4基因序列设计一对特异性引物,通过常规PCR扩增PCV2的ORF4基因,并将其纯化的PCR产物克隆入pMD18-T载体中,构建重组质粒。应用该重组质粒进行EvaGreen实时荧光定量PCR,建立了PCV2 DNA的标准曲线,并进行熔解曲线分析。结果显示:建立的EvaGreen实时荧光定量PCR特异性强,与其他非靶标病毒基因不发生交叉反应;灵敏度高,最高可检测到10拷贝/μL的病毒量;重复性好,3个浓度的批间和批内的变异系数均小于2.5%;对118份临床样品进行检测,阳性样品25份,阳性率为21.2%,检测结果与普通PCR相符率为99.2%,其中一份样品经荧光PCR检测为PCV2阳性,普通PCR检测为阴性。结果表明,建立的EvaGreen实时荧光定量PCR方法具有特异性强、敏感度高、重复性好、简便快捷等特点,可用于临床PCV2感染的早期诊断以及分子流行病学调查。  相似文献   

20.
目的:建立一种能够快速、准确地检测流感病毒亚单位疫苗中间体样品中沙门菌污染的方法。方法:首先利用选择性增菌培养基对样品进行增菌培养,然后提取样品中的细菌基因组DNA,通过沙门茵特异性引物对基因组DNA进行PCR扩增,以琼脂糖凝胶电泳实现对目的片段的检测。结果:该PCR反应体系的扩增检测灵敏度可达1pg的沙门菌DNA,利用选择性增菌培养配合该PCR体系可在最快24h内实现对沙门菌的准确检测,测定结果与传统方法相符。结论:此方法应用于流感病毒亚单位疫苗中间体的沙门菌检查,较之传统的培养法结合生化鉴定的方法,大大缩短了检测周期,降低了结果判读的难度,在实际生产中有很好的应用前景。  相似文献   

设为首页 | 免责声明 | 关于勤云 | 加入收藏

Copyright©北京勤云科技发展有限公司  京ICP备09084417号