CD40/CD40L信号系统与子痫前期的关系

子痫前期是病理产科中常见的疾病,是导致孕产妇和围生儿死亡的主要原因,其具体病因目前尚未完全阐明,大多数学者认为主要与氧化应激导致的血管内皮细胞损伤,胎盘浅着床,免疫平衡的破坏等因素有关,其中内皮细胞损伤导致的内皮细胞生理功能失衡是其病因学研究的热点.CD40/CD40L是一对互补的肿瘤坏死因子和肿瘤坏子因子受体超家族跨膜糖蛋白,相互作用可以促进内皮细胞、平滑肌细胞表达和释放细胞因子、组织因子、金属蛋白酶、粘附分子,这些物质间接或直接的参与了炎症反应和免疫调节,导致内皮细胞损伤.因此,CD40/CD40L相互作用在炎症反应和免疫失调中亦起着关键作用,可能是子痫前期的病因之一,以CD40/CD40L为靶点为子痫前期的诊断和治疗提供了新的思路和方向.本文拟对CD40/CD40L信号系统与子痫前期的关系做一综述.     

CD40-CD40L与斑块的不稳定性

随着对动脉粥样硬化性疾病研究的深入,人们发现众多的心脑血管疾病是由于粥样斑块不稳定所引起。近来研究表明CD40-CD40L不仅在免疫炎症反应中起着重要作用,同时影响斑块的稳定性。     

人可溶性CD14基因克隆表达及功能研究

利用反转录PCR技术,从U937细胞总RNA中,扩增编码人可溶性CD14的基因序列,构建了重组表达质粒pEF1/HisC/sCD14^348aa;用脂质体转染法,实现了在真核细胞中的高效表达;用免疫亲和层析纯化表达产物,纯度达90％以上;PLS刺激U937细胞产生CD14的变化,证明了表达产物具有结合LPS的功能。     

家蚕表达人表皮生长因子gp67信号肽融合蛋白及生物活性的研究

人表皮生长因子(hEGF), 一种由53个氨基酸残基组成的单链多肽, 具有广阔的应用前景。本文主要探讨家蚕表达人表皮生长因子gp67信号肽融合蛋白的生物活性。采用家蚕杆状病毒表达系统来表达该信号肽融合蛋白。构建了重组质粒pBacPAKS-hEGF, 将该重组质粒与线性化病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕细胞, 筛选获得重组病毒vBacPAK-SEGF, 用vBacPAK-SEGF感染家蚕BmN细胞和五龄蚕, Western blot检测表明在家蚕细胞、五岭幼虫的血淋巴和蛹中均有约12 kD的目的蛋白表达。ELISA检测发现在家蚕细胞中的表达量为23 mg/ 106细胞, 五龄幼虫中的表达量可达到82 mg/mL血淋巴。利用小鼠成纤维细胞Balb/c3T3分析家蚕表达的hEGF信号肽融合蛋白的生物活性, 结果表明表达产物能显著促进Balb/c3T3细胞的增值。另外, 研究还发现hEGF信号肽融合蛋白可使新生ICR小鼠体重增 加, 睁眼和萌齿时间提前。本研究为进一步开发利用家蚕表达的hEGF提供理论基础。     

鸡κ干扰素在家蚕杆状病毒表达系统中的表达及其抗病毒活性检测

干扰素（interferon,IFN）是宿主先天免疫系统的重要组成部分,它是抵抗病原体的第一道防御。为了利用家蚕杆状病毒表达系统表达鸡κ干扰素,根据已报道的序列对鸡κ干扰素的基因序列进行家蚕密码子优化,并利用共转染技术成功构建了表达用重组杆状病毒。将重组杆状病毒感染家蚕,成功获得了大量鸡κ干扰素的表达产物,并通过Western blot技术对产物进行了检测鉴定。用细胞病变抑制法对干扰素κ抑制VSV-GFP感染鸡成纤维细胞（CEF）的效果进行检测,结果显示鸡干扰素κ的抗病毒效价可以达到(1.04±0.23)×107 IU·mL-1以上。高效价鸡κ干扰素的成功表达为其在抗家禽疫病等方面提供了重要的试验数据。     

家蚕溶茧酶基因的真核表达及其产物的生物活性检测

为了研究家蚕 Bombyx mori 溶茧酶基因 （cocoonae）真核表达及其产物的生物活性,将溶茧酶基因（GenBank 登录号 EF428980）克隆至杆状病毒转移载体 pFastBac^TM 1 中获得 pFast-cocoonase,将其转化 DH10Bac 感受态细胞后,PCR 方法检测证实所分离的重组病毒 DNA 中含有目的片段溶茧酶基因。用脂质体法 转染家蚕 BmN 细胞,获得重组病毒。SDS-PAGE 分析显示,感染重组杆状病毒 Bac-cocoonase 的细胞表达产物在约为 27.6 kD 处出现特异性条带,这与预测的蛋白大小相符。用该表达产物与茧丝反应后,电镜下观察茧丝的形态,结果表明表达产物对茧丝的丝胶层有一定的水解作用。     

布鲁氏菌L7/L12蛋白的基因克隆与原核表达

本研究对羊布鲁氏菌L7/L12蛋白进行了表达和纯化。首先从布鲁氏菌M5基因组中克隆L7/L12目的基因片段,连接至pMD-19T载体,转化入E.coli DH5α感受态细胞,PCR鉴定及测序鉴定正确后对其进行双酶切,构建重组质粒pGEX-6P-1-L7/L12并利用E.coli BL21(DE3)进行诱导表达。羊布鲁氏菌L7/L12基因片段大小为375 bp。SDS-PAGE检测蛋白大小为13 kD,与预测值相符。Western blotting方法检测其免疫学特性。实验结果表明,成功构建了pGEX-6P-1-L7/L12原核表达载体,并在大肠杆菌中成功表达了L7/L12重组蛋白,Western blotting法检测其具有免疫反应。本实验为下一步研究蛋白功能及布鲁氏菌新型疫苗的研制提供了实验基础。     

编码流感病毒血凝素基因和CD40L的核酸疫苗抗小鼠流感研究

为了检测表达CD40L的质粒能否作为核酸疫苗佐剂提高A/PR8/34流感病毒血凝素(HA)DNA疫苗的免疫应答,构建了表达鼠CD40L的质粒,并将它与A型流感病毒的 HA DNA疫苗用电击的方法共同免疫BALB/C小鼠(各30μg),免疫两次,间隔三周,第二次免疫后1周,用致死量流感病毒A/PR8/34攻击.发现与单独免疫30μg HA相比,血清中抗HA的IgG抗体量明显提高,且以IgG2a抗体提高为主,小鼠体重减轻非常少且体重恢复加快.实验结果显示,CD40L能作为流感病毒核酸疫苗佐剂,提高小鼠抗流感病毒攻击的能力.     

鸡α干扰素在家蚕中的表达及抗病毒活性测定

鸡α干扰素在防御病毒感染及治疗病毒性疾病中起着重要的作用。旨在利用家蚕杆状病毒表达系统研制有活性的鸡α干扰素。首先对鸡α干扰素基因(ChIFN-α)进行了优化与合成,将其克隆到杆状病毒转移载体pVL1393中,与ORF1629缺损的亲本病毒BmBcmid共转染,纯化重组病毒,再感染家蚕幼虫,收集蚕血淋巴以检测α干扰素基因的表达。Western blot分析结果显示,成功表达出分子量约为19 kD的鸡α干扰素。采用细胞病变抑制法在Vero-VSV*GFP系统中测定表达产物的抗病毒活性。所的表达的鸡α干扰素具有明显的抗病毒活性,活性不低于3.2×105 U/mL。利用杆状病毒载体系统成功地表达了具有抗病毒活性的鸡α干扰素的成熟蛋白,为开发廉价高效的鸡干扰素生物制剂奠定了物质基础。     

人TANK结合激酶1的基因克隆、表达及生物活性鉴定

目的:克隆人TANK结合激酶1(TBK1)基因,构建其真核表达载体,检测该基因在293细胞中的表达,并利用萤光素酶报告基因实验检测其生物活性。方法:应用RT-PCR方法,以HeLa细胞RNA为模板,扩增获得TBK1基因,定向克隆到pcDNA3-Flag载体中,以LipofectAMINE2000转染试剂转染pcDNA-Flag-TBK1至293细胞中进行瞬时表达,并利用萤光素酶报告基因实验检测诱导β干扰素(IFN-β)转录的情况。结果:测序结果表明,从人HeLa细胞总RNA中克隆到正确的TBK1基因全长编码序列,利用Western印迹检测其在293细胞中获得有效表达,利用萤光素酶报告基因实验检测TBK1可以诱导IFN-β转录激活。结论:真核表达的人TBK1具有相应的生物学活性,为研究其功能奠定了基础。     

Cloning,sequencing and expression of porcine CD40 ligand in Escherichia coli and human and porcine cells

The CD40L ligand (CD40L) plays an important role in the interaction between antigen-specific T lymphocytes and antigen-presenting cells. The porcine CD40L encoding gene was isolated from porcine peripheral blood mononuclear cells (PBMC) using RT-PCR. Sequence analysis of the cloned CD40L gene showed an open reading frame of 786 base pairs encoding a 262 amino acid protein with a predicted molecular mass of 29 kD. The deduced amino acid sequence of the porcine CD40L shared 82%, 88% and 93% similarity with the CD40L protein of mouse, human and cattle. The isolated CD40L sequence was expressed as a hexahistidine fusion protein in Escherichia coli and purified by affinity chromatography. The analysis of the CD40L-expression in human 293 and porcine MAX cells by immunofluorescence showed its location on the cell surface.     

Programmed cell death: the influence of CD40, CD95 (Fas or Apo-I) and their ligands

Programmed cell death (PCD) or apoptosis is a process whereby developmental or environmental stimuli activate a specific series of events that culminate in cell death. PCD is essential for normal development and abnormality in the process can lead to defects ranging from embryonic lethality and tissue-specific perturbation of postnatal development to a high susceptibility to malignancy. Therapeutics that modulate the regulation of PCD may provide a new opportunity for the treatment of the PCD related diseases and cancer. CD40 and CD95 (Fas/Apo-I) are transmembrane proteins of the nerve growth factor/tumour necrosis factor α receptor superfamily. The death signal of PCD occurs when the CD95 receptor on the cell surface binds to the CD95 ligand (CD95L) or to the anti-CD95 monoclonal antibody (mAb). In contrast, PCD could be inhibited by the survival signal mediated from the binding of the CD40 receptor to the CD40 ligand (CD40L) or to the anti-CD40 mAb. In this review, the interaction of CD40/CD40L and CD95/CD95L on PCD in normal and malignant cells is discussed.     

以杆状病毒为载体在鸡原代骨骼肌细胞中表达IBDV VP2基因

摘要：【目的】本研究旨在构建在鸡原代骨骼肌细胞中表达IBDV病毒VP2基因的重组杆状病毒。【方法】从IBDV适应细胞毒中提取RNA,用RT-PCR技术扩增VP2基因,将其克隆到自主构建的杆状病毒转移载体的CMV启动子之下,通过Bac-to-Bac系统获得VP2重组Bacmid,并将其转染Sf9昆虫 细胞,获得了VP2重组杆状病毒。重组病毒经扩增后以50个MOI感染鸡原代骨骼肌细胞,接种72h后裂解细胞收获蛋白。【结果】蛋白样品经SDS-PAGE和Western blot证实VP2蛋白获得表达,分子量约48kDa,与预测蛋白大小一致,且能被IBDV阳性血清所识别。【结论】重组杆状病毒可以有效地将VP2基因导入鸡原代细胞,并在CMV的启动下表达具有抗原性的VP2蛋白,本研究为研制IBDV及其他重要禽类传染病的杆状病毒载体疫苗奠定了基础。     

传染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因在家蚕中的表达

将传染性法氏囊病病毒(IBDV)细胞致弱株(JD1株)的基因组A节段基因重组于家蚕杆状病毒转移载体pAcHLT-C中,获得的重组转移载体pAcHLT-C-A与线性化病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕培养细胞,获得重组病毒BacPAK-A。DIG标记的DNA点杂交证实重组病毒基因组中含有A节段基因,重组病毒感染家蚕5龄幼虫进行表达, ELISA和Western blotting等结果表明多聚蛋白基因在蚕体内得到了表达,表达产物具有免疫反应性,表达量在感染后5～6 d达到最高。家蚕生物反应器表达IBDV多聚蛋白具有我国的资源优势,为今后研制低成本、实用化的IBDV基因工程疫苗打下基础。     

胶原蛋白多肽-铬（Ⅲ）螯合物对糖尿病小鼠免疫力的影响

目的研究胶原蛋白多肽-铬（Ⅲ）（CPCC）螯合物对由四氧嘧啶诱发糖尿病小鼠的免疫力的影响。方法通过腹腔注射四氧嘧啶造小鼠糖尿病模型,观察胶原蛋白多肽-铬（Ⅲ）螯合物对小鼠血糖、脾指数、胸腺指数、脾细胞增殖能力、NK细胞杀伤活性、CD40、CD40L的表达等指标的影响。结果胶原蛋白多肽-铬（Ⅲ）螫合物可以有效预防小鼠血糖升高,对脾指数、胸腺指数有一定的恢复作用,脾细胞增殖能力明显增强,NK细胞的杀伤活性被提高,CD40、CD40L的阳性表达率增加。结论胶原蛋白多肽-铬（Ⅲ）能活化免疫细胞,恢复和改善小鼠机体的免疫功能,提高小鼠机体的免疫力,一定程度地减轻四氧嘧啶的毒性作用,降低血糖。     

The role of CD40-CD154 interaction in cell immunoregulation

CD40, a member of the nerve growth factor/tumor necrosis factor receptor superfamily, and its ligand, CD154, play essential roles in cell immune responses. The results of many studies have indicated that CD40-CD154 interaction can upregulate costimulatory molecules, activate antigen-presenting cells (APCs), influence T-cell priming and T-cell-mediated effector functions as well as participate in the pathogenic processing of chronic inflammatory diseases, such as autoimmune diabetes, graft rejection, atherosclerosis, and cancer. Ligation of CD40 on cancer cells was also found to produce a direct growth-inhibitory effect through cell cycle blockage and/or apoptosis with no overt side effects on normal cells and treatment with CD154 can heighten tumor rejection immune response as well. However, systemic treatment with CD154 has some potential risks. Therefore, searching for efficient and safe strategies of CD154-based cancer therapy has been a hot topic in human cancer research. This review focuses on the latest discovered functions of CD40-CD154 interaction in cell immune responses and on the new findings of CD154-based human cancer therapy.     

杆状病毒介导的哺乳动物细胞基因转移及其影响因素

杆状病毒作为优良的哺乳动物细胞基因转移载体已在基因治疗、疫苗开发、药物筛选以及基因调控研究等方面发挥巨大作用。但杆状病毒对哺乳动物细胞的嗜性不够广泛、转导效率和转基因表达水平偏低,以及表达持续时间短暂等问题制约其进一步发展,因此如何突破这个制约的瓶颈成为学者们新的关注焦点。针对以上问题,围绕杆状病毒介导哺乳动物细胞基因转移的各种影响因素进行综述。