汉坦病毒HTN261株S基因片段的核苷酸序列测定及分析

黑龙江省是肾综合征出血热(HFRS)的重疫区。近年来HFRS年的发病人数曾超过万人。流行病学和血清学研究表明黑龙江省HFRS疫区主要是姬鼠型,但目前尚缺乏病毒的分子生物学资料。我们对从疫区捕获的宿主动物-黑线姬鼠肺中分离的汉坦病毒HTN261株的S基因片段的全基因序列进行了测定和初步分析。结果如下,HTN261株的S基因片段的全序列长为1697nt。只有一个主要的编码N蛋白的ORF,起始位置为第37nt,终止于1326nt,编码的蛋白长为429aa。没有发现存在ORF2。HTN261株的S基因片段核苷酸序列与HTN型中的病毒株的同源性很高,而与汉坦病毒其他型的同源性较差。从种系发生树分析来看,HTN261株归结于汉坦病毒的HTN型。在HTN型之内,HTN261株和HTN76-118株在一个分枝内。就其核苷酸和蛋白的同源性来说,HTN261株和HTN76-118株的同源性分别是89%(全S基因)和98%(蛋白)。而与中国境内发现的其他汉坦病毒株Z10,HU,Chen4,NC167等基因和蛋白的同源性相对较差。汉坦病毒除具有其宿主的依赖性外,还具有其地理的簇集性。HTN261株和HTN76-118株之间S基因和N蛋白序列的变异性的差异分别为11%和2%,表明HTN261株和HTN76-118株还有不同,可能是不同的亚型。不过,尚有待于进一步研究证明。     

我国SEO型汉坦病毒全S基因核苷酸序列测定

为获得SEO型病毒基因组更为详尽的资料，也为局部暴发的原因提供科学的资料，我国采用病毒分离、McAbs分型。RT－PCR扩增及核苷酸序列测定的方法，在国内首次测出我国SEO型病毒较为完整的全S片段，并与76－118、Seoul,SRⅡ株的核苷酸及氨基酸同源性进行比较，分别为：64．2％、91．8％、96．8％及80．5％、95．4％、97．3％。表明病毒基因组间的重排不是造成发病高峰的原因。     

汉坦病毒S基因片段及其产物的研究

汉坦病毒是肾综合征出血热（ＨＦＲＳ）的病原体,近年来对其Ｓ基因片段生物学特性的研究取得了很大进展。本文不Ｓ基因片段的结构、编码核蛋白（ＮＰ）的免疫原性、抗原决定簇及ＮＰ的重组表达与应用一阐述。     

汉坦病毒陈株S基因编码区的克隆、序列分析及表达

从汉坦病毒陈株感染的Vero-E6细胞裂解液中提取病毒RNA,经逆转录PCR获得病毒S基因编码区约1.3kb cDNA片段,克隆该片段后进行核苷酸序列测定,并与汉坦病毒76-118株进行同源性比较,结果二者核苷酸序列同源性为86%,推导的氨基酸序列同源性为97%.将该基因片段插入原核表达载体pGEX-4T-1,在大肠杆菌中获得高效表达.表达产物为GST-NP融合蛋白.SDS-PAGE检测表达蛋白分子约72kD左右.Western blotting和ELISA试验结果表明,表达产物可与多株抗汉坦病毒核蛋白的McAb发生反应,其抗原表位及McAb反应谱与76-118株相比存在某些差异.     

汉坦病毒陈株S基因编码区的克隆,序列分析及表达

从汉坦病毒陈株感染的ＶｅｒｏＥ６细胞裂解液中提取病毒ＲＮＡ,经逆转录ＰＣＲ获得病毒Ｓ基因编码区约１．３ｋｂｃＤＮＡ片段,克隆该片段后进行核苷酸序列测定,并与汉坦病毒７６１１８株进行同源性比较,结果二者核苷酸序列同源性为８６％,推导的氨基酸序列同源性为９７％。将该基因片段插入原核表达载体ｐＧＥＸ４Ｔ１,在大肠杆菌中获得高效表达。表达产物为ＧＳＴＮＰ融合蛋白。ＳＤＳＰＡＧＥ检测表达蛋白分子约７２ｋＤ左右。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ和ＥＬＩＳＡ试验结果表明,表达产物可与多株抗汉坦病毒核蛋白的ＭｃＡｂ发生反应,其抗原表位及ＭｃＡｂ反应谱与７６１１８株相比存在某些差异。     

汉坦病毒K24株M和S片段基因的结构特征

为研究汉坦病毒K24株M和S片段基因的结构特征,从病毒感染细胞提取细胞总RNA,经35个循环的一次性PCR得到了与理论值相符合产物,将RT－PCR产物直接克隆T载体,要K24毒株M片段的全基因序列共3653个核苷酸,四种核苷酸的酶切和PCR鉴定正确的克隆通过柱纯化后进行序列测定,结果比较分别为A30.44%,T30.14%,G20.72%,C18.70%,GC含量为39.42%,AT含量为60.58%,编码1133个氨基酸。S片段的全基因序列共1772个核苷酸,四种核苷酸的比例分别为A31.30%,G26.05%,T22.79%,C19.77%,GC含量为45.81%,AT含量为54.19%,共编码429个氨基酸。K24株M片段核苷酸全基因和 在酸与HTN型毒株同源率分别为70.7%－71.2%和75.9%-76.9%,与SEO型为95.2%-99.2%和95.9%-99.4%。S片段与HTN76－118和SEO SR－11病毒的比较,核苷酸同源率分别为74.0%和95.6%,氨基酸同源率为83.3%和97.9%,与M片段的结果相类似。M片段氨基酸与SEO型10个毒株存在4个氨基酸替代。应用DNASTAR软件的系统发生分析方法分别绘出了基于M片段核苷酸及氨基酸的系统发生树。     

我国SEO型汉坦病毒全S基因核苷酸序列测定

为获得SEO型病毒基因组更为详尽的资料,也为局部暴发的原因提供科学的资料,我们采用病毒分离、McAbs分型.RT-PCR扩增及核苷酸序列测定的方法,在国内首次测出我国SEO型病毒较为完整的全S片段,并与76-118、Seoul、SRll株的核苷酸及氨基酸同源性进行比较,分别为64.2%、91.8%、96.8%及80.5%、95.4%、97.3%.表明病毒基因组间的重排不是造成发病高峰的原因.     

汉坦病毒的基因分型及其序列分析

为了探讨从核苷酸水平耐汉坦病毒进行分型,设计两对型特异性引物,采用反转录和聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）,对亚太地区１８株汉坦病毒进行了扩增鉴定,并对其中７株汉坦病毒的ＰＣＲ产物进行了测序分析。ＰＣＲ的分型结果表明,Ⅰ型引物只能扩增血清Ⅰ型病毒的ｃＤＮＡ;Ⅱ型引物也只能扩增血清Ⅱ型病毒,其间无交叉反应。采用巢式ＰＣＲ和限制性内切酶验证了ＰＣＲ产物的特异性。序列分析结果表明,Ｒ３６Ｍ片段Ｇ１区的核苷酸序列与血清Ⅰ型病毒代表株７６－１１８的同源性为７８．４％,而与血清Ⅱ型病毒Ｒ２２的同源性为６８．１％;Ｒ３６与汉坦病毒序列同源性的成对比较结果也表明,Ｒ３６与血清Ⅰ型病毒的同源性均高于血清Ⅱ型病毒;Ｌｅａｋｅｙ虽然能被Ⅱ型引物扩增,但其序列与血清Ⅱ型病毒Ｒ２２的同源性仅为４４．９％,故不属于血清Ⅱ型病毒。上述研究结果表明,反转录聚合酶链反应能对多数汉坦病毒准确分型,但最终结果尚有赖于序列分析。     

汉坦病毒中国疫苗株Z37M片段的克隆及序列分析

汉坦病毒Z37株是从褐家鼠体内分离到的,用于生产双价肾综合征出血热疫苗的病毒毒株之一,血清分型为SEO型,利用RT－PCR方法扩增Z37株M基因片段cDNA,克隆入质粒载体,进行核苷酸序列测定及分析。Z37株M基因片段由3651个核苷酸组成,只有一个开放读码框架,共编码1133个氨基酸。与HTN型病毒（76－118、A9、HV－114）的核苷酸和氨基酸同源性分别为71.8%-72.1%、76.2%-76.7% ,与SEO型（R22、L99、80－39）的核苷酸和氨基酸同源性分别为95.3%-96.1%、95.3%-98.9%。这一结果的获得进一步从分子水平确定了Z37株的型别,并为研制M基因片段重组疫苗打下基础。     

黑龙江省大林姬鼠中汉坦病毒的分离及其S基因序列分析

为了研究黑龙江省大林姬鼠携带汉坦病毒(HV)的分子特征,对黑龙江省大林姬鼠分离株NA33的S基因进行了扩增和序列分析。结果表明,NA33株S基因全长由1 693nt组成,TA含量丰富,编码N蛋白的ORF起始于37nt,终止于1 326nt,编码的蛋白长429aa,符合HTN型编码。与HV参考毒株进行比较,NA33与Amur类汉坦病毒同源性最高,与其它HTN型相对较低,与SEO等同源性更低。N蛋白进化树分析表明,NA33位于Amur类病毒所在支系,并且与俄罗斯远东和吉林大林姬鼠分离株亲缘关系更接近,体现了一定的宿主依赖性和地理簇集性。序列分析发现,NA33的N蛋白具有Amur类汉坦病毒保守的氨基酸位点。黑龙江省大林姬鼠携带Amur类汉坦病毒,是重要的传染源。     

汉坦病毒沟3株PCR分型

汉坦病毒 (HV)沟 3株在以往报道的免疫学中和效价检测 ,为一株中和抗原广谱的毒株。本研究对这一毒株经过两次挑斑纯化 ,并经PCR方法进行分型检定 ,初步认为沟 3毒株为SEO型HV病毒。     

戊型肝炎病毒中国XT—179株全基因组Cdna克隆及其核苷酸和氨基酸序列分析

本文报道对中国新疆东部一起戊型肝炎流行高峰期间,由ＨＥ患者烘便中分离到的型肝炎病毒中国ＸＴ－１７９株进行全基因ｃＤＮＡ克隆、核苷酸和氨基酸序列测定及分析结果。所阐明的ＨＥＶ－ＸＴ－１７９株基因组全序列由７１９４个核苷酸和３＇端的多聚腺嘌呤核苷酸尾组成。四种核苷酸的含量腺嘌呤（Ａ）为１７．０％,胞嘧啶（Ｃ）为３１．９％,鸟嘌呤（Ｇ）为２６．０,尿嘧啶（Ｕ）为２５．１％。Ｇ＋Ｃ含量为５７．９％。全基因     

我国分离的肠道病毒71型(SHZH03病毒株)全基因组核苷酸序列分析

对肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)中国(深圳)分离株SHZH03进行了全基因组(未包括多聚腺苷尾)7406个碱基的核苷酸序列测定.结果表明,SHZH03株与其它肠道病毒71型毒株相比,在编码区没有核苷酸的缺失和插入,其5′UTR和3′UTR区的长度和序列有一定的差异.核苷酸同源性比较结果表明,在P1区SHZH03株与SHZH98株、中国台湾流行株(TW2086、TW2272)的同源性较高(分别为92.5%,90.1%和87.9%),与新加坡流行株SIN5666、SIN5865及标准株MS、BrCr的同源性则在81%左右,而与Coxsackievirus A16(Cox.A16)的同源性最低(63.6%).氨基酸同源性比较结果表明,在P1区SHZH03株与Cox. A16的同源性最低,但在P2和P3区SHZH03株与Cox.A16的同源性最高.P1区的遗传进化分析表明,SHZH03株和中国台湾1998年流行的EV71毒株的亲缘关系较近,属于同一型(genogroup),而与标准株BrCr和MS的亲缘关系较远.上述结果有助于肠道病毒71型的基础研究和中国对于EV71所致疾病的预防.     

Complete Genome Sequence of an Enterovirus 80 Strain Isolated in China

Enterovirus 80 (EV80) is a newly identified serotype of the species Human enterovirus B. An EV80 strain designated HZ01/SD/CHN/2004 was isolated from an acute flaccid paralysis case in Shandong, China, in 2004. Complete genome comparison revealed 79.5% similarity with the prototype strain and an insertion of 36 nucleotides in the 3′ end of the VP1 coding region. Intertypic recombination with other serotypes was observed. This is the first report of the complete genome of EV80 in China.     

暴发脑膜脑炎流行的新型毒株的全基因序列

吉林省延边地区１９９６年６月发生无菌性脑膜脑炎流行,从病人脑脊液和粪便标本中分离到多株病毒,血清学实验证明所分离的病毒为此次无菌性脑膜脑炎流行的病因。对其中的２株病毒（Ｙａｎｂｉａｎ９６－８３ｃｓｆ和Ｙａｎｂｉａｎ９６－８５ｃｓｆ）测定了全基因核酸序列并帮了比较分析。结果所测２株病毒核酸长度均为７４５６ｂｐ〔包括３端ｐｏｌｙ（Ａ）尾〕,两者间仅有１３个位点不同,同源性达９９．８％,在进化树上位于同     

Complete Genome Sequence of Peanut stripe virus Isolated in China

The complete genome sequence of a Laixi isolate of Peanut stripe virus (PStV‐Laixi) from China was determined to be 10, 056 nucleotides in length, excluding the 3′‐terminal poly (A) tail. The viral genome contains a single long open reading frame of 9669 nucleotides encoding a polyprotein of 3222 amino acids. The polyprotein was predicted to be cleaved into ten functional proteins by three viral proteases. An additional protein, termed ‘PIPO’, is also found in the P3 cistron. The complete genome sequence comparison and phylogenetic analysis indicated that PStV‐Laixi was most closely related to three other isolates of PStV (two from USA and one from Taiwan). To our knowledge, this is the first report of the complete sequence of a PStV isolate from China.     

湖北省不同地区汉坦病毒M片段的分析研究

参考汉坦病毒（ＨＶ）的基因文库软件设计Ｍ片段Ｇ－１区型特异性引物,以ＨＶ　７６／１１８、Ｈ－１１４、Ａ－９及Ｒ－｛２２｝株ＲＮＡ为阳性模板,建立ＨＶ的分型方法──逆转录一半巢式聚合酶链反应（ＲＴ－ｈｅｍｉｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲ）,对湖北省不同地区分离的３０株ＨＶ进行分　型。结果显示：（１）建立的ＲＴ－ｈｅｍｉｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲ分型方法对ＨＶ两型的代表株７６／１１８（ＨＴＮ）、Ａ－９（ＨＴＮ）、Ｈ－１１４（ＨＴＮ）及Ｒ－｛２２｝（ＳＥＯ）ＲＮＡ进行了特异性扩增,其大小与理论值一致;此　法只能检测ＨＶ　ＲＮＡ,不能检测其它病毒ＲＮＡ。（２）分离于湖北省不同地区的３０株ＨＶ的分型结果　为汉滩型２１株、汉城型９株,其中长江以南汉滩型１２株、汉城型２株;长江以北汉滩型９株、　汉城型７株。这表明建立的ＲＴ－ｈｅｍｉｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲ用于ＨＶ的检测特异性好;分析湖北省不同　地区分离的３０株ＨＶ,显示湖北省ＨＦＲＳ流行为混合疫区;且在湖北地区具有一定的地理聚集性。