番木瓜抗病突变体阻碍环斑病毒体内运转

应用RT-PCR一步法检测了PRSVYs株系在感病番木瓜及其抗病突变体植株体内的运转动态,结果表明在感病植株中,接种后48hr接种叶的未接种部位可检出病毒,第4天部分接种叶柄可检出病毒,第6天植株各部位均能检出病毒;而在抗病植株中,接种后可以而且仅能在接种部位检出病毒;因而认为抗病突变体能够阻碍病毒从接种部位运出及（或）向未接种部位运入。     

抗病基因Bdv2抑制大麦黄矮病毒复制和运动的分子证据

小麦-中间偃麦草易位系YW642含有一个源于中间偃麦草7X染色体的抗性基因Bdv2,对大麦黄矮病毒GAV株系具有高度抗性。为有效控制该病毒和阐明抗黄矮病机制,采用半定量RT-PCR的方法,研究了大麦黄矮病毒GAV株系在YW642及其感病姊妹系YW641中积累浓度的差异。分别在接种病毒不同时间、不同部位上取样,用半定量RT-PCR的方法来检测GAV的积累浓度。在接种部位,抗病植株中病毒的浓度远远低于感病植株。在侵染的前5d,抗病植株YW642中病毒会有一定程度的复制和积累,但随后病毒浓度开始下降,接种14—16d时没有检测到病毒;而在感病株系中,病毒积累的浓度远远高于抗病植株,并一直维持一个较高的浓度。在未接种部位．感病植株中可检测到较高浓度的病毒,说明病毒能从接种点很快运动到未接种部位,并大量复制。而在抗病系YW642中,未接种部位始终未检测到病毒。实验结果从分子水平上证明,在抗病植株中BYDV的复制和运动均受到了极大的抑制：这是抗病基因Bdv2与BYDV互作后,激活了一系列防御基因的结果。另外还确定了防御基因诱导表达的时间,为从抗病植株中分离抗病相关基因、研究抗黄矮病机制提供了取样的依据。     

烟草抗黑胫病突变体的细胞筛选

经实验我们成功地建立了在细胞水平上筛选烟草抗黑胫病突变体的筛选体系。该体系的主要内容为:γ-射线500—2000拉德诱变高度感病品种的花药后用50—80％的黑胫病菌粗毒素为选择压力,筛选出抗毒素花粉植株,用离体叶片法测定选出抗病植株,再从后代鉴定中选出抗病性能够稳定遗传的突变系。γ-射线及高浓度毒素处理均能得到抗病植株。选自感病品种的花粉植株中约有9—50％是真正抗病的。这些抗病植株中有一部分的抗病性能够稳定遗传。用该法已从感病优质品种小黄金1025及乔庄黑苗中选出6个突变系。并自N.C.628(抗)×小黄金1025(感)及N.C.628(抗)×庆胜2号(感)的F_1花粉植株中选出4个抗病系。所有的抗病系经3—4代后均表现出稳定抗性。其中一个突变体(R400)的抗性似由不完全显性多基因控制。     

CMV抑制PVYN CP基因沉默及其介导的抗病性

以前曾报道用RNA介导的抗病毒策略,获得了高度抗病的表达马铃薯Y病毒坏死株系外壳蛋白基因(PVY^N CP)的转基因烟草,并对T1、T2代转基因植株进行了遗传和抗病性分析。此次以T,代转基因植株为试验材料,在筛选高度抗病植株并证明其抗病性是基于转基因沉默的基础上,采用Northern杂交的方法,证明CMV侵染抑制了转基因植株中PVY^N CP基因的沉默,而且CMV对PVY^N CP基因沉默的抑制部位是发生在接种后的新生叶上,接种叶及其下部叶片中PVY^N CP基因沉默则未受到影响。采用ELISA方法对CMV PVY^N复合接种的转基因植株进行PVY^N检测,结果表明,接种叶及下部叶没有检测到PVY^N,植株叶片对PVY^N表现为抗病。而在CMV接种后植株新生叶中则检测出了高滴度的PVY^N,植株叶片对PVY^N表现为感病。该文报道了在表达PVY^N CP基因的RNA介导抗性转基因植株中,异源病毒侵染抑制了转基因的沉默,并导致转基因植株的抗病性丧失。     

烟草抗CMV突变体的抗病性分析

在突变体植株“Ea201主、Ea201侧、Aa201侧”的5～6叶期接种CMV汁液,并按优选法去除病症最严重的病株,6周后将剩余植株分别移栽到田间露地和防虫网内,到盛花期分别统计植株的感病情况。其结果为：在田间露地和防虫网内,①感病的对照品种的植株高度只及健康的对照植株高度的30％和40％,突变体的则可达到70％和80％;②对照品种的植株感CMV的病情指数可达90％和50％,突变体的则只有30％和3％;③对照品种植株感TMV的病情指数可达60％和30％,突变体植株感TMV的病情指数只有30％和10％;④突变体植株群体中有症状回复现象,同时其育性不受任何影响。从而表明所筛选到的烟草突变体“Ea201主、Ea201侧、Aa201侧”对CMV、TMV的相对抗性较好,具有较高的抗病性。     

小麦抗条锈病近等基因系感染条锈病后丁布含量变化

选用2套遗传背景不同的抗条锈病近等基因系作为供试寄主材料,研究了不同抗条锈病近等基因系丁布的含量及其在感病过程中丁布含量的动态变化.结果表明,在未受病菌侵染情况下,2套分别含有Yr2、Yr9和YrSpP基因的近等基因系（抗病系）与其轮回亲本Taichung 29、铭贤169(感病系)间丁布含量没有显著差异（P＞0.05）.接种条锈病菌后,感病系在病菌侵染初期丁布含量下降,而抗病系在病菌侵染初期丁布含量迅速大幅度上升.感染条锈病最终导致感病植株丁布含量比未接种的植株明显减少, 感病系的减少幅度明显高于抗病系.在整个病程中,抗病系丁布的含量始终高于感病系,表明接种条件下小麦植株体内丁布含量变化与小麦抗条锈近等基因系的抗性有关.     

RNA介导的病毒抗性在转基因烟草中的遗传分析

以含非翻译马铃薯Y病毒外壳蛋白(PVY—MCP)基因的抗病和感病T0代转基因烟草为材料,对转基因及RNA介导的病毒抗性在T1～T4代转基因植株中的遗传进行了研究。结果表明,在含低拷贝(1～2个)转基因的感病植株后代中,转基因是作为一个单显性遗传位点,遵循孟德尔遗传分离规律,各世代转基因植株仍表现感病。含多拷贝(4～6个)转基因的抗病植株,转基因在T1代的分离虽符合多位点插入的15：1和63：1遗传规律,但转基因发生了重排,RNA介导的病毒抗性表现为不稳定遗传。从含多拷贝转基因的抗病植株的T1代株系中,分离获得了两株含2个拷贝转基因的抗病植株;其后代中,转基因及抗性遗传遵循孟德尔遗传分离规律,可稳定遗传和表达,获得纯合的抗病转基因株系。对转基因在不同抗病类型植株中整合方式分析显示,抗病植株中多存在转基因的反向串联重复序列。     

青枯病病菌对茄子相关防卫信号基因表达及活性氧含量的影响

本文以茄子抗青枯病自交系和感病自交系为试材,在接种青枯病菌后,对调控抗性反应的不同信号传导基因进行表达特性分析。结果表明,在9个基因中,EDS1、PAD4、NPR1、SGTI和WRYK70等5个基因的表达均随着接种诱导时间延长而增加,而且在抗病自交系‘E-31’中的表达量要高于感病自交系‘E．32’;而JAR1、NDR1、EIN2YeaRARl等基因的表达随着接种诱导时间的增加,表达水平变化不大。初步推断EDS1、PAD4、NPRI、SGTI和WRYK70可能与调节茄子抗青枯病抗性反应有关。同时茄子在接种后活性氧的含量均增加,但是感病植株的含量高于抗病植株。     

辣椒感染疫病后生化指标的响应研究

采用生理生化分析方法研究了辣椒感染疫病后叶片中几个生化指标的变化。结果表明,染病前后感病品种叶片中可溶性总糖含量持续高于抗病品种;抗病类型品种和感病类型品种的可溶性蛋白含量变化规律均表现为先升高后下降,但接种前其叶片中可溶性蛋白含量两者间无明显差异;抗病类型和感病类型辣椒接种后保护酶活性均升高,而且感病类型的POD和ASP酶活性在接种后120h显著高于抗病类型;高抗类型叶片中PPO活性增加幅度显著大于感病类型,但抗病类型品种PPO活性上升趋势比较平缓。接种后,感病品种PAL活性上升幅度小于高抗品种,接种后96h PAL活性开始逐渐下降。可溶性总糖含量和苯丙氨酸解氨酶可以作为辣椒苗期抗疫病鉴定的生化指标。     

接种不同毒力的马立克氏病病毒后鸡病毒血症的动态比较

1日龄非免疫鸡分别接 马立克氏病病毒（MDV）Ⅰ强毒GA株、Ⅰ型MDV疫苗毒CVI988株和Ⅲ型火鸡疱疹病毒（HVT）疫苗株后第4日起,定期采血并和抗MDV囊膜糖蛋白B(gB)单克隆抗体介导的间接免疫荧光试验检测MDV在外周因液单核细胞（PBMCs）中的感染状况。结果发现,自接种Ⅰ型强毒GA株后第4日至鸡发病死亡前,都能检出GA株引起的病毒血症,并于2周左右达到高峰;自接种CVI988株后第4日至第20日止,能检出病毒血症,并于第8天左右达到高峰;自接种HVT后第4日至第16日止,能检出病毒血症,并于第6天左右达到高峰。与此同时,将GA株病毒血症的IFA检测结果与细胞培养上病毒空班计数试验结果比较,发现IFA试验比空斑计数试验更为敏感。本试验既可用于判断对鸡作MDV疫苗免疫的接种效果,又可用于检测MDV野毒感染状态。     

几种化学制剂对番木瓜抗环斑病毒和防御酶活性的影响

研究几种化学制剂对番木瓜抗环斑病毒和叶片中防御酶活性影响的结果表明,接种番木瓜环斑病毒后,植株叶中多酚氧化酶（PPO）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）的活性均明显升高,其中PPO和POD总体的升高幅度大,SOD的总体升幅较小;病毒必克的升幅较大,83增抗剂和水杨酸的升幅较小。83增抗剂、水杨酸和病毒必克均能使番木瓜叶中PPO、SOD和POD活性持续升高,有效减轻了环斑病的病情,防治效果依次为83增抗剂〉水杨酸〉病毒必克。     

番木瓜感染环斑花叶病毒后蛋白质和还原糖的变化

本文对番木瓜不同抗性的品种感染环斑花叶病毒后,可溶性蛋白含量和电泳谱带以及还原糖含量的变化规律进行了研究,并分析其与抗性的关系。结果表明,接种处理后,感病品种(岭南种)的可溶性蛋白含量变化率的峰值较抗病品种(穗中红48号)出现早且高;前者出现在接种后24h,高达54.6%,而后者出现在接种后48h,为38.2%。在未接种处理时,感病品种叶片可溶性蛋白谱带较抗病品种多1条;但在接种初期(接种后24h),抗病品种的蛋白谱带比感病品种多1条(Rf值为0.602)。不同抗性品种在接种后的还原糖含量变化也有差异,抗病品种的还原糖含量变化率在接种后48h达到高峰,峰值为12.3%;而感病品种的还原糖含量变化率在接种后都为负值。     

dsRNA介导的番木瓜环斑病毒（PRSV）的抗病性研究

以模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）和烟草（Nicotiana tabacum）及PRSV寄主植物番木瓜（CaricapapayaL.）作为试验材料,开展了番木瓜环斑病毒外壳蛋白基因dsRNA介导的PRSV病原抗性的研究。利用农杆菌介导法将番木瓜环斑病毒外壳蛋白CP基因反向重复表达载体pHellsgate12-CPIR（简称PHG12-CPIR）分别转化到烟草和拟南芥中,获得阳性植株,并利用渗透法和农杆菌介导的瞬时表达体系将pHG12-CPIR载体导入到番木瓜中。对转基因植株进行攻毒试验并分析了其抗病性。在接种3~7d内,在拟南芥和番木瓜上转基因植株的发病情况较轻,而野生型植株叶片与转基因植株相比,均表现出不同程度的黄化、皱缩和枯斑等症状。在接种PRSV后,番木瓜和拟南芥转化植株表现症状的叶片的比例与对照相比,结果显著低于对照,而在烟草植株上症状表现的差异不明显。在3种植物上RT-PCR检测结果显示,在接种番木瓜环斑病毒PRSV后,野生型植株中有高浓度的病毒积累,而转pHG12-CPIR基因植株中几乎没有病毒积累,推测转pHG12-CPIR基因植株中瞬时表达系统已启动RNAi机制抑制了CP基因的表达。     

转基因番木瓜研究进展

番木瓜环斑病毒 (PRSV)使热带亚热带的重要水果番木瓜的生产受到严重影响 ,在众多方法防效不佳的情况下 ,利用病原获得抗性防治PRSV给番木瓜的生产带来了光明。综述了近年来转PRSVCP基因番木瓜中影响番木瓜转化因素和转基因番木瓜的抗性因素。转PRSV外壳蛋白 (CP)基因的番木瓜中多以胚性组织为转化材料 ,被转化材料的生理状态和基因型 ,是影响转化效率和转基因植株质量的主要因素。所获得的转基因番木瓜对PRSV的抗性在很大程度上依赖于接种PRSV与所转化PRSVCP基因的序列同源性、转基因拷贝数和所转基因的位置等。     

Variation in the Coat Protein Gene of Papaya ringspot Virus Isolates from Multiple Locations of China

The potyvirus Papaya ringspot virus （PRSV） is an important pathogen of papaya that causes severe losses in economic crops for papaya production globally. The coat protein （CP） genes of five PRSV isolates originating from different locations in China were cloned and sequenced. The CP-coding region varied in size from 864-873 nucleotides, encoding proteins of 288-291 amino acids. The five Chinese isolates of PRSV have been characterized as papaya-infecting （PRSV-P）. The CP sequences of the Chinese isolates were compared with those of previously published PRSV isolates originating from different countries at amino acid levels. A number of KE repeat boxes in the N terminus of the PRSV-CP were found in all Chinese isolates. The phylogenetic branching pattern revealed that there was certain extended grouping between geographic locations, and the Asian type probably represents the oldest population of PRSV. The information of CP genes will be useful in designing and developing durable virus resistant-PRSV transgenic papaya in China. Meanwhile broad-spectrum-virus resistant, strongly resistant-PRSV and good safe papaya lines are required.     

Production of Polyclonal Antibodies Using Recombinant Coat Protein of Papaya ringspot virus and their Use in Immunodiagnosis

Production of polyclonal antibodies requires large amount of purified virus that can be avoided by the use of recombinant coat protein (CP). Recombinant CP of Papaya ringspot virus (PRSV) was thus used for the production of polyclonal antibodies as the virus purification from papaya tissues provides low virus yields. CP was expressed as a fusion protein (～72 kD) containing a fragment of E. coli maltose binding protein. Polyclonal antibodies from rabbits immunized with the fusion protein, successfully detected natural infection of PRSV in papaya and cucurbits samples collected from different locations at 1:4000 dilution in direct antigen-coated enzyme-linked immunosorbent assay.     

Analysis on virus resistance and fruit quality for T4 generation of transgenic papaya

Molecular biological characterization,fruit characters,and nutrients were analyzed for T4 generation of transgenic papaya.All transgenic papaya plants with the mutated replicase (RP) gene from papaya ringspot virus (PRSV) showed high resistance or immunity against PRSV in the field.The RP transgene can be steadily inherited to,and expressed at RNA level,the progenies.The growth characteristics of transgenic papaya were much better than nontransgenic papaya in the field.The non-transgenic papaya seedlings began to show typical symptoms caused by PRSV after being inoculated with PRSV.They died quickly and never grew to produce fruit.The adult trees developed yellow leaves and produced smaller fruits and were doomed to a slow death after some time,while most oftransgenic papaya plants (about 91.8%) did not show any symptoms caused by PRSV,and produced more,bigger,and high quality fruits.Compared with non-transgenic plants,the fresh fruit length of T4 generation of transgenic papaya increased 2.6%-5%,and the diameter decreased 0.6%-1.5%.The flesh thickness of fresh fruit increased 12%-15%,which made it fitter for eating.Although the fresh fruit quality changed,there was no significant difference between transgenic and non-transgenic papaya.The quality characteristics of dry fruit including the contents of water,lipid,N,protein,reduced sugar,vitamin A,vitamin C,and carotene in the T4 generation of transgenic papaya were all the same as their non-transgenic parents.This means that transgenic plants and non-transgenic plants are substantially equivalent,and the transgene has no effect on dry fruit quality.In this study,we found that vitamin A and vitamin C in red-fleshed papaya were 1.4-1.8 and 1.78-2.07 times more than the yellow-fleshed ones,respectively,while N and protein were only 84.2%-92.1% and 82.1%-98.9% of the yellow-fleshed ones.