多重PAP及多重PAP结合ABC免疫细胞化学方法的建立、敏感性分析与应用

作者在传统的 PAP 及 ABC 染色方法的基础上,通过重复使用桥抗及 PAP 的次数或重复使用生物素化桥抗及 PAP 和 ABC 的次数,使 PAP 与 ABC 方法成功地结合,增加连接于抗原部位的酶分子数,建立起两种敏感的免疫细胞化学方法。染色结果经显微分光光度图象分析,方差分析,回归分析及染色效果的直接观察表明,重复染色可增加阳性强度,扩大阳性染色范围,提高信噪比,从而提高方法的敏感性,以生物素化桥抗取代非生物素化桥抗,将 ABC 引入到多重 PAP 方法中,可使方法的敏感性进一步提高。该方法结合单克隆抗体及多克隆抗体成功地检测出用传统双PAP 及 ABC 难以或不能检测出的常规福尔马林固定石蜡包埋的肾综合征出血热尸检组织中的病毒抗原及石蜡包埋肿瘤活检组织中的桥粒抗原。     

1组曲霉单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备并鉴定一组抗曲霉不同抗原的单克隆抗体。方法采用烟曲霉细胞壁抗原成分、分泌抗原和灭活分生孢子,分别免疫BALB／c小鼠,制备单克隆抗体,免疫荧光法鉴定单克隆抗体与曲霉属和念珠菌属抗原的交叉反应。结果获得29株稳定分泌抗曲霉单抗的杂交瘤细胞株,其中用烟曲霉细胞壁抗原成分免疫获得11株,用分泌抗原免疫获得13株,用孢子免疫获得5株;Ig亚类鉴定,11个克隆株为IgG1亚类,3个克隆株为IgG3,15个克隆株为IgM。免疫荧光法鉴定29株单抗特异性识别烟曲霉细胞壁抗原,与其他曲霉抗原有交叉反应。结论29株单克隆抗体,对于建立侵袭性曲霉感染早期诊断方法、筛选曲霉保护性抗体以及研究抗体保护机制奠定了实验基础。     

流行性出血热病毒在疫区鼠间垂直传播的首次证实

流行性出血热(EHF)病毒在鼠间垂直传播的问题一直未被证实。1985～1986年我们在实验研究的基础上进行了疫区现场研究,采用的基本方法是从感染的孕鼠子宫内剖取胎鼠,用免疫荧光法作抗原、抗体检查和病毒分离,结果从流行性出血热疫区捕获的4只黑线姬鼠孕鼠的胎鼠体内检出了特异性抗原和抗体(IgM和IgG)。从24只抗原阳性的褐家鼠孕鼠中检出抗原阳性胎鼠18只,垂直传播率达75％。从褐家鼠孕鼠和胎鼠中分离出病毒六株,经特异性试验和单克隆抗体鉴定确认为EHF病毒。上述事实证明,在自然条件下,流行性出血热病毒在疫区鼠类中存在着经胎盘感染或垂直传播。这一证实对于阐明疫源地形成、延续和扩散,以及人类发病等具有重要意义。     

抗人IgG和抗人IgM单克隆抗体的特性鉴定及应用

目的:制备特异性高的抗人Ig G和抗人Ig M单克隆抗体,并应用于临床血清学检测试剂盒,为其提供优质的二抗。方法:以人Ig G和Ig M为抗原,免疫BALB/c小鼠,通过传统杂交瘤融合和筛选技术制备抗人Ig G和抗人Ig M单克隆抗体;经体内诱生法制备腹水并纯化;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western印迹进行交叉筛选和特异性鉴定,并对筛选出的单抗进行辣根过氧化物酶(HRP)标记,再与市售的检测病原微生物抗体试剂盒中对应的HRP标记的二抗(抗人Ig G和抗人Ig M)做对比分析。结果:筛选到2株可稳定分泌抗人Ig G单抗和2株抗人Ig M单抗,经交叉反应、Western印迹及对比实验分析,证明这4株单抗效价高、特异性好,比临床试剂盒中的酶标二抗特异性强、敏感度高。结论:获得4株特异性强、敏感度高的抗人Ig G和抗人Ig M单克隆抗体,可为各种病原微生物血清学的检测提供二抗试剂,具有良好的应用价值。     

流行性出血热病人尸检材料中的病毒包涵体

应用抗流行性出血热病毒多克隆及单克隆抗体结合敏感的方法在尸检组织切片上进行了免疫细胞化学染色,多克隆抗体可清楚地显示出尸检组织中病毒抗原阳性的包涵体结构。依光镜下染色的形态特点不同,可将包涵体分为四个类型即小泡型、大泡型、多泡型和实心型。单克隆抗体染色进一步证实,实心型及空泡型包涵体呈“N”抗原阳性,少数组织中空泡状包涵体也呈“G2”抗原阳性。病毒包涵体的出现可作为该病毒在人体细胞内感染及复制的形态学证据。     

流式细胞术检测人巨细胞病毒活动性感染检测方法的建立及检测效果评价

探讨流式细胞术检测人巨细胞病毒活动性感染检测方法的可行性及效果评价。分离人外周血白细胞,以商品化的小鼠抗人巨细胞病毒pp65抗原单克隆抗体为一抗,FITC标记的羊抗小鼠IgG抗体为二抗,采用流式细胞术对外周血人巨细胞病毒pp65抗原进行检测。同时采用间接免疫荧光法对外周血人巨细胞病毒pp65抗原进行检测。采用配对χ2检验对两种方法的检测效果进行评价。临床送检的65份疑似为人巨细胞病毒感染病人外周血标本中,间接免疫荧光法检出阳性9份,流式细胞术检出阳性11份,两种方法阳性检出率差异无统计学意义(P0.05)。采用流式细胞术可定量检测外周血人巨细胞病毒pp65抗原,与间接免疫荧光法检测结果无统计学差异,可在临床推广使用。     

蚕豆萎蔫病毒单克隆抗体制备及检测应用

:用蚕豆萎蔫病毒(BBWV)免疫的BALB/C鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选克隆,获得6株能稳定传代并分泌抗BBWV单克隆抗体(Mab)的杂交瘤细胞株,单抗腹水ELISA滴度为1:320000～1:640000,各单抗抗体类型均为IgG1。6株单抗与BBWV不同分离物均有反应,而与其它植物病毒无交叉反应。经Westernblot印迹分析表明,此6株单克隆抗体均是针对BBWV447kD的外壳蛋白大亚基的特异性抗体。这是国内外首次报道获得BBWV单克隆抗体     

百合无症病毒单克隆抗体的制备及检测应用

用百合无症病毒(Lilysymptomlessvirus,LSV)免疫的BALBC鼠脾细胞与SP20鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选克隆,获得4株能稳定传代并分泌抗LSV单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞(2A2、5H9、5H2和5E12),并分别制备它们的单抗腹水。4株单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10-6,5H9和5E12的抗体类型及亚类均为IgG1,而2A2和5H2均为IgG3,4株单克隆抗体的轻链均为κ链。利用单克隆抗体建立了抗原包被间接ELISA(ACP-ELISA)检测LSV的方法。病叶作1300倍稀释、提纯LSV病毒浓度为18ngmL(每孔的病毒绝对量为1.8ng)时,该方法仍能检测到病毒。利用ACP-ELISA检测了田间样品,发现LSV在百合上发病很普遍。     

间接ELISA法在注射用矛头蝮蛇血凝酶蛇毒种属鉴别中的应用

目的建立间接ELISA法定性检测矛头蝮蛇血凝酶,用于巴曲亭蛇毒种属来源检测。方法将矛头蝮蛇血凝酶为抗原免疫小鼠,与尖吻蝮蛇血凝酶、白眉蝮蛇血凝酶交叉筛选获得特异性单克隆抗体。优化矛头蝮蛇血凝酶单抗(一抗)、HRP标记的羊抗鼠(二抗)IgG、矛头蝮蛇血凝酶(抗原)工作浓度,建立间接ELISA检测方法。考察方法的重复性、中间精密度,确定方法的适用性。采用膜超滤法将巴曲亭中辅料去除,按照建立的ELISA法检测,判定种属来源。结果矛头蝮蛇血凝酶单抗具有强特异性,一抗的最佳工作浓度1∶4000(250ng),二抗的最佳工作浓度1∶4000(250ng),抗原浓度2μg/孔,该法重复性和中间精密度较好。巴曲亭与矛头蝮蛇血凝酶单抗有特异性反应,与其它蛇毒来源血凝酶单抗无交叉反应,确定巴曲亭来源于矛头蝮蛇蛇毒。结论本研究建立的ELISA法具有较好的特异性,可作为巴曲亭蛇毒种属来源判断的方法。     

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白单克隆抗体的制备及初步鉴定

为制备牛病毒性腹泻病毒(BVDV)糖蛋白E2单克隆抗体(MAb),利用原核表达并且纯化的重组糖蛋白E2(rE2)免疫BALB/c小鼠,取免疫后小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合.采用以BVDV为检测抗原的间接ELISA筛选阳性细胞克隆,经3次克隆纯化后获得2株稳定分泌抗E2特异性MAb的杂交瘤细胞株,分别命名为4E3与1G11.用4E3与1G11杂交瘤细胞株接种BALB/c小鼠制备腹水,采用rE2及BVDV包被的ELISA测得的效价分别是6.21×106和6.83×105及6.83×105和7.5×104.间接ELISA、Western blot、IFA试验表明两株杂交瘤细胞所分泌的MAb具有良好的反应性和特异性.经抗体亚类鉴定4E3与1G11均为IgM/K.特异性试验表明4E3与1G11这2株MAb均不与牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型、牛腺病毒3型反应;其中4E3不与猪瘟病毒反应,而1G11则可与猪瘟病毒发生交叉反应,这种反应特性可试用于BVDV与猪瘟病毒的鉴别诊断.所制备的4E3与1G11 MAb可以用于BVDV抗原的检测,为建立检测BVDV E2蛋白血清抗体的ELISA奠定了基础.     

A REINTERPRETATION OF THE ONTOGENY OF THE ASCOCARP OF SPECIES OF THE ERYSIPHACEAE

A study of four species of Erysiphaceae (Uncinula salicis, Podosphaera leucotricha, Erysiphe cichoracearum, and Microsphaera diffusa) revealed that the binucleate stages of the ascocarp are initiated in a similar manner to those of Diporotheca rhizophila Gordon & Shaw. The “appendages” developing on immature ascocarps are considered to be receptive hyphae. Appendages characteristic of mature ascocarps are produced much later. Lysis of certain centrum cells occurs, and asci are initiated from some of the remaining binucleate centrum cells. Resorption of centrum cells by the asci is supported by this investigation, corroborating Björling's earlier studies on Erysiphe graminis.