PCR-测序法对啮齿类动物汉坦病毒的检测和基因分型

目的探讨PCR-测序法在啮齿类动物汉坦病毒临床检测中的应用价值。方法以Genbank 7种血清亚型24株汉坦病毒代表性毒株为基础,从病毒基因S片段序列设计引物,采用邻位相连法进行系统进化分析,以该方法对浙江省近年从野生啮齿类动物中临床分离的汉坦病毒毒株进行分型鉴定。结果所建系统发育树将所分析的毒株分为5个区域,引起HFRS的四种血清型具有较稳定的拓扑结构,且能与引起HPS的血清型进行区分。11株实验毒株进行PCR扩增和测序,结果表明该引物具有高度的敏感性和特异性,其中9株浙江省分离的血清型未知毒株的系统发育分析发现其包含引起HFRS的3株HTN和1株SEO血清型,其他5株属两种未知血清型。讨论所建立的PCR-测序法具有用于临床检测汉坦病毒的价值。     

汉坦病毒的基因分型及其序列分析

为了探讨从核苷酸水平耐汉坦病毒进行分型,设计两对型特异性引物,采用反转录和聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）,对亚太地区１８株汉坦病毒进行了扩增鉴定,并对其中７株汉坦病毒的ＰＣＲ产物进行了测序分析。ＰＣＲ的分型结果表明,Ⅰ型引物只能扩增血清Ⅰ型病毒的ｃＤＮＡ;Ⅱ型引物也只能扩增血清Ⅱ型病毒,其间无交叉反应。采用巢式ＰＣＲ和限制性内切酶验证了ＰＣＲ产物的特异性。序列分析结果表明,Ｒ３６Ｍ片段Ｇ１区的核苷酸序列与血清Ⅰ型病毒代表株７６－１１８的同源性为７８．４％,而与血清Ⅱ型病毒Ｒ２２的同源性为６８．１％;Ｒ３６与汉坦病毒序列同源性的成对比较结果也表明,Ｒ３６与血清Ⅰ型病毒的同源性均高于血清Ⅱ型病毒;Ｌｅａｋｅｙ虽然能被Ⅱ型引物扩增,但其序列与血清Ⅱ型病毒Ｒ２２的同源性仅为４４．９％,故不属于血清Ⅱ型病毒。上述研究结果表明,反转录聚合酶链反应能对多数汉坦病毒准确分型,但最终结果尚有赖于序列分析。     

利用两种不同引物扩增金龟子COI序列片段的研究与对比

利用两类不同的引物,即通用引物(L1490,H219S)与特异引物(Pat,Jerry)分别对4种常见金龟子线粒体细胞色素C氧化酶I(COI)基因片段序列进行扩增和测序,获得长度为689 bp与775 bp的序列.对测序结果进行遗传距离分析,并构建了4种金龟子系统进化树.结果表明,特异引物扩增序列的遗传距离在种内稳定性与种间的差异性都明显优于通用引物扩增序列,利用特异引物扩增序列所构建的系统进化树最符合实际情况,因此利用特异引物扩增序列更能够准确的对金龟子进行分类.     

利用两种不同引物扩增金龟子COⅠ序列片段的研究与对比

利用两类不同的引物,即通用引物(L1490,H2198)与特异引物(Pat,Jerry)分别对4种常见金龟子线粒体细胞色素C氧化酶I(COⅠ)基因片段序列进行扩增和测序,获得长度为689 bp与775 bp的序列。对测序结果进行遗传距离分析,并构建了4种金龟子系统进化树。结果表明,特异引物扩增序列的遗传距离在种内稳定性与种间的差异性都明显优于通用引物扩增序列,利用特异引物扩增序列所构建的系统进化树最符合实际情况,因此利用特异引物扩增序列更能够准确的对金龟子进行分类。     

牛β-酪蛋白5′端上游调控序列的克隆和序列分析

该文用PCR扩增了牛β－酪蛋白基因5′－端上游调控序列,并对其进行了克隆和序列分析。采集成年母牛肝,提取DNA。在牛β－酪蛋白基因外显子1和上游调控区内设计引物,扩增其上游调控序列。两条引物长均为19个核苷酸,引物间跨度为635bp。以牛肝DNA为模板,进行PCR扩增,扩增产物在2％琼脂糖凝胶上电泳,可见特异的目的条带。从凝胶中回收目的片段,克隆到pGEM－T载体中。重组质粒提取DNA,进行序列分析。测序结果与文献发表的类似序列相比,仅有4个碱基不同,同源性达99．4％。表明获得了牛β－酪蛋白基因5′－端上游调控序列的克隆。     

桥式PCR，一种简易连接DNA标签序列的方法

MAST方法采用人工文库的DNA标签序列鉴定mRNA的可接近位点。大量的标签序列通过扩增和克隆测序达到阐明mRNA结合位点图。设计了单一引物的PCR,其引物在标签序列两端结合搭桥,在扩增中DNA标签序列在搭桥引物的作用下进行连接,连接的标签序列再克隆和测序。十几条这样的连接产物包含了上千条标签序列。该PCR方法简单、高效以用于高通量的方式对标签序列测序。     

粘虫核型多角体病毒919bp片段的PCR双链直接序列测定

本文发展了ＰＣＲ克隆和亚克隆技术制备ＤＮＡ测序模板。首先,我们用ｐＵＣ／Ｍ１３系列质粒的通用正反向引物ＰＣＲ扩增出质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳＤＮＡ的多克隆位点及其侧翼序列,用ＥｃｏＲＶ和ＸｈｏＩ消化成为左右两个引物多克隆臂,与粘虫核型多角体病毒（ＬｓＮＰＶ）的ＥｃｏＲＶ和ＸｈｏＩ约４００ｂｐ和５００ｂｐ片段分别连接,经ＰＣＲ扩增,得到两端具有上述正反向引物结合位点的测序模板,用ｄｄＮＴＰ链终止法／ＰＣＲ扩增／银染色,从片段两端测定了全部９１９ｂｐ序列,这种ｄｄＮＴＰ／ＰＣＲ／银染测序法简化了操作,大大缩短了测序模板的制备时间,易于实现自动化操作。     

牛β-酪蛋白5'端上游调控序列的克隆和序列分析

该文用ＰＣＲ扩增了牛β－酪蛋白基因５‘－端上游调控序列,并对其进行了克隆和序列分析。采集成年母牛肝,提取ＤＮＡ。在牛β－酪蛋白基因外显子１和上游调控区内设计引物,扩增其上游调控序列。两条引物长均为１９个核苷酶,引物间跨度为６３５ｂｐ。以牛肝ＤＮＡ为模板,进行ＰＣＲ扩增,扩增产物在２％琼脂糖凝胶上电泳,可见特异的目的条带。     

穿山甲标本和甲片的DNA提取及PCR扩增

为验证经处理后的穿山甲(Manis spp.)标本和甲片是否可以用于种间分子鉴定标记的开发及个体识别工作,本文在样品的预处理、消化、提取后纯化等方面对传统提取方法进行了改进,分别从穿山甲剥制标本、干皮标本及甲片中提取总DNA;然后用Cyt b基因扩增通用引物、12S rRNA基因全序列扩增引物、RAPD引物及微卫星引物进行了PCR扩增,并对部分扩增结果进行了序列测定.结果表明,除剥制标本的脚底皮张组织外,其他样品基本都可以提取出DNA.以此为模板的PCR扩增中,2种线粒体基因引物扩增出明显目的条带,RAPD引物扩增出种间特异条带,测序结果可用于种间特异性引物及SCAR引物的开发;微卫星引物在甲片样品中扩增稳定,可用于个体识别工作.     

黑发菌核糖体DNA小亚基片段的序列测定

用Rusketal 于 1995年设计的引物SMNUR10 1和Whiteetal 1990年设计的引物NS4对黑发菌 (Co matrichanigra)的rDNA小亚基片段进行了PCR扩增 ,并将扩增产物克隆到大肠杆菌JM10 9中进行测序 ,测得的序列长度为 115 4bp。同时将其与多头绒泡菌的相应序列进行了比较 ,其序列同源性为 6 6 %。     

两种缢蛏线粒体基因全序列扩增方法的比较

介绍了应用长PCR技术扩增缢蛏线粒体全序列的两种方法,并进行了比较.一种方法是使用通用引物扩增COI基因和16S基因并测序后,在两基因的两端分别设计两对引物扩增两基因中间的大片段,分别得到了9.7 kb和7.3 kb的扩增产物.另一种方法是在COI基因序列两端设计一对引物,扩增整个线粒体全序列,得到了17.1 kb的扩增产物.两种方法在缢蛏的研究中进行比较后发现,前一种方法在操作实用性和后期测序方面都比后者好.     

基于简并引物同步克隆两个红麻PDIL同源基因cDNA5'-末端序列

探索利用同一套简并引物结合通用引物同步扩增两个红麻PDIL同源基因的cDNA5’-末端序列,以期为同一转录组中两个旁系同源基因cDNA5' RACE的同步扩增提供借鉴.通过红麻HcPDIL5-2a和HcPDIL5-2b cDNA中间片段及3’-末端已知序列的比时,在其完全保守区段设计了一条引物用于两个基因5' RACE的共反转录;在其部分保守区段设计了两条简并引物,并利用其在两个基因的5'RACE扩增时退火温度的差异,结合通用引物巢式PCR同步扩增两个基因的cDNA 5 ’-末端未知序列.在两个基因全长cDNA拼接序列的基础上设计两对特异引物分别扩增它们的cDNA全长序列,测序结果进一步验证了序列拼接和cDNA 5' RACE同步扩增的可靠性.进化分析证实两个基因属于PDIL基因家族成员.     

16S rDNA序列分析在鉴定布鲁氏菌中的应用

[目的]建立布鲁氏菌的16S rDNA序列分析方法,评价该方法鉴定布鲁氏菌的特异性和实用性.[方法]用PCR扩增布鲁氏菌的16S rDNA片段,将扩增的产物纯化后测序,从GenBank下载与布鲁氏菌易发生血清学交叉反应的细菌的16S rDNA序列.使用DNAMAN软件进16S rDNA序列相似性分析.[结果]在布鲁氏菌中16S rDNA核苷酸序列相似性达到了99.74％,而与其他有血清型交叉反应的菌株相比较,16S rDNA序列间有显著差异.[结论]16S rDNA序列分析是一种快速、简便、特异的鉴定布鲁氏菌的方法之一.     

快速检查寡聚DNA片段序列的方法

以质粒为模板,用待测寡聚DNA片段和通用测序引物进行PCR（聚合酶链式反应）,PCR片段经纯化后插入到pUC－18或pUC－19的多克隆位点中,然后用通用测序引物测定重组质粒上待测寡聚DNA片段,即可清晰、正确地知道它的序列．     

葎草雄性连锁的ISSR标记克隆及SCAR标记的建立

以雌雄异株植物薇草(Humulus scandens L.)为材料,通过优化扩增体系中的退火温度、Mg2+浓度及模板浓度等主要影响因素,利用简单重复序列间扩增标记对其雌雄株性别的基因组差异进行研究.结果表明,62条ISSR引物中有40条引物能扩增出稳定的条带,共产生302条带.引物164扩增出1条雄性连锁标记,经克隆测序,该片段长度为553 bp,AT含量为64.3%,根据测序结果设计特异引物,将该标记转化为稳定性更好的SCAR标记.     

粘虫核型多角体病毒919bp片段的PCR双链直接序列测定

本文发展了ＰＣＲ克隆和亚克隆技术制备ＤＮＡ测序模板。首先,我们用ｐＵＣ／Ｍ１３系列质粒的通用正反向引物ＰＣＲ扩增出质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ ＤＮＡ的多克隆位点及其侧冀序列,用ＥｃｏＲＶ和ＸｈｏＩ消化成为左右两个引物多克隆臂,与粘虫核多角体病毒（ＬｓＮＰＶ）的ＥｏｏＲＶ和ＸｈｏＩ约４００ｂｐ和５００ｂｐ片段分别连接,经ＰＣＲ扩增,得到两端具有上述正反向引物结合位点的测序模板,用ｄｄＮＴＰ链终点     

副鸡禽杆菌aroA基因克隆及序列分析

旨在建立一种方便、高效的同源保守基因克隆方法,并对副鸡禽杆菌aroA基因进行克隆和结构分析。本试验以副鸡禽杆菌国际标准株145(C-3)基因组DNA为模板,用CODEHOP软件设计针对aroA基因的兼并引物,并运用改进的染色体步移方法扩增aroA基因序列;对该核酸序列及其编码蛋白进行结构分析并与该菌其他血清型及相关细菌进行序列比对分析。结果显示,获得了完整的aroA基因,全长1 293 bp。该基因编码由430个氨基酸组成的多肽,具有2个功能位点和5个抗原表位位点。不同血清型间氨基酸序列同源性为88.1%-100%,与其他相关细菌核酸同源性为75%以上。首次将兼并PCR和改进的染色体步移技术结合起来对副鸡禽杆菌aroA基因全长进行扩增研究,得到了预期的结果。     

人参细胞器核糖体小亚单位DNA的PCR扩增与序列测定

采用CTAB法提取了人参(Panax ginseng)根基因组DNA,根据植物叶绿体16S rDNA和线粒体18SrDNA与细菌16S rDNA序列具有高度同源性,用扩增细菌16S rDNA的一对通用引物(8f,1492r)扩增了人参细胞器核糖体小亚单位DNA.对扩增产物进行了克隆与测序,经多序列比对,扩增片段分别与已知植物叶绿体16S rDNA和线粒体18S rDNA具高度同源性,表明该对引物可以用来扩增绝大多数植物细胞器核糖体小亚单位DNA,可以作为鉴定植物叶绿体16S rDNA和线粒体18S rDNA的一种基本实验技术.     

RT-PCR方法扩增白蛉热病毒M片段的研究

为建立扩增未知序列白蛉热病毒M片段的RT-PCR方法,本研究选取7个血清组成员和8个未分组血清型,共42株白蛉热病毒为RT-PCR检测对象.通过排列GenBank中已知的4型白蛉热病毒M片段氨基酸序列,选择保守区设计引物.根据保守区各已知病毒的cDNA特异序列合成寡核苷酸,将相同区的寡核苷酸等量混合成为"鸡尾酒"引物,用于RT-PCR.扩增产物经电泳检测,纯化后直接测序.引物对Ph-M-2FM和Ph-M-3RM扩增产物长度约为600bp,从42株病毒中扩增出34株,阳性率为81.0%.另一引物对Ph-M-2FM和Ph-M-4R2M扩增产物长度约为1400bp,扩增出22株病毒,阳性率为52.3%.测出序列经BLAST检索,与GenBank中已知白蛉热病毒同源.本研究首次成功地应用RT-PCR扩增不同血清型未知序列白蛉热病毒的部分M片段,并测出扩增产物序列,为白蛉热病毒属成员的基因鉴定和种系发生关系分析提供了实验手段,并将有助于白蛉热病毒感染的基因诊断.     

赤麂线粒体全基因组的序列和结构

提取赤麂细胞株总DNA,参照我们实验室已测定的同属动物小麂线粒体全基因组序列设计引物,PCR扩增、测序、拼接,获得赤麂线粒体全基因组序列并进行生物信息学分析。赤麂线粒体全基因组序列全长16354bp。定位了22个tRNA基因、2个rRNA基因、13个蛋白编码基因和1个D-loop区。赤麂与小麂及其它哺乳动物线粒体的基因组结构相同,它们的序列同源性都较高。