Fus在斑马鱼生长发育及两性生长异形中的功能

为研究肉瘤融合基因(fus)在鱼类中的功能, 在斑马鱼中利用CRISPR/Cas9基因突变技术使fus基因产生移码突变。fus-/-纯合突变体斑马鱼发育正常并且完全可育, 但体长和体重在幼鱼和成年阶段都小于野生型斑马鱼。此外, 相较于野生型斑马鱼, fus-/-纯合突变体斑马鱼不存在雌鱼身体比例大于雄鱼的性别异形现象。在fus-/-纯合突变体斑马鱼早期幼鱼发育阶段, 一些生长相关基因包括gh1、ghra、igf1、igf2a、stat5.1和socs6的表达水平显著低于野生型斑马鱼但其运动能力并未受到影响。因此, 不同于fus基因在哺乳动物中的功能, 它在斑马鱼中不参与运动神经元的发育, 但在调节鱼类躯体生长发育与两性生长异形方面有着重要的功能。     

斑马鱼eomesb基因突变体的构建及其功能分析

Eomesodermin (Eomes)是T-box转录因子基因家族的成员,在脊椎动物胚胎发育、模式形成和形态发生过程中发挥重要作用.斑马鱼(Danio rerio) eomesa基因的一个点突变导致其母源合子突变体胚胎发育延迟而大量死亡,而eomesa合子突变体可正常发育至性成熟,但缺失背鳍.本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了斑马鱼eomesa旁系同源基因eomesb的突变体,eomesb纯合突变体不仅可正常发育至性成熟,而且鳍的发育也完全正常.q-PCR和整体原位杂交实验结果显示,eomesa和eomesb在脑部组织具有重叠的表达域,eomesb在中脑的表达略高于eomesa,故推测两基因在脑部可能行使相似的功能,存在一定的功能冗余.对2,4,6 dpf(Days post fertilization)和6 dpf的WT和突变体q-PCR基因表达分析显示,eomesb突变对eomesa的表达没有明显影响.eomesa-/-;eomesb-/-双突变体未出现背鳍缺失以外的附加表型,推测斑马鱼eomesa和eomesb在背鳍发育过程中可能不存在功能冗余,eomesb不参与背鳍的发育过程.此外,整体原位杂交实验结果显示,eomesb突变也不影响其同源基因tbr1a和tbr1b的早期表达.eomesb纯合突变体未观察到明显表型,可能与其影响的功能不引起明显表型有关,也可能与其它基因的遗传补偿效应有关.本研究结果为深入研究斑马鱼eomesb基因的功能提供了实验材料,同时对研究eomesa与eomesb基因功能分化具有参考价值.     

甲基转移酶set9缺失的斑马鱼低氧耐受能力增强

为了研究鱼类的甲基转移酶set9 [SET domain containing (lysine methyltransferase) 9, 也称作set7/setd7]在低氧耐受中的功能, 以斑马鱼(Danio rerio)作为模式生物, 利用CRISPR/Cas9 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9)基因编辑技术, 在斑马鱼set9基因的第一个外显子上设计了Cas9的靶位点, 对其进行基因敲除, 获得了缺失8个碱基的set9基因敲除的斑马鱼品系。对受精后3d的斑马鱼幼鱼和3月龄的斑马鱼成鱼进行低氧胁迫处理, 比较了野生型及set9基因敲除的斑马鱼的低氧耐受能力; 并对低氧胁迫处理后的3月龄的野生型及set9基因敲除的斑马鱼成鱼的脑组织取材、固定并进行TUNEL染色。结果显示: set9基因敲除的斑马鱼与野生型相比, 其低氧耐受能力显著增强, 脑组织中的细胞凋亡水平显著减少。研究为进一步揭示鱼类甲基转移酶set9在低氧耐受中的功能和分子机制提供了线索, 并为培育耐低氧鱼类新品种提供了候选靶标。     

opn1lw2基因在红光诱导斑马鱼皮肤 色素细胞形成中的作用

为了探究感红光视蛋白2基因opn1lw2在红光诱导斑马鱼(Danio rerio)皮肤色素细胞形成中的作用,针对AB品系野生型斑马鱼利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除感红光视蛋白2基因opn1lw2,构建opn1lw2缺失的纯合opn1lw2~(-/-)品系。使用光强(800±100)lx的红光LED灯(每天光照24 h)对15日龄野生型斑马鱼和opn1lw2~(-/-)品系斑马鱼进行60 d水面照射,发现野生型斑马鱼背部皮肤黑色素细胞数量显著多于opn1lw2~(-/-)品系斑马鱼。实时荧光定量PCR分析发现,黑色素细胞标记基因kit在野生型斑马鱼背部皮肤表达量显著高于opn1lw2~(-/-)品系,黄色素细胞标记基因csf1ra和虹彩细胞标记基因pnp4a在opn1lw2~(-/-)品系及野生斑马鱼背部皮肤表达无显著差异。表明红光能通过opn1lw2基因调控斑马鱼背部皮肤黑色素细胞的形成,但不影响皮肤黄色素细胞和虹彩细胞的形成;而且,调控黑色素细胞分化的α-MSH促黑激素的前体基因pomca在红光持续照射60d的opn1lw2~(-/-)品系斑马鱼背部皮肤中的表达显著低于野生型,表明红光通过opn1lw2基因调控pomca基因的表达从而诱导黑色素细胞的形成。实时荧光定量PCR检测发现,野生型斑马鱼皮肤中视黄醛脱氢酶基因raldh3表达量显著高于opn1lw2~(-/-)品系,而视黄醛脱氢酶基因raldh2的表达,在两种类型斑马鱼中没有差异,表明opn1lw2基因可介导红光诱导视黄醛脱氢酶基因raldh3表达,进而调控黑色素细胞的形成。这些结果对于深入理解红光诱导鱼类皮肤色素细胞形成有重要帮助。     

斑马鱼ints12的CRISPR/Cas9敲除及其对UsnRNA剪接的调控

整合因子(Integrator)复合体通过调控UsnRNAs(U-rich small nuclear RNAs)的转录成熟过程, 影响pre-mRNA的内含子剪切, 对生物体内形成成熟mRNA有重要作用。但是在脊椎动物中, 整合因子复合体的表达调控及其发育功能研究尚十分缺乏。研究利用斑马鱼(Danio rerio)模型, 通过CRISPR/Cas9技术构建了ints12 (Integrator subunit 12)的基因敲除品系, 得到了2种缺失不同碱基的突变品系。在ints12的合子突变体(Zints12)中, 通过荧光定量PCR分析, 发现UsnRNA的3′box剪切存在缺陷。与同龄的野生型斑马鱼相比, Zints12体型偏小且表现为全雄。进一步研究发现, 在Zints12成体中, 细胞增殖相关因子出现显著下调表达, ints12自身pre-mRNA的加工也出现内含子滞留, 表明ints12对自身mRNA的剪切存在一个“自循环”式的调控模式。研究获得了斑马鱼的ints12基因敲除纯合突变体并发现ints12通过调控UsnRNA的剪切参与斑马鱼的个体生长和发育。     

低氮下拟南芥叶酰聚谷氨酸合成酶突变体atdfb根发育研究

利用叶酰聚谷氨酸合成酶功能缺失突变体atdfb解析叶酸在拟南芥根发育过程中的生物学功能。纯合T-DNA插入功能缺失突变体atdfb 在土壤培养条件下生长3周,与野生型表型无明显差异。在氮源充足的1/2MS培养基上,atdfb的主根显著短于野生型,互补植株的主根长度恢复到野生型水平,说明主根缩短的表型是由AtDFB基因功能缺失造成的。在1/2MS培养基生长11 d的突变体主根长度只有野生型的23%。在低氮条件下,突变体的生长发育几乎停滞,培养11 d的突变体主根长度只有野生型的4%;5-甲酰四氢叶酸(5-F-THF)可以恢复低氮条件下atdfb-3的表型,其主根长度、根毛长度及静止中心的细胞排列均得到恢复。进一步分析发现,低氮条件下培养少于3 d的atdfb-3补充充足的5-F-THF,3 d后能像野生型一样适应低氮环境。由此说明叶酸对拟南芥根部发育及对低氮环境的适应是必需的。     

拟南芥CtpA纯合突变体的光合生理特征

以T-DNA插入获得的拟南芥at3g57680基因缺失的CtpA纯合突变体植株为材料,检测了其与光合作用相关的生理特征,以揭示拟南芥at3g57680基因功能和其编码的CtpA蛋白的作用.结果显示:拟南芥的CtpA突变体植株在整个生长过程中都略小于野生型植株,但能够健康生长;CtpA突变体的叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a/b和叶绿素a+b值, PSⅠ、PSⅡ和光合电子传递总链的电子传递活性,以及77K低温荧光波谱都与野生型植株无显著差异(P>0.05);CtpA突变体植株的最大光化学量子产量(Fv/Fm)和有效光化学量子产量(ΦPSⅡ)也与野生型无显著差异,而光化学淬灭系数(qP)和非光化学淬灭系数(qN)值在室温下显著低于野生型(P<0.05).研究表明, 拟南芥at3g57680基因在正常条件下对植株生长无显著影响,可能不是编码CtpA蛋白的关键基因.     

斑马鱼hoxa1a基因调控颅面骨骼发育的功能研究*

hox基因编码一类高度保守的转录因子家族,人类HOXA1的突变会导致阿萨巴斯卡发育不良综合征 (Athabascan brainstem dysgenesis syndrome, ABDS),使人出现因颅骨异常导致的面部畸形和面部麻痹等症状。利用模式生物斑马鱼研究其同源基因hoxa1a的功能机制。首先利用CRISPR/Cas9技术对斑马鱼hoxa1a进行基因编辑,获得了hoxa1a基因突变,T7E1酶切结果显示F₀酶切效率平均为70%。F₁进一步筛选到两种突变类型,分别是插入了8 bp和删除了7 bp的杂合突变体。杂合子自交得到hoxa1a F₂纯合突变体,并且测序验证hoxa1a基因突变成功。5 dpf时,hoxa1a纯合突变体出现颅面发育异常。阿尔新蓝软骨染色和茜素红硬骨染色结果表明,hoxa1a突变体中颅骨发育异常、筛骨板断裂,鳃弓发育出现缺损。成功在斑马鱼中构建ABDS疾病模型,表明hoxa1a突变会造成斑马鱼颅面骨骼发育异常,为其功能机制研究奠定了基础,为人类ABDS疾病的致病机制研究提供了新的思路。     

斑马鱼tbx2b调控心脏房室间隔发育的功能研究*

tbx2是早期心脏发育的关键基因。为进一步探究其对房室间隔(AVC)发育的影响,研究利用CRISPR/Cas9介导的基因敲除技术,成功构建了斑马鱼tbx2b突变体。通过T7E1酶切对其F₀进行敲除效率检测,结果显示平均敲除效率约为57.5%。F₁进一步筛选获得tbx2b杂合突变体,测序结果显示突变类型为11 bp碱基缺失的移码突变。tbx2b杂合子内交获得纯合子,tbx2b纯合突变体在5 dpf死亡并出现早期心脏环化异常表型。斑马鱼整胚原位杂交实验显示在3 dpf tbx2b纯合突变体中, 心脏腔室分化特异性标志基因nppa、nppb表达上调并异位表达在AVC,而AVC发育关键基因has2的表达消失。高效构建tbx2b突变体并初探其对下游基因的影响,为后续深入研究tbx2b对心脏AVC发育的作用奠定了基础,同时加深了人们对早期心脏调控网络的认识。     

配子母细胞特异因子gtsf1基因在斑马鱼生殖细胞发育中的功能初探

配子母细胞特异因子1(Gtsf1)属UPF0224蛋白家族,含一个保守的CHHC锌指结构域,对生殖细胞的发育至关重要.小鼠(Mus musculus)和果蝇(Drosophila melanogaster)中Gtsf1的缺失分别导致雄性和雌性不育,高不育风险(HIR)隐睾症患者的睾丸中GTSF1的mRNA和蛋白表达均显著下调,但gtsf1在精子发生中的功能机制尚不完全清楚.利用类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)技术,首次在斑马鱼(Danio rerio)中成功制备了gtsf1突变体.观察发现,突变体的生长、表型正常,但gtsf1纯合突变体(gtsf1-/-)成鱼全为雄性.进一步的组织学观察表明,gtsf1-/-成鱼精巢中初级精母细胞数量基本正常,次级精母细胞显著减少,精细管管腔中精子极少或缺失.提示gtsf1在脊椎动物的精子发生过程中有保守的作用.本研究为阐明gtsf1在精子发育中的作用机制奠定了基础.     

斑马鱼sat1.a突变体的鉴定

目的在我们的前期研究工作中,通过Tol2转座子介导的插入突变,筛选到了一批组织特异性表达绿色荧光蛋白GFP的斑马鱼品系。其中一个品系Tol2:20141221t的GFP在神经系统中表达,但还没有鉴定到Tol2转座子插入到基因组什么位置,造成了哪个基因的突变。本文的主要研究目标就是对这一由Tol2转座子插入诱导的斑马鱼突变品系进行鉴定。方法使用交错式热不对称PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR)鉴定Tol2转座子插入的基因组位置;利用原位杂交检测被突变的基因的时空表达是否与该品系GFP表达具有一致性;筛选鉴定纯合体突变体,并进一步分析该基因突变造成的发育缺陷。结果在该品系中,Tol2转座子插入到了亚精胺/精胺N1-乙酰基转移酶1a(spermidine/spermine N1-acetyltransferase 1a,sat1.a)的第八个内含子区域,致使sat1.a基因转录提前终止。我们筛选到了sat1.a纯合突变体,但是没有检测到明显的发育缺陷。结论筛选鉴定的Tol2转座子介导的斑马鱼sat1.a突变体没有明显的发育缺陷,但可以作为研究神经系统发育的有力工具。     

鱼腥蓝细菌PCC7120 alr3504基因缺失突变体的构建及表型分析

c-di-GMP是新发现的真细菌所特有的第二信使,其合成和降解由双鸟苷酸环化酶和磷酸二酯酶分别完成.经生物信息学分析,鱼腥蓝细菌PCC7120基因alr3504可能编码含有保守GGDEF结构域的双鸟苷酸环化酶.[目的]为了鉴定该基因的功能,[方法]采用标记置换方法将alr3504缺失.[结果]敲除该基因后,发现缺失突变体的形态、生长速度及异形胞发育与野生型无明显差异,但在盐胁迫条件下,突变体比野生型对钠盐更敏感.[结论]可见air3504虽不直接影响异形胞发育,但参与了其它信号途径,研究结果为阐明蓝细菌丰富而复杂的信号转导机制奠定了基础.     

氟唑菌酰胺对斑马鱼(Danio rerio)鱼鳔发育的影响

鱼鳔作为硬骨鱼类重要的功能器官,其发育对多种环境污染物都较为敏感。氟唑菌酰胺(fluxapyroxad)是琥珀酸脱氢酶抑制剂类杀菌剂家族的一员,对鱼类具有神经、心血管和发育毒性。为探究氟唑菌酰胺对斑马鱼鱼鳔发育的潜在影响,将斑马鱼胚胎暴露于不同浓度的氟唑菌酰胺后,记录斑马鱼幼鱼鱼鳔的表型,通过组织学切片染色手段检测幼鱼鱼鳔的形态差异,并采用整体原位杂交实验比较鱼鳔发育关键基因的表达图式变化。结果表明,氟唑菌酰胺暴露会引起斑马鱼幼鱼鱼鳔发育异常、鱼鳔充气受阻及鱼鳔发育标记基因elovl1a和anxa5b的表达水平显著降低。该研究对于评估氟唑菌酰胺对斑马鱼幼鱼鱼鳔发育的影响提供了有价值的参考,并可能有助于深入了解氟唑菌酰胺对水生生态系统构成的潜在风险。     

拟南芥ERD15基因缺失突变体的分子鉴定和表型分析

为探究ERD15基因功能,利用反向遗传学,通过PCR及半定量PCR筛选鉴定出拟南芥(Arabidopsis thaliana) ERD15基因的T-DNA插入纯合突变体,并对其表型进行观察分析。结果表明,erd15突变体莲座叶数目显著增多,提前3～4 d开花,突变体比野生型更早从营养生长转向生殖生长。拟南芥野生型植株主茎为圆柱体,平均直径1.29 mm,而erd15突变体主茎扁平,平均直径达到2.27mm,具极显著差异。与野生型相比,erd15突变体果实心皮发育受到影响,隔膜上排列有多排种子,果荚顶端膨大,长度缩短37.67%,但角果平均结籽数升高。因此,ERD15基因参与了调控拟南芥植株的生殖生长过程。     

拟南芥钾转运突变体atkup12鉴定及非生物胁迫的敏感性检测

[目的]鉴定获得拟南芥HAK/KUP/KT高亲和钾离子转运突变体atkup12,通过检测种萌期atkup12突变体在低钾、盐及氧化胁迫下的生长指标以初步明确拟南芥AtKUP12基因是否参与植物对非生物胁迫的响应。[方法]以拟南芥atkup12突变体基因组和总RNA反转后的cDNA为模板,通过PCR扩增确定AtKUP12基因T-DNA插入失活的纯合突变体。将野生型和atkup12突变体点种于0.5μmol/L低钾、不同NaCl浓度和1μmol/L甲基紫精的胁迫培养基,测定并比较突变体与野生型拟南芥在根长、种子萌发率及子叶绿化率间的差异。[结果]利用双引物法,结合反转录PCR,在DNA及RNA水平鉴定获得了AtKUP12基因的纯合突变体。低钾胁迫下,atkup12突变体种苗的根长比较野生型拟南芥短40%左右,较野生型受到了显著抑制;不同NaCl浓度胁迫下,atkup12突变体种子的萌发率较野生型显著降低;1μmol/L甲基紫精显著的抑制了突变体种苗的子叶绿化率。[结论]成功鉴定获得了AtKUP12基因T-DNA插入失活的纯合突变体,且AtKUP12基因的缺失会增加植物对盐、低钾及氧化等非生物胁迫的敏感性。     

皮骨在斑马鱼侧线系统胚后发育中的作用

鱼类侧线系统的分布随其分类地位和不同的生存环境呈现多样性,这种多样性与侧线系统的胚后发育密切相关,但对于侧线系统胚后发育调控研究较少.本研究利用CRISPR/Cas9敲除斑马鱼(Brachydanio rerio var)edar基因,获得皮骨缺陷的突变体,进而利用染色技术分析鳞片和侧线管道在侧线胚后发育中的作用.利用...     

利用CRISPR/Cas9技术敲除dync1h1基因显著影响斑马鱼神经系统发育

细胞质动力蛋白(cytoplasmic dynein)是神经系统内重要的马达蛋白复合体,负责轴浆内重要物质从轴索末端到神经细胞胞体的逆行性运输。重链蛋白二聚体1(dynein 1 heavy chain 1,DYNC1H1)是dynein复合体的核心结构,其是否正常表达与神经系统发育及神经退行性疾病的发生存在密切联系。该研究运用CRISPR/Cas9基因编辑技术在斑马鱼中对dync1h1基因进行敲除,并将dync1h1突变体与转基因鱼Tg(Hu C:m Cherry;FLK1:e GFP)外交,获得带有荧光标记且突变稳定遗传的斑马鱼种系。表型鉴定提示,dync1h1杂合突变斑马鱼发育较野生型斑马鱼无明显异常;而dync1h1纯合突变斑马鱼胚胎正常形态发育受到严重抑制,dync1h1基因表达量及Dync1h1蛋白质含量均有明显下降,脊髓肿胀,脊髓神经细胞数目显著减少,背部血管存在发育畸形,并于受精后5~6d(days post fertilization,dpf)死亡。该研究利用CRISPR/Cas9技术成功建立了dync1h1基因敲除的斑马鱼模型,为dync1h1突变致病机制相关的信号通路或者分子网络间相互作用的探索打下了基础。     

lepr和mc4r基因突变斑马鱼的制备及表型分析

肥胖已经成为全球性的公共卫生问题,严重影响人类的身体健康和生活品质。本文运用CRISPR/Cas9技术,构建了肥胖相关基因——瘦素受体(leptin receptor,lepr)和黑素皮质素受体4(melanocortin-4 receptor,mc4r)的斑马鱼突变体,并对其进行形态和功能分析。结果显示,lepr~(-/-)和mc4r~(-/-)斑马鱼在胚胎和幼鱼期没有明显异常,但在成年期,lepr~(-/-)和mc4r~(-/-)斑马鱼相比对照进食增多、体重增加、体脂含量升高,呈现肥胖表型。血糖测定结果显示,饱食喂养条件可以诱导lepr~(-/-)和mc4r~(-/-)成年斑马鱼出现糖耐量受损的现象。进一步地,运用real time RT-PCR对76个能量代谢相关基因在lepr~(-/-)和mc4r~(-/-)斑马鱼肝脏中转录表达水平进行检测,并与Lep~(ob/ob)小鼠肝脏c DNA microarray的数据比较,发现胰岛素/胰岛素样生长因子信号转导通路(insulin/IGF signaling pathway,ISS)相关的基因在lepr~(-/-)斑马鱼和Lep~(ob/ob)小鼠肝脏中表达变化具有较高的正相关性,提示肥胖调控网络在进化中维持了一定的功能保守性。     

stat3通过促进轴突生长间接抑制间神经丘早熟

鱼类侧线系统由感受水流的机械感受器和传导信息的侧线神经组成.stat3在斑马鱼侧线神经丘和侧线神经节中特异性表达,但stat3在斑马鱼后侧线系统发育过程中的功能仍然不清楚.本研究利用CRISPR/Cas9在斑马鱼中成功敲除stat3基因.然后,利用Tg(SqET20:GFP)转基因鱼追踪后侧线神经丘的发育.从4 dpf...     

拟南芥突变体uro的表型分析表明URO基因参与生长素调节的植物发育过程

在筛选拟南芥(ArabidopsisthalianaL.)叶突变体的过程中获得拟南芥uprightrosette(uro)突变体。uro为半显性突变体,因突变体在幼苗生长期莲座叶竖直生长而得名。对uro突变体的表型进行了详细的分析,结果表明uro突变不仅造成叶生长模式的改变,还出现多种其他异常表型。uro杂合和纯合突变体都表现出植物顶端优势的丧失,纯合突变体表现得更为严重。uro纯合突变体的一些二级分枝会被叶取代,这种叶的叶柄与叶片远轴面连接。突变体的花发育也有多种异常表型,主要表现为花瓣及雄蕊数目的改变、花器官的同源异型转化和不同花器官的融合。uro突变体茎软,细胞学水平分析表明突变体的内皮层组织发生增生,束间纤维发育及维管束分化受阻。顶端优势的丧失及维管组织的异常发育表明,URO基因可能参与生长素对植物发育的调节。pin1uro双突变体表型的分析表明,虽然双突变茎表型出现了两亲本表型的叠加,但双突变体的花却出现了新的表型,说明URO与PIN1基因在调节植物发育过程中具有部分遗传上的相互作用,这一结果进一步证明URO基因参与了生长素调节的植物发育过程。