人工栽培铁皮石斛菌根的细胞学研究

从细胞学水平上研究了人工栽培铁皮石斛的菌根特征。结果表明:真菌与铁皮石斛根成功地形成了菌根,真菌菌丝穿透根被细胞,并在根被的某个细胞中定殖,然后经由外皮层的通道细胞进入皮层薄壁细胞;皮层薄壁细胞层正是真菌与植物体相互作用的活跃部位;真菌侵染大多数的皮层薄壁细胞,并不能侵染内皮层及中柱细胞,从而使根仍然保持生活力。     

转录组和代谢组分析瘤菌根菌对铁皮石斛的促生机制

为筛选出促进铁皮石斛(Dendrobium officinale)生长的差异表达基因和差异代谢物,对瘤菌根菌与无菌盆栽铁皮石斛苗共生后形成的侧根根系进行转录组、代谢组和双组学联合分析。结果表明,转录组分析共找到262条差异表达基因富集到了35条通路中,其中内质网蛋白质加工通路途径的差异基因最多,其次为氨基糖和核苷酸糖代谢通路。代谢组分析共检测出194个差异代谢物富集到33个KEGG通路中,其中代谢途径的差异代谢物最多有133个,其次为不同环境的微生物代谢途径的差异代谢物有70个。通过联合分析,有9个差异基因的差异表达导致丝氨酸、谷氨酸、D-甘露糖和激素等代谢物的积累量发生变化,这可能是瘤菌根菌促进铁皮石斛生长的重要原因。因此,推测瘤菌根菌促进铁皮石斛生长与氨基酸、糖、植物激素的积累及相关基因的表达变化有关。     

广西人工栽培铁皮石斛内生菌根的研究

通过光学生物显微镜及Qwin图像分析系统,对人工繁育栽培的铁皮石斛各生长期植株的内生菌根进行了观察分析。结果表明:铁皮石斛具有典型的内生菌根;铁皮石斛根内共生菌不是其原有的,而是通过栽培基质传与铁皮石斛的根而共生。被真菌侵染的区域大,其植株生长茂盛,真菌对铁皮石斛的生长发育可能有促进的作用。     

菌根真菌促进金钗石斛的生长及氮利用

菌根在兰科的生命周期和进化史上起着关键作用。兰科中大多数是附生兰,但它们的菌根研究相对缺乏。为了探讨菌根对附生兰的影响,本研究用金钗石斛（Dendrobium nobile）与通过形态学特征和分子生物学鉴定的分属于瘤菌根菌属（Epulorhiza）的s1和胶膜菌属（Tulasnella）的S3真菌共培养。共培养结果表明,S1和S3与金钗石斛形成了共生关系,且不同程度地促进了其生长。15N稳定同位素标记实验证实,S1菌株显著促进了金钗石斛对有机氮的利用,而S3菌株没有显著的促进作用。同时．S1和S3真菌均能提高金钗石斛中石斛碱的含量。研究结果表明,菌根真菌能促进附生兰幼苗的生长、有机氮的利用和次生代射产物的积累。     

福廷瓶头霉与马尾松的共生特征

深色有隔内生真菌（dark septate endophyte,DSE）广泛定殖于植物根系,对促进植物生长、提高植物抗逆能力具重要作用。本研究从马尾松Pinus massoniana根系分离到一株DSE,于无菌条件下研究了此菌与马尾松的共生特征,研究结果表明：基于形态学和分子生物学分析,此菌被鉴定为福廷瓶头霉Phialocephala fortinii,在PDA培养基25℃培养条件下,此菌不产孢,菌丝深色、具隔,最适培养基为PDA。此菌与马尾松根系共生体的形成过程可划分为3个时期,即侵入前期：接种后2d,新生菌丝向马尾松根系定向生长并开始接触根系,但未侵入根系内部;侵入期：接种后4d,菌丝与马尾松根系接触侵入根内并在根系皮层细胞间扩展延伸;形成期：接种后6d,菌丝继续在马尾松根系内扩展并形成富含脂类物质的微菌核。接种福廷瓶头霉显著增加了马尾松生物量的积累（P<0.05）,并影响了其根系发育。接种后,马尾松主根生长受限,侧根生长显著提高（P<0.05）,侧根长度较未接种处理增加了112.87%。被侵染根系的根毛数量减少,并由大量根外菌丝包裹。以上结果对进一步揭示DSE与宿主的共生机理有一定指导意义。     

共生真菌对兰科植物种间杂交后代种子萌发的效应

石斛属(Dendrobium)植物在种子共生萌发过程中与真菌有着较为专一的共生关系,为探讨这种共生关系在种间杂交后代上的进化和适应,深入理解兰科植物和真菌共生关系的形成机制,该研究利用能有效促进铁皮石斛(Dendrobium officinale)和齿瓣石斛(D.devonianum)种子萌发形成幼苗,并具有较强专一性的胶膜菌属(Tulasnella)真菌SSCDO-5和瘤菌根菌属(Epulorhiza)真菌FDd1,开展真菌对铁皮石斛和D. tortile种间杂交种子萌发效应的研究。结果表明,在真菌与种子共生培养68天时,SSCDO-5菌株和FDd1菌株都能有效地促进杂交种子形成原球茎和幼苗,两个接菌处理之间无显著差异,来源于铁皮石斛的SSCDO-5菌株不但没有表现出优势,反而在杂交石斛幼苗形成率上低于来源于齿瓣石斛的FDd1菌株(SSCDO-5:(22.13±6.62)%; FDd1:(29.53±5.51)%); SSCDO-5菌株和铁皮石斛在幼苗形成和发育阶段的共生专一性并没有在杂交后代上得到遗传或表现,或者说是杂交打破了这种专一性的共生关系,使得杂交后代能够和不同的真菌建立新的共生关系。该结果不支持关于共生真菌专一性是石斛属植物杂交后代形成的重要限制因素的假设,推测石斛属植物在幼苗分化和发育阶段与真菌这种专一性的共生关系是在适应特定生态环境的过程中形成和建立的。     

盆栽条件下暗褐网柄牛肝菌人工菌塘及其子实体的培养

在土壤中添加促进暗褐网柄牛肝菌（Phlebopus portentosus）菌丝及其宿主咖啡生长的营养液,用暗褐网柄牛肝菌纯培养种接种盆栽件下的咖啡苗根系,结果表明：92.5%以上的小粒咖啡（Coffea arabica）苗形成菌根,菌根上外延菌丝向根尖、侧根及根系周围的土壤延伸生长,与土粒相互交结形成菌塘。接种20天后,菌塘中子实体紧贴咖啡苗茎基或于咖啡苗株间生长,共生长162个子实体,发育成熟52个。子实体菌柄基部菌索与咖啡苗主根表面菌套连接。     

共生真菌对兰科植物种间杂交后代种子萌发的效应

石斛属(Dendrobium)植物在种子共生萌发过程中与真菌有着较为专一的共生关系, 为探讨这种共生关系在种间杂交后代上的进化和适应, 深入理解兰科植物和真菌共生关系的形成机制, 该研究利用能有效促进铁皮石斛(Dendrobium officinale)和齿瓣石斛(D. devonianum)种子萌发形成幼苗, 并具有较强专一性的胶膜菌属(Tulasnella)真菌SSCDO-5和瘤菌根菌属(Epulorhiza)真菌FDd1, 开展真菌对铁皮石斛和D. tortile种间杂交种子萌发效应的研究。结果表明, 在真菌与种子共生培养68天时, SSCDO-5菌株和FDd1菌株都能有效地促进杂交种子形成原球茎和幼苗, 两个接菌处理之间无显著差异, 来源于铁皮石斛的SSCDO-5菌株不但没有表现出优势, 反而在杂交石斛幼苗形成率上低于来源于齿瓣石斛的FDd1菌株(SSCDO-5: (22.13 ± 6.62)%; FDd1: (29.53 ± 5.51)%); SSCDO-5菌株和铁皮石斛在幼苗形成和发育阶段的共生专一性并没有在杂交后代上得到遗传或表现, 或者说是杂交打破了这种专一性的共生关系, 使得杂交后代能够和不同的真菌建立新的共生关系。该结果不支持关于共生真菌专一性是石斛属植物杂交后代形成的重要限制因素的假设, 推测石斛属植物在幼苗分化和发育阶段与真菌这种专一性的共生关系是在适应特定生态环境的过程中形成和建立的。     

荒漠沙蒿根围AM真菌和DSE的空间分布

2009年7月在内蒙古黑城子北、多伦县城东和正蓝旗元上都遗址3个样地分别从0-10 cm、10-20 cm、20-30cm、30-40 cm和40-50 cm 5个土层采集沙蒿(Artemisia sphaerocephala)根围土壤和根样,系统研究了沙蒿根围AM真菌和DSE(Dark septate endophytes)的空间分布及与土壤因子的相关性。结果表明,沙蒿根系能被AM真菌高度侵染形成典型的I-型(Intermediate type)丛枝菌根,并发育形成泡囊和丛枝结构, 并与DSE形成良好的共生关系,样地生态条件和采样深度对AM真菌分布和活动有显著影响。黑城子样地孢子密度最高,元上都样地泡囊定殖率最高,不同样地间丛枝、菌丝、总定殖率和DSE定殖率无显著差异。孢子密度峰值出现在0-10cm表层土,并随土壤剖面深度增加而降低;泡囊定殖率峰值出现在10-20cm土层;AM真菌其他结构定殖率及DSE定殖率在各土层间差异不显著或变化无规律。孢子密度与AM真菌不同结构定殖率无显著相关性,与各土壤因子极显著正相关。泡囊定殖率与脲酶和碱性磷酸酶极显著负相关,与酸性磷酸酶显著负相关。菌丝定殖率、总定殖率及DSE定殖率与各土壤因子均无显著相关性。土壤碱解N和有机C与脲酶、酸性磷酸酶和碱性磷酸酶极显著正相关;土壤速效P与碱性磷酸酶极显著正相关,与脲酶显著正相关。对沙蒿根系AM真菌和DSE真菌分布和定殖规律的研究,可进一步明确AM真菌和DSE的生态功能,为利用菌根生物技术促进荒漠植被恢复和生态重建提供依据。     

铁皮石斛组培苗与菌根真菌共培养过程中的相互作用

由于人为的滥采滥挖和野外生境的退化, 使得铁皮石斛 (Dendrobium officinale) 这种名贵的中药材一直处于极度濒危的状态。为了从菌根真菌的角度给人工保育铁皮石斛提供理论指导, 对铁皮石斛的组织培养苗人工接种‘GDB181’菌株 (Epulorhiza sp.) 。培养60d后, 接菌苗平均鲜重增长率比对照苗高出了84.8%。在营养元素含量方面, 接菌苗的B、Si、Fe、Cu和Mn元素含量的净增率分别为780%、533%、192%、191%和128%, 均在100%以上;其他元素含量也有不同程度的增加 (除Zn外), 结果证明两者有效地建立了共生关系。在显微和超微结构的观察中发现:真菌菌丝随机破坏铁皮石斛的根被入侵到外皮层, 并从外皮层细胞不断扩展延伸到皮层的大型细胞, 最后在大型细胞中被分解消化。在真菌侵染过程中, 被侵染的皮层细胞的细胞壁严重扭曲变形, 菌丝在皮层细胞形成菌丝结, 菌丝结常位于细胞核附近或包围细胞核。在皮层的大型细胞中, 菌丝细胞被植物的溶酶体包围, 部分或全部被消解, 出现脱壁或失去细胞质甚至成为空腔等变化, 最终形成衰败的菌丝残骸, 溶酶体也随之消失。溶酶体分布越多的部位, 菌丝细胞消解变形越严重。含有菌丝残骸的皮层细胞可被新侵染的菌丝重新定殖, 这一菌丝侵染被消化再侵染的过程在铁皮石斛生长发育过程中可不断重复发生。     

印度梨形孢对铁皮石斛种子萌发和原球茎生长的影响

为探究印度梨形孢(Piriformospora indica)对铁皮石斛(Dendrobium officinale)种子萌发和原球茎生长的影响,在铁皮石斛种子离体培养和原球茎生长阶段分别接种印度梨形孢,对其形态发育特征和生理特性进行研究.结果表明,接种印度梨形孢的铁皮石斛种子的起始萌发时间提前,接种印度梨形孢的铁皮石...     

内生真菌KLBMP0506对拟南芥的促生作用

【目的】研究植物内生菌Wickerhamomyces sp.KLBMP0506对拟南芥（Arabidopsis thaliana）的促生作用及潜在的促生机制。【方法】本研究以野生型拟南芥为试验材料,将其与菌株KLBMP0506进行平板共培养及盆栽接种试验,并测定拟南芥鲜重、干重、主根长、侧根数、叶绿素含量和可溶性糖含量等生长、生理指标,同时对筛选的与拟南芥侧根、主根形成及生长素合成和运输相关的11个基因进行实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）分析。【结果】接种目的菌株KLBMP0506后,平板试验的拟南芥鲜重及侧根、盆栽试验的拟南芥鲜重、干重、茎长、叶绿素含量和可溶性糖含量均有一定程度的增加;分隔平板试验及菌株KLBMP0506发酵液中促生活性物质分析显示,该菌株产生的挥发性有机物质及其发酵液中的正丁醇和乙酸乙酯提取物均对拟南芥有明显的促生作用;此外,qRT-PCR分析显示KLBMP0506处理后,拟南芥中与侧根形成相关基因ABI4、FLA1的表达出现不同程度的下调,与生长素合成、运输相关基因AUX1、EIR1、YUC4的表达整体呈上调趋势,表明菌株KLBMP0506可能通过调控拟南芥中与侧根形成以及与生长素合成和运输相关基因的表达,而实现对拟南芥的促生作用。【结论】本研究明确了菌株KLBMP0506对模式植物拟南芥的促生作用,为其开发成为微生物菌肥提供理论依据。     

兰科菌根真菌对铁皮石斛光合性能及pepc基因表达的影响

为了阐明兰科菌根真菌对铁皮石斛光合作用的影响及机制,采用盆栽方式研究了兰科菌根真菌对铁皮石斛幼苗生长的影响,并分析了叶片中叶绿素含量、光合参数、叶绿素荧光参数以及pepc基因表达的变化。结果表明：（1）兰科菌根真菌促进了铁皮石斛幼苗生长,接种兰科菌根真菌的铁皮石斛的株高、根重、茎叶重和总生物量分别是未接种对照组的1.21、1.54、1.71和1.68倍;而且可显著提高叶片中叶绿素含量、叶片净光合速率（P_n）、蒸腾速率（G_s）和气孔导度（T_r）。（2）接种兰科菌根真菌的铁皮石斛叶片潜在光化学效率（F_v/F₀）、最大光化学效率（F_v/F_m）、光化学猝灭系数（q_P）、非光化学猝灭系数（q_N）、实际光化学反应量子效率（Yield）和表观光合电子传递速率（ETR）均高于未接种对照组。（3）菌根真菌能促进pepc基因的表达,增强PEPC活性,提高铁皮石斛叶片的光合碳同化能力。研究表明,菌根的形成可以提高铁皮石斛叶片光合性能和pepc基因的表达水平,促进铁皮石斛幼苗的生长。     

硝酸镧和兰科菌根真菌对铁皮石斛生理特性的影响

利用盆栽的方式研究了不同硝酸镧水平(0、1.0、3.0、5.0和7.0mg·L-1)下接种兰科菌根真菌对铁皮石斛生物量、多糖和蛋白质合成的影响,并分析了叶绿素含量、丙二醛(MDA)含量以及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)活性的变化,以探讨硝酸镧和兰科菌根真菌对铁皮石斛生理特性的影响。结果表明:(1)添加适量的硝酸镧有利于菌根真菌侵染和菌根发育,提高铁皮石斛幼苗生物量。(2)在接种菌根真菌的同时添加5.0mg·L-1的硝酸镧,铁皮石斛的根重、茎叶重和总生物量均达到最大,分别是未添加硝酸镧以及未接种对照组的4.26倍、4.98倍和4.87倍,其菌根侵染率也高达92.8%;而且可显著提高叶片中叶绿素含量,并显著降低细胞内的丙二醛含量。(3)在适量(5.0mg·L-1)的硝酸镧水平下接种菌根真菌能促进铁皮石斛幼苗多糖和蛋白质的合成,并显著提高细胞内SOD、CAT和POD活性。研究认为,菌根真菌与适宜浓度硝酸镧(5.0 mg·L-1)联合使用能显著促进铁皮石斛菌根的形成,增强植株的生理活性和适应能力,提高其生物量和多糖等活性成分的积累,有效改善铁皮石斛的药用品质。     

<Emphasis Type="Italic">Mycena</Emphasis> sp., a mycorrhizal fungus of the orchid <Emphasis Type="Italic">Dendrobium officinale</Emphasis>

An endophytic fungus, F-23, was isolated from the roots of Dendrobium officinale Kimura et Migo, an endangered Chinese medicinal plant. The sequence of the ITS region indicated that the isolate belongs to the genus Mycena. After 4 months of inoculation, the root systems of D. officinale that were inoculated with F-23 fungus were much larger than the control’s root systems. We also observed that the hyphae of F-23 penetrated the epidermal cells within the host’s roots and spread from cell to cell. A large number of pelotons existed in the root cortical cells of D. officinale inoculated with F-23 fungus. Intracellular hyphae crossing through the host walls were also observed using SEM (scanning electron microscopy). In contrast, light microscopy and SEM showed that the transverse sections of the roots of control plants remained uncolonized. Therefore, the F-23 fungus can form mycorrhizal associations with the roots of its host plant, D. officinale, and enhance the growth of seedlings and roots. In brief, Mycena sp. was identified and shown to be a mycorrhizal fungus of the epiphytic orchid, D. officinale. This might be of potential use to the mass cultivation of D. officinale under artificial conditions.     

Effect of time of inoculation on in vitro ectomycorrhizal colonization and nodule initiation in Acacia holosericea seedlings

The complex interactions that occur in systems with more than one type of symbiosis were studied using one isolate of Bradyrhizobium sp. and the ectomycorrhizal fungus Pisolithus tinctorius (Pers.) Coker and Couch inoculated on to the roots of Acacia holosericea A. Cunn. ex G. Don in vitro. After a single inoculation with Bradyrhizobium sp., bacteria typically entered the roots by forming infection threads in the root hair cells via the curling point of the root hair and/ or after intercellular penetration. Sheath formation and intercellular penetration were observed on Acacia roots after a single inoculation with Pisolithus tinctorius but no radial elongation of epidermal cells. Simultaneous inoculation with both microorganisms resulted in nodules and ectomycorrhiza on the root system, occasionally on the same lateral root. On lateral roots bearing nodules and ectomycorrhiza, the nodulation site was characterized by the presence of a nodule meristem and the absence of an infection thread; sheath formation and Hartig net development occurred regularly in the region of the roots adjacent to nodules. Prior inoculation with Bradyrhizobium sp. did not inhibit ectomycorrhizal colonization in root segments adjacent to nodules in which nodule meristems and infection threads were clearly present. Conversely, in ectomycorrhizae inoculated by bacteria, the nodule meristem and the infection thread were typically absent. These results show that simultaneous inoculation with both microorganisms inhibits infection thread development, thus conferring an advantage on fungal hyphae in the competition for infection sites. This suggests that fungal hyphae can modify directly and/or indirectly the recognition factors leading to nodule meristem initiation and infection thread development.     

毛竹扩张对濒危植物桫椤根系形态可塑性的影响

为探讨毛竹(Phyllostachys heterocycla)向桫椤(Alsophila spinulosa)林扩张的根系形态可塑性变化,在赤水桫椤国家级自然保护区毛竹-桫椤混交林上分别设置受毛竹轻度、中度以及重度干扰的样地,用根钻法收集桫椤、毛竹根系并对其生物量密度、细根比根长、相邻同级侧根节点距等参数进行比对。结果表明:各干扰程度下桫椤根系生物量密度均远低于毛竹,且二者呈负相关;随着与毛竹的接近,桫椤根系生物量持续下降;各样地中毛竹细根比根长均高于桫椤;重度干扰下毛竹侧根节点距最小,侧根数目最多;且毛竹根系多分布于表层土壤。由此可见,桫椤根系逐渐趋向于分布在深层土壤,毛竹在向桫椤林扩张过程中可通过改变根系生物量密度、细根比根长、相邻同级侧根节点距等形态可塑性特征来占据优势。     

In vitro symbiotic seed germination of South Indian endemic orchid Coelogyne nervosa

Study on the dependence of orchids on fungi for seed germination and seedling development provides a mean for understanding the role of fungi in the orchid development process. The epiphytic orchid Coelogyne nervosa endemic to south India is exploited in an unsustainable manner for its therapeutic value. So a protocol for symbiotic seed germination was established for C. nervosa. We isolated a fungus by plating mycorrhizal root discs of the terrestrial orchid Eulophia epidendreae and identified it as Epulorhiza sp., by sequencing the internal transcribed spacer (ITS) regions of the ribosomal RNA gene. Germination of C. nervosa seeds was higher when inoculated with Epulorhiza sp. Uninoculated seeds of C. nervosa ceased to develop soon after the initiation of germination, and the embryo failed to rupture the seed testa. The isolated fungal hyphae entered the germinating seeds either through the pores in-between the integuments, or through the rhizoids. After the fungal establishment (peloton formation) in embryonic cells, the embryo transformed into a protocorm and after 45 days, 66% of the germinated seeds were transformed into protocorms. Nevertheless, promeristem formation occurred only after fungal association. Sixty-three percent of the protocorms developed their first leaf by 90 days and 62% of these produced a second leaf by 120 days after fungal inoculation. All the seedlings in green leaf stage produced roots and contained fungal pelotons. Our results suggest that the Epulorhiza sp. could be successfully used in the in vitro production of C. nervosa for their reintroduction into its natural environment.     

带叶兜兰种子原地共生萌发及有效菌根真菌的分离与鉴定

为获得带叶兜兰(Paphiopedilum hirsutissimum)种子萌发的共生真菌,采用原地共生萌发技术获得了2株自然萌发的小幼苗,并分离和筛选出了有效的种子萌发共生菌——瘤菌根菌(Epulorhiza sp.)。为验证分离菌株对带叶兜兰种子萌发的有效性,将Phs34号菌株与带叶兜兰种子在灭菌后的原生境基质上进行室内共生萌发试验,结果表明,经过6周的培养,对照组没有观察到种子的萌发;接菌的种子胚明显膨大,突破种皮,形成原球茎,平均萌发率为(58.35±3.41)%。这表明分离得到的瘤菌根菌能促进带叶兜兰的种子萌发。