SIRT3过表达通过调控细胞代谢转换抑制肾肿瘤细胞的增殖

目的:研究SIRT3对肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma, ccRCC)769-P细胞增殖和抗氧化能力的影响,并进一步探究其作用机制。方法:在769-P细胞的基础上构建SIRT3过表达稳转细胞系;利用CCK-8试剂检测769-P SIRT3过表达细胞的增殖速度;利用CellROX~Deep Red染料并结合流式细胞分析检测SIRT3过表达对769-P细胞中ROS水平的影响;利用定量蛋白质组学和代谢组学的方法,探究SIRT3对769-P细胞的作用机制。结果:CCK-8实验结果表明,769-P SIRT3过表达细胞的生长速度与对照细胞相比下降了约48%;定量蛋白质组学分析显示,769-P SIRT3过表达细胞中ALDOA、ALDOA、ENO2、PKM、LDHA、LDHB表达量下调约0.4至0.7倍,SDHB和CS上调约1.3倍;代谢组学分析显示,PEP、pyruvic acid、lactate、carnitine水平下降约0.4至0.7倍,isocitric acid和acetyl-CoA水平升高分别约1.3和2.8倍;分析还显示SIRT3过表达上调SOD2、TXN、GPX4和GLRX5的表达量约1.3至2倍,降低ROS水平约40%,增强细胞对过氧化氢的耐受力。结论:SIRT3过表达引起769-P细胞的代谢转换,从而抑制其增殖;且上调769-P细胞中抗氧化酶的表达,降低ROS水平,增强细胞的抗氧化能力。     

类泛素蛋白ISG15及其共价酶修饰系统与肿瘤

干扰素刺激基因15(interferon-stimulated gene 15,ISG15)编码的ISG15蛋白是最早发现的类泛素修饰蛋白。不仅干扰素和病毒感染能诱导该基因的表达,一些抗肿瘤药物也能刺激ISG15的表达。近年来,ISG15及其修饰系统与肿瘤的关系备受关注。研究证实,ISG15的激活酶E1即UBE1L与某些肿瘤的抑制有关,而其他一些成分如ISG15解聚酶UBP43则与肿瘤发生发展有关。此外,ISG15高表达与肿瘤的转移有关,ISG15对化疗药物的敏感性也有影响。本文较为全面地阐述ISG15及其修饰系统在肿瘤抑制或发生发展中的生物学作用,这将增强对ISG15与肿瘤关系的基础性认识,并为发展新的肿瘤靶向性治疗提供理论依据。     

泛素样蛋白ISG15在抗病毒天然免疫中的作用

干扰素刺激基因15(ISG15)编码的蛋白是抗病毒天然免疫通路中的重要调节因子,病毒感染和干扰素刺激均可强烈诱导ISG15的表达。ISG15是最早发现的泛素样蛋白,可对细胞内多种蛋白进行修饰并调节蛋白功能,但不介导蛋白质的降解,在机体抗病毒天然免疫反应中发挥重要作用,其机制尚未完全明确。近几年对ISG15的研究有所突破,发现了ISG15在抗病毒天然免疫反应中的新功能。我们简要概述了泛素样蛋白ISG15的概况、修饰酶系统及ISG15在抗病毒天然免疫反应中功能的研究进展。     

干扰素刺激基因15在人类免疫缺陷病毒感染中作用的研究进展

随着有效的联合抗反转录病毒疗法(combination antiretroviral therapy,cART)的普及,人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染者的生存期逐步延长。这一过程中,HIV感染者自身免疫反应对免疫系统功能的恢复也发挥了至关重要的作用。HIV感染激活干扰素信号通路,诱导干扰素刺激基因(interferon-stimulated gene,ISG)上调表达,从而发挥抗病毒作用。其中,类泛素蛋白ISG15在HIV感染者中显著上调,通过ISG化抑制HIV颗粒的出芽和释放;而HIV的非结构蛋白则通过干扰ISG化过程或结合干扰素信号通路关键分子,逆转ISG15对病毒的抑制作用。本文从ISG15的生物学特性、在不同细胞亚群中的表达、抗病毒功能及病毒逃逸机制等方面进行综述,为进一步解析ISG15在HIV感染中扮演的角色、探索如何获得以抗HIV感染宿主因子为契机的治疗策略提供了思路。     

miR-145通过靶向吞噬和细胞活力蛋白1抑制乳腺癌细胞侵袭

吞噬和细胞活力蛋白1（engulfment and cell motility protein 1,ELMO1）可以促进多种癌细胞的侵袭和转移,但ELMO1的表达是否受miRNA的调控鲜有研究。本研究旨在探讨miR-145与ELMO1表达的相关性,以及miR-145通过结合ELMO1的mRNA对乳腺癌侵袭的影响。通过TargetScan (http://www.targetscan.org/)靶基因预测软件预测与ELMO1的3′UTR结合的miR-145。荧光素酶结果证实两者互补结合。Transwell侵袭结果显示,miR-145组和siELMO1+miR-145组MDA-231乳腺癌细胞穿膜数较对照组分别降低40%（P＜0.05）和79%（P＜0.05）。siELMO1+miR-145组和siELMO1组细胞穿膜数则无显著差异（P>0.05）。结果提示,miR-145通过与ELMO1的mRNA结合抑制细胞侵袭。qRT-PCR显示,低侵袭的MCF-7乳腺癌细胞miR-145的表达量较高侵袭的MDA-435细胞高80%（P＜0.05）,较MDA-231乳腺癌细胞高75%（P＜0.05）,即miR-145与癌细胞侵袭能力呈负相关。Western印迹结果表明,miR-145组ELMO1表达量低于阴性对照组,miR-145 抑制组ELMO1表达量高于抑制剂NC组（P＜0.05）,证明miR-145抑制ELMO1的表达。qRT-PCR显示,过表达miR-145后ELMO1 mRNA含量与对照组无显著差异（P>0.05）。结果提示,miR-145对ELMO1的调控作用通过抑制其翻译实现。F-肌动蛋白聚合实验表明,miR-145组和阴性对照组于20 s和60 s时F-肌动蛋白聚合结果存在明显区别（P＜0.05）。Western 印迹结果表明,miR-145组活化的Rac1表达量较阴性对照组降低60%（P<0.05）,抑制剂NC组活化的Rac1较miR-145 抑制组降低55%（P<0.05）;miR-145组磷酸化的整合素β1较对照组于15 min时降低42%（P<0.05）,于30 min时降低31%（P<0.05）。由此得出的miR-145过表达显著促进乳腺癌细胞F-肌动蛋白聚合、Rac1活化和整合素β1磷酸化结论。综上所述,miR-145通过靶向ELMO1的 mRNA抑制ELMO1翻译,从而抑制乳腺癌的侵袭。     

七氟醚通过影响外周血miR-340水平逆转脓毒症大鼠巨噬细胞吞噬功能抑制状态的机制

摘要 目的：探究七氟醚通过影响外周血miR-340水平逆转脓毒症大鼠巨噬细胞吞噬功能抑制状态的机制。方法：60只雄性Sprague-Dawley大鼠根据研究目的将大鼠分为对照组、脓毒症组和七氟醚组。通过RT-PCR分析各组大鼠外周血miR-340以及促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表达水平。统计各实验组大鼠的存活率。通过血琼脂平板对各组大鼠腹腔液和血液中的细菌进行计数。通过使用荧光显微镜测量吞噬率和吞噬指数。通过蛋白印迹分析p65和NF-κB的蛋白表达。结果：脓毒症组miR-340水平较对照组升高（P<0.05）,七氟醚组miR-340水平较脓毒症组降低（P<0.05）。三组不同时间点存活率相比差异无统计学意义（P＞0.05）;第4 d、8 d脓毒症组大鼠存活率较对照组大鼠降低（P<0.05）,七氟醚组大鼠存活率较脓毒症组升高（P<0.05）。脓毒症组IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表达较对照组升高（P<0.05）,七氟醚组IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表达较脓毒症组降低（P<0.05）。脓毒症组腹腔液和血液中的细菌数量较对照组升高（P<0.05）,七氟醚组腹腔液和血液中的细菌数量较脓毒症组减少（P<0.05）。血琼脂平板对各组大鼠腹腔液和血液中的细菌进行计数,脓毒症组腹腔液和血液中的细菌数量较对照组升高（P<0.05）,七氟醚组腹腔液和血液中的细菌数量较脓毒症组减少（P<0.05）。脓毒症组p65和NF-κB的蛋白表达较对照组升高（P<0.05）,七氟醚组p65和NF-κB的蛋白表达较脓毒症组降低（P<0.05）。结论：miR-340参与了脓毒症大鼠巨噬细胞吞噬功能调节,七氟醚通过降低外周血miR-340水平减少内毒素诱导的大鼠促炎细胞因子的释放,并恢复巨噬细胞吞噬功能。     

miR-145通过靶向吞噬和细胞活力蛋白1抑制乳腺癌细胞侵袭

吞噬和细胞活力蛋白1（engulfment and cell motility protein 1,ELMO1）可以促进多种癌细胞的侵袭和转移,但ELMO1的表达是否受miRNA的调控鲜有研究。本研究旨在探讨miR-145与ELMO1表达的相关性,以及miR-145通过结合ELMO1的mRNA对乳腺癌侵袭的影响。通过TargetScan (http://www.targetscan.org/)靶基因预测软件预测与ELMO1的3′UTR结合的miR-145。荧光素酶结果证实两者互补结合。Transwell侵袭结果显示,miR-145组和siELMO1+miR-145组MDA-231乳腺癌细胞穿膜数较对照组分别降低40%（P＜0.05）和79%（P＜0.05）。siELMO1+miR-145组和siELMO1组细胞穿膜数则无显著差异（P>0.05）。结果提示,miR-145通过与ELMO1的mRNA结合抑制细胞侵袭。qRT-PCR显示,低侵袭的MCF-7乳腺癌细胞miR-145的表达量较高侵袭的MDA-435细胞高80%（P＜0.05）,较MDA-231乳腺癌细胞高75%（P＜0.05）,即miR-145与癌细胞侵袭能力呈负相关。Western印迹结果表明,miR-145组ELMO1表达量低于阴性对照组,miR-145 抑制组ELMO1表达量高于抑制剂NC组（P＜0.05）,证明miR-145抑制ELMO1的表达。qRT-PCR显示,过表达miR-145后ELMO1 mRNA含量与对照组无显著差异（P>0.05）。结果提示,miR-145对ELMO1的调控作用通过抑制其翻译实现。F-肌动蛋白聚合实验表明,miR-145组和阴性对照组于20 s和60 s时F-肌动蛋白聚合结果存在明显区别（P＜0.05）。Western 印迹结果表明,miR-145组活化的Rac1表达量较阴性对照组降低60%（P<0.05）,抑制剂NC组活化的Rac1较miR-145 抑制组降低55%（P<0.05）;miR-145组磷酸化的整合素β1较对照组于15 min时降低42%（P<0.05）,于30 min时降低31%（P<0.05）。由此得出的miR-145过表达显著促进乳腺癌细胞F-肌动蛋白聚合、Rac1活化和整合素β1磷酸化结论。综上所述,miR-145通过靶向ELMO1的 mRNA抑制ELMO1翻译,从而抑制乳腺癌的侵袭。     

慢性阻塞性肺病患者巨噬细胞功能与受体表达的关系研究

目的:研究慢性阻塞性肺病(COPD)患者气道巨噬细胞功能变化及其与受体表达的相关性。方法:将COPD患者84例按病情分为轻中度组44例,重度组40例,选取同期健康体检者40例作为对照组,获取3组诱导痰,分离痰巨噬细胞,检测3组吞噬荧光标记曲霉孢子的吞噬指数(PI),采用实时定量反转录PCR法检测3组吞噬相关受体的表达。结果:轻中度组与重度组细胞总数均多于对照组,而巨噬细胞比例却显著下降(P0.05);轻中度组与重度组巨噬细胞吞噬功能均受到抑制,3组PI比较差异有统计学意义(P0.05);3组巨噬细胞胶原结构清道夫系统(MARCO)、清道夫受体A1(SR-A1)表达量比较差异不明显(P0.05);轻中度组与对照组Toll样受体4(TLR4)表达量比较差异不明显,但重度组TLR4表达上调,与轻中度组、对照组比较差异有统计学意义(P0.05);3组MUC5A、AQP5表达量比较差异显著(P0.05);巨噬细胞PI与TLR4、黏蛋白5AC(MUC5A)表达量呈负相关(P0.05),与水通道蛋白5(AQP5)表达量呈正相关(P0.05)。结论:COPD患者巨噬细胞占细胞总数的比例下降,其吞噬功能也受到抑制,其机制可能与TLR4、MUC5A表达上调及AQP5表达下调等有关。     

干扰素IFNL4对巨噬细胞系THP-1免疫应答的影响

目的:分析Interferon-lambda 4(IFNL4)表达与巨噬细胞免疫应答间的关系,探讨IFNL4调控免疫应答的信号机制,发掘IFNL4在免疫调理方面的潜在应用价值。方法:建立THP-1细胞培养及分化刺激体系,使用RT-PCR检测不同分化状态THP-1细胞IFNL4的表达水平,并在THP-1细胞中过表达IFNL4,检测IFNL4过表达对THP-1细胞分泌IL-12、TNF-α、IL-10和TGF-β等细胞因子及细胞迁移效率的影响。结果:THP-1细胞分化抑制IFNL4的表达,分化前比分化后IFNL4表达水平相对定量下降255.46倍,差异显著性P0.001;M2极化巨噬细胞较M1细胞表达IFNL4因子水平升高14.69倍,显著性差异P=0.009;IFNL4过表达可抑制IL-12和TNF-α表达水平,其中TNF-α表达水平变化具有统计学意义(P=0.017),表达水下降5.97倍。IFNL4可促进IL-10和TGF-β的表达,其中TGF-β变化具有统计学意义(P=0.046),表达水平相对上升2.42倍。且IFNL4对THP-1细胞迁移效率具有抑制作用(P=0.005),刺激前细胞迁移数为45.33,IFNL4刺激后迁移数为32.67,迁移移效率下降1.39倍。结论:干扰素IFNL4在分化的M2型THP-1巨噬细胞中具有较高的表达水平,且对THP-1的免疫应答具有一定的抑制作用。     

红细胞诱导BV-2小胶质细胞制作脑出血吞噬模型的研究

目的:观察不同储存时间、不同比例的红细胞(RBC)与小鼠BV-2小胶质细胞共培养不同时间对BV-2吞噬RBC的影响。方法:将用阿氏液保存1天、7天、14天、21天、30天的小鼠RBC按照5:1、10:1、20:1、40:1的比例加入BV-2小胶质细胞中,共培养1 h、3 h、6 h、9 h,应用流式细胞术观察BV-2对于RBC的吞噬情况。结果:加入不同保存时间的RBC与BV-2小胶质细胞共培养均可见到吞噬情况,其中保存28天的效果最明显;加入不同比例的RBC与BV-2小胶质细胞共培养,均出现吞噬情况,其中40:1最明显;RBC与BV-2小胶质细胞共培养各时间点均可观察到吞噬情况,其中6小时最明显。结论:应用RBC诱导小鼠BV-2小胶质细胞制作大鼠脑出血体外模型,选择保存28天RBC与BV-2小胶质细胞的比例为40:1共培养6小时,此时BV-2小胶质细胞吞噬清除RBC的效果最明显。     

Negative regulation of protein phosphatase 2Cbeta by ISG15 conjugation

ISG15, an interferon-upregulated ubiquitin-like protein, is covalently conjugated to various cellular proteins (ISGylation). In this study, we found that protein phosphatase 2Cbeta (PP2Cbeta), which functions in the nuclear factor kappaB (NF-kappaB) pathway via dephosphorylation of TGF-beta-activated kinase, was ISGylated, and analysis by NF-kappaB luciferase reporter assay revealed that PP2Cbeta activity was suppressed by co-expression of ISG15, UBE1L, and UbcH8. We determined the ISGylation sites of PP2Cbeta and constructed its ISGylation-resistant mutant. In contrast to the wild type, this mutant suppressed the NF-kappaB pathway even in the presence of ISG15, UBE1L, and UbcH8. Thus, we propose that ISGylation negatively regulates PP2Cbeta activity.     

新型PEI衍生物的体外表征及对巨噬细胞的转染效果研究

目的:以PEI1.8kDa为基础连接戊二醛合成新型可降解PEI衍生物GPEI后,研究GPEI包裹质粒转染巨噬细胞后对巨噬细胞合成蛋白及表型的影响。方法:合成GPEI后,检测了GPEI质粒聚合物的粒径及电位,并通过透射电镜观察聚合物形态,通过免疫荧光、WB、RT-PCR、Elisa及Transwell实验检测巨噬细胞RNA、蛋白、终产物水平变化及表型改变。结果:GPEI能够包裹质粒,形成100 nm左右带有正电荷的聚合物,WB、RT-PCR结果表明GPEI转染较PEI25kDa有优势(P0.05),巨噬细胞转染后6天持续分泌PGI2(P0.05)。结论:以PEI1.8kDa为基础合成的GPEI能够包裹PTGIS质粒并将其转染进巨噬细胞后对巨噬细胞的表型有明显影响。     

双氢青蒿素调控巨噬细胞增殖和迁移的作用研究

目的:探讨双氢青蒿素在体外对小鼠单核巨噬细胞RAW264.7的增殖、克隆形成、周期、凋亡和迁移的影响。方法:采用梯度浓度(2.5μg/m L, 5μg/m L, 10μg/m L, 20μg/m L)的双氢青蒿素处理RAW264.7细胞,利用CCK8实验检测双氢青蒿素对巨噬细胞增殖能力的影响,利用克隆形成实验检测双氢青蒿素对RAW264.7细胞克隆形成能力的影响,利用流式细胞术检测双氢青蒿素对RAW264.7细胞周期和凋亡的影响,利用划痕修复实验检测RAW264.7细胞迁移能力。结果:CCK8实验结果显示,双氢青蒿素可以显著抑制RAW264.7巨噬细胞的增殖能力,且抑制效果与双氢青蒿素的浓度呈正相关性。克隆形成实验结果显示,双氢青蒿素可以抑制细胞的克隆形成能力。双氢青蒿素处理使RAW264.7细胞G0/G1期比例显著升高,S期与G2/M期细胞比例显著降低。双氢青蒿素对巨噬细胞凋亡具有诱导作用,且凋亡诱导作用呈现浓度依赖的特性。划痕修复实验结果显示,双氢青蒿素可以显著抑制RAW264.7巨噬细胞的迁移能力。结论:双氢青蒿素可以导致巨噬细胞的细胞周期G0/G1阻滞,并且诱导细胞凋亡,对巨噬细胞增殖和迁移具有抑制作用。     

Bmi1过表达通过促进增殖、抑制凋亡纠正活性维生素D缺乏引起的骨量降低

摘要 目的：探索B淋巴瘤Mo-MLV插入区1（B cell-specific MLV integration site-1, Bmi-1）过表达能否通过促进增殖、抑制凋亡改善1,25-二羟基维生素D (1,25-dihydroxy vitamin d,1,25(OH) ₂D)缺乏引起的小鼠骨质骨量丢失。方法：取8月龄Bmi-1 ^Tg 、Bmi1 ^Tg 1α(OH)ase^+/-与 1α(OH)ase^+/-小鼠以及同窝野生型（wild type, WT）小鼠椎骨组织,通过流式细胞术及TUNEL染色检测间充质干细胞周期变化及凋亡水平,通过PCNA染色及免疫组织化学染色检测小鼠椎骨组织中Bcl-2、Caspase-3等指标的变化,通过Western blot检测小鼠椎骨中Caspase-3、CDK4、CDK6、OPN、OCN等蛋白表达量的差异,通过ALP染色检查成骨细胞骨形成水平。结果：在骨髓间充质干细胞中过表达Bmi1可以通过促进增殖,抑制凋亡、增加成骨细胞骨形成来纠正1α(OH)ase^+/-小鼠的骨量降低。结论：Bmi1是1,25(OH) ₂D的关键下游靶点,在防止1,25(OH) ₂D缺乏引起的骨丢失方面起着至关重要的作用。     

Glutathionylation Decreases Methyltransferase Activity of PRMT5 and Inhibits Cell Proliferation

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Highlights

• •PRMT5 glutathionylation is increased in aged mice or under oxidative stress.
• •Deglutathionylation of PRMT5 is catalyzed by glutaredoxin-1.
• •PRMT5 glutathionylation decreases its methyltransferase activity.
• •PRMT5 glutathionylation results in G2/M arrest and inhibits cell proliferation.

     

α-硫辛酸下调Grb2抑制A549细胞增殖的研究

目的:探讨α-LA对A549细胞增殖的机制以及Grb2在其中发挥的作用。方法:利用CCK-8和流式细胞术检测α-LA对细胞增殖的影响;实时定量PCR和Western Blot检测细胞中Grb2表达的变化;利用向细胞中转染siGrb2及过表达Grb2载体检测细胞中Grb2表达水平差异对细胞增殖的影响。结果:α-LA处理A549 24 h后,对照组和α-LA处理组中位于G_0/G_1期细胞的比率由40.60%上升至57.80%;而位于S期细胞的比率由45.96%下降至39.01%;与细胞G1/S期的转换相关的调节蛋白CDK2/4/6,cyclin D3和E1的表达也随之发生了相应的改变,α-LA通过抑制细胞G_1/S期的转换而抑制细胞增殖。与亲本细胞相比,Grb2在α-LA处理A549细胞中的转录和蛋白表达水平均显著降低,干扰细胞中Grb2表达能显著抑制A549增殖;而过表达Grb2可阻断α-LA诱导的细胞增殖抑制。结论:α-LA具有抑制A549细胞增殖的作用,Grb2是α-LA发挥抑细胞增殖效应的重要介导因子。     

腺苷脱氨酶抑制巨噬细胞增殖迁移的作用研究

目的:探讨腺苷脱氨酶对鼠源巨噬细胞RAW264.7增殖、迁移、细胞周期、细胞凋亡的影响.方法:用不同浓度(0、0.25、1.25、2.5、5U/mL)的腺苷脱氨酶处理RAW264.7细胞后,用实时细胞分析系统检测细胞增殖能力,用流式细胞术检测腺苷脱氨酶对细胞凋亡和周期的影响,划痕修复实验检测RAW264.7细胞迁移能力...