猪瘟病毒糖蛋白E0基因的克隆及其表达研究*

用ＲＴ－ＰＣＲＡ法扩增分别获得了中国猪瘟病毒强毒石门株和免化弱毒株糖蛋白Ｅ０基因ｃＤＮＡ,并克隆到ｐＧＥＭ Ｔ载体中测定其核着酸序列和推导出其对应氨基酸序列;结果表明这两个毒株间的Ｅ０基因核着酸序列同源性为９５．３％,氨基酸序列同源性为９４％,有１４个残基的差异;与几个代表毒株ＡＬＤ株、ＧＰＥ株、Ｂｒｅｓｃｉａ株、Ａｌｆｏｒｔ株和国外测得的免化弱毒Ｃ株相应序列进行比较,所测石门病毒核苷酸序列与上述各株对应序列的同源性分别为９８．０％、９７．１％、９２．７％、８６．８％和９５．４％;氨基酸序列同源性分别为９     

我国猪瘟病毒兔化弱毒株囊膜糖蛋白E0基因的克隆及序列测定

采用异硫氰酸胍一步法从４８０代猪瘟病毒兔化弱毒株（ＨＣＬＶ）脾毒中提取总ＲＮＡ,以该ＲＮＡ为模板,进行反转录,然后采用套式ＰＣＲ扩增出ＨＣＬＶ的囊膜糖蛋白Ｅ０基因,琼脂糖凝胶电泳表明其大小与预计相符。将扩增出的Ｅ０基因克隆到ｐＧＥＭＴ载体中,用自动序列分析仪对其进行序列测定。将测得的序列及推导的氨基酸序列与国外测得的Ｃ株相应序列进行比较,结果发现,它们之间核苷酸序列同源性为９９．０８％,氨基酸序列同源性为９８．４２％。     

我国猪瘟病毒兔化弱毒株囊膜糖蛋白E0基因的克隆及序列测定

采用异硫氰酸胍一步法从480代猪瘟病毒兔化弱毒株(HCLV)脾毒中提取总RNA,以该RNA为模板,进行反转录,然后采用套式PCR扩增出HCLV的囊膜糖蛋白E0基因,琼脂糖凝胶电泳表明其大小与预计相符.将扩增出的E0基因克隆到pGEM-T载体中,用自动序列分析仪对其进行序列测定.将测得的序列及推导的氨基酸序列与国外测得的C株相应序列进行比较,结果发现,它们之间核苷酸序列同源性为99.08%,氨基酸序列同源性为98.42%.     

猪瘟病毒石门株与兔化弱毒株E0糖蛋白基因的克隆及序列分析

参考已发表的猪瘟病毒序列,设计并合成了一对引物,应用ＲＴＰＣＲ 技术,扩增了猪瘟兔化弱毒（Ｈｏｇ ｃｈｏｌｅｒａ ｖｉｒｕｓ ｌａｐｉｎｉｚｅｄ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｓｔｒａｉｎ , ＨＣＬＶ） 和石门强毒株的Ｅ０ 糖蛋白基因,并将其克隆到ｐＧＥＭＴ 载体中,测定了其核苷酸序列,并推导了其氨基酸序列。结果表明我国这两株强弱不同毒株Ｅ０ 糖蛋白核苷酸序列同源性和推导的氨基酸序列同源性分别为９５－０ ％ 和９４－３ ％ ,有１３ 个氨基酸的差异,ＨＣＬＶ 比石门株多了一个潜在的Ｎ糖基化位点。将我国这两株病毒与国外已报导的ＨＣＶ 毒株Ｅ０ 基因序列进行了比较,发现石门株与日本的两株毒株ＡＬＤ 和ＧＰＥ－ 同源性较高,核苷酸序列同源性分别为９７－４ ％ 和９６－５ ％ ,氨基酸同源性分别为９７－４ ％ 和９６－０ ％ ,而与欧洲Ｂｒｅｓｃｉａ 株和Ａｌｆｏｒｔ 株同源性较低,核苷酸同源性分别为９２－２ ％ 和８６－５ ％ ,氨基酸同源性为９５－２ ％ 和９２－５ ％ , ＨＣＬＶ 与ＡＬＤ、ＧＰＥ－ 、Ｂｒｅｓｃｉａ、Ａｌｆｏｒｔ 株核苷酸同源性分别为９５－６ ％ 、９４－９ ％ 、９１－３ ％ 、８５－５ ％ …     

表达猪瘟病毒石门株E0基因重组鸡痘病毒的构建及动物免疫试验

应用PCR从质粒pMD18-T-E0中扩增编码CSFV E0蛋白的基因片段,定向克隆到重组鸡痘病毒表达载体FPV-P11上,进一步构建出重组鸡痘病毒转移载体FPV-pSY-E0.用脂质体将该质粒转染至鸡痘病毒感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)后,通过蓝斑纯化实验筛选出重组鸡痘病毒FV282-CSFV-E0.PCR证实E0基因已整合至鸡痘病毒基因组中,Western blot检测到重组病毒感染CEF细胞中E0蛋白的表达.重组病毒3次腹腔接种小鼠,ELISA检测血清抗体滴度高达1∶4 096.重组病毒免疫猪3次之后,接种猪瘟病毒强毒进行攻毒试验,结果对免疫组产生75%的保护率,为研制猪瘟活载体疫苗奠定了基础.     

猪瘟病毒E2基因主要抗原区的克隆及原核表达

利用反转录PCR（RT－PCR）和套式PCR（nest Polymerase Chain Reaction,nPCR)技术扩增出当前猪瘟流行毒（广西玉林株,GXYL)一中国猪瘟兔化弱毒（C－株）兔脾组织毒E2基因的主要抗原区,将其克隆到表达载体pPROEX-HTb中,获得重组质粒pPROEX-GXYL和pPROEX-C,经PCR,酶切和序列分析鉴定表明,插入的位置,大小和读码框均正确。SDS－PAGE,检测表明,经重组质业pPROEX-GXYL和pPROEX-C转化,诱导的受体菌能表达E2基因主要抗原区蛋白,Western-blot检测表明,诱导表达的抗原蛋白能与猪瘟阳性血清发生特异性反应。     

热休克蛋白70促进猪瘟病毒囊膜糖蛋白E0的小鼠免疫效果

为了初步探索热休克蛋白70(Hsp70)作为分子佐剂增强猪瘟病毒亚单位疫苗的免疫效果,本研究根据猪瘟病毒兔化弱毒株囊膜糖蛋白E0的基因序列,设计一对特异性引物,RT-PCR扩增得到完整的E0基因,将其分别插入到原核表达质粒pColdI和含有副猪嗜血杆菌Hsp70的pColdI-Hsp70中,构建了pColdI-E0和pColdI-E0-Hsp70重组质粒,经IPTG诱导表达后,获得了E0、Hsp70和E0-Hsp70融合蛋白。将以上三种蛋白纯化后分组免疫Balb/c小鼠,通过ELISA和流式细胞术测定了小鼠针对E0蛋白的体液免疫和细胞免疫效果。结果显示:E0-Hsp70融合蛋白和E0+Hsp70混合物免疫后均能显著提高抗E0的抗体效价、CD4+和CD8+T细胞水平,并促进IFN-γ的释放。研究结果表明Hsp70能显著增强猪瘟病毒囊膜糖蛋白E0在小鼠上的免疫效果,为在猪体上的进一步应用奠定了基础。     

猪瘟病毒流行毒株E2基因密码子优化及在酵母中的高效表达

密码子的偏嗜性是影响基因异源表达的重要参数之一,优化密码子序列能够提高外源基因的表达水平。野生型猪瘟病毒E2基因在毕赤酵母中的表达量较低,为了提高E2基因在毕赤酵母中的表达水平,利用PCR基础上的定点突变技术将E2基因上的毕赤酵母低利用密码子突变为其高利用率的简并密码子。结果表明,替换野生型E2基因上24个酵母低利用密码子后,E2基因在酵母中表达水平有较显著提高,表明通过密码子优化提高E2基因在毕赤酵母中的表达这一策略是成功的。     

猪瘟病毒囊膜糖蛋白E0的RNA酶活性及其研究进展

猪瘟病毒（CSFV,Classicalswinefevervirus）属于黄病毒科瘟病毒属,同属的成员还有牛病毒性腹泻病毒（BVDV）和羊的边界病病毒（BDV）。猪瘟病毒是一种有囊膜的单股正链RNA病毒,基因组大小约12．3kb,含有一个大的ORF,此ORF编码一个大的多聚蛋白,经宿主和病毒编码蛋白酶的共同作用,在共同翻译中和／或翻译后,将此多聚蛋白加工成病毒的结构蛋白和非结构蛋白．猪瘟病毒基因组的5＇端编码病毒结构蛋白,即衣壳蛋白（C）和三个囊膜糖蛋白（E0、E1、E2）。其中E0和E2能够刺激机体产生中和抗体,并使猪获得免疫力[1,2]．意外发…     

猪瘟病毒E2基因在Pichia pastoris中的表达及其免疫活性的初步研究

将猪瘟病毒的E2基因克隆入酵母分泌型表达载体pPIC9K中,酶切线性化后电穿孔导入Pichia pastoris进行整合,经G418筛选得到高拷贝转化子,甲醇诱导表达。SDS－PAGE和Western blit结果证实了酵母培养上清液中含有E2蛋白。免疫活性研究证明P.pastoris表达的E2蛋白能刺激动物产生抗猪瘟病毒的抗体。     

猪瘟病毒的重组分析

以21株猪瘟病毒的编码序列作为研究对象,通过对基因树的比较和四重体分析,研究猪瘟病毒毒株间可能的重组关系。分析结果表明,ALD(D49532)与GPE-(D49533)问可能有一重组片段E0、E1和E2,而持续感染毒株CSFV39(AF407339)中的NS5A-NS5B可能来源于Shimen强毒株(AF092448),这说明不同猪瘟病毒极有可能在自然环境或减毒疫苗的应用过程中由于混合感染而发生遗传物质的交换,从而适应宿主环境的改变,并产生特殊的表型。     

猪瘟病毒E2基因在昆虫细胞/杆状病毒中的表达

目的利用昆虫细胞/杆状病毒系统表达猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白,用于E2蛋白功能、开发CSF新型疫苗以及建立相关血清学诊断方法等研究。方法采用RT-PCR扩增CSFV E2基因,将PCR产物克隆到pGEM-T-Easy载体,将该基因插入到pFast-BacHT A载体中,构建重组转座载体后转化DH10Bac感受态细胞,获得重组Bacmid质粒后转染sf9昆虫细胞,传毒3代,对表达蛋白进行Western-blot及免疫组化鉴定。结果成功克隆CSFVE2基因,其核苷酸序列为1119 bp。SDS-PAGE电泳结果显示表达E2蛋白相对分子质量约为43×103,Western-blot和免疫组化结果证实表达蛋白能够被CSFV标准阳性血清识别。结论在Bac-to-Bac杆状病毒系统中的成功表达了CSFV E2蛋白,与CSFV标准阳性血清具有较好的反应性。     

猪瘟病毒E2蛋白A3BCD主要抗原结构域的原核表达

目的：对猪瘟病毒E2蛋白A3BCD进行原核表达,以期获得具有抗原活性的表达产物。方法：利用反转录PCR（RT-PCR）和套式PCR（nPCR）技术从河南省近期流行猪瘟病毒野毒株中扩增得到E2基因,并将其克隆至pUCm-T载体,构建克隆载体pUCm-TE2;利用PCR方法扩增E2基因的主要抗原域A3BCD,克隆至pET-32a（＋）载体,构建表达载体pET-32aE2-2,转化到大肠杆菌Rosetta（DE3）中,用IPTG进行诱导表达,对诱导产物进行SDS-PAGE和Western-blotting分析。结果：SDS-PAGE结果显示在相对分子质量约35000处出现预期条带,表达产物主要以包涵体形式存在;Western-blotting检测表明,表达产物能与猪瘟病毒阳性血清发生特异性反应,出现单一反应带;用8mol／L尿素（pH8.0）溶解包涵体,经Ni-NTA亲和层析法纯化,获得纯度较高的目的蛋白,ELISA检测表明能与猪瘟抗体阳性血清发生特异性反应。结论：重组质粒pET-32aE2-2转化大肠杆菌Rosetta（DE3）,解除了由于稀有密码子造成的表达限制,表达量得到提高;表达产物为硫氧还蛋白和E2-2的融合蛋白,易于纯化,且具有活性,为研制猪瘟抗体ELISA检测试剂盒奠定了基础。     

表达猪瘟病毒石门株E2抗原的重组腺病毒构建及免疫性研究

应用PCR从pMD18-T-E2质粒中扩增编码猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白的基因片段,定向克隆到重组腺病毒Adeasy-1系统的穿梭质粒pAdTrack-CMV上,采用细菌内同源重组"两步转化法"构建携带CSFVE2基因的重组腺病毒基因组质粒pAdEasy-E2,转染293细胞,成功包装出重组腺病毒pAd-E2,PCR证实E2基因已整合至腺病毒基因组中,Western blot结果检测到重组病毒转染293细胞中E2蛋白的表达。ELISA检测结果表明,pAd-E2能刺激小鼠产生高效价的抗体,也能刺激猪体产生抗体。将pAd-E2通过肌肉和皮下接种途径免疫商品化猪2次,21d后用1000倍TCID50CSFV强毒攻击。pAd-E2免疫组有1/4头死亡,而非重组腺病毒pAd-CMV免疫组和空白对照组全部死亡。该研究为研制猪瘟基因工程疫苗提供了有用的数据。     

基于甲病毒复制子载体的猪瘟DNA疫苗的免疫效力评价

此前已构建了基于SemlikiForest病毒(SemlikiForestvirus,SFV)复制子载体的表达猪瘟病毒(classicalswinefevervirus,CSFV)E2基因的新型猪瘟DNA疫苗pFV1CS-E2,通过动物试验证实,该疫苗以600μg/头的剂量免疫3次,免疫猪能抵抗致死剂量猪瘟强毒的攻击。为进一步评价该疫苗在较低的免疫剂量和较少的免疫次数情况下的免疫效力,将DNA疫苗pSFV1CS-E2和空载体pSFV1CS按100μg/头的剂量,接种猪只2次,然后用致死剂量的猪瘟强毒石门株进行攻击。结果表明,pSFV1CS-E2免疫组(n=5)所有免疫猪在加强免疫后均产生了猪瘟特异性中和抗体,攻毒后所有猪只抗体迅速升高,除了短期体温升高外,未出现任何其它临床症状,部分猪出现短期轻微病毒血症,个别猪的部分脏器出现轻微病变;而空载体免疫组(n=3)猪只在攻毒前一直没有检出特异性抗体,攻毒后全都出现典型的猪瘟临床症状和严重的病毒血症,有2头猪分别于攻毒后第10和11d死亡,剖检时可见典型猪瘟病理变化。结果表明,基于甲病毒复制子载体的猪瘟DNA疫苗有望成为具有开发价值的猪瘟标记疫苗。     

猪瘟病毒石门株NS2—3基因片段的序列测定及比较

根据猪瘟病毒Ｃ株的序列,以计算机辅助设计,化学合成１对引物（ＰＦ５６４８／ＰＲ６６０４）,应用ＲＴＰＣＲ技术从感染猪血中成功地扩增了我国猪瘟病毒强毒石门株ＮＳ２３基因片段,大小为９５７ｂｐ,位于ＮＳ３基因的中部ＮＴＰａｓｅ和Ｈｅｌｉｃａｓｅ活性区。克隆后测序,结果表明该段基因产物具有解旋酶超家族全部七个特征性保守序列,包括共同的ＮＴＰ结合基序Ａ位点（ＧＸＧＫＴ／Ｓ）和Ｂ位点（３ｈｙ,２ｘ）Ｄ。序列同源性比较表明,石门株与日本的ＡＬＤ和ＧＰＥ－株同源性最高,与其它３株猪瘟病毒（Ｃ株、Ｂｒｅｓｃｉａ株和Ａｌｆｏｒｔ株）的同源性也很高,并与２株牛病毒性腹泻病毒（ＢＶＤＶ）（ＮＡＤＬ株和ＳＤ１株）也有较高的同源性,尤其是由核苷酸序列推导的氨基酸序列,同源性均大于９０％,是瘟病毒属基因组中最保守的区段,这与该基因产物在病毒复制及聚蛋白前体加工过程中所具有的重要功能是一致的