大肠杆菌TdcC、SstT和LIV-1系统缺失对胞外L-苏氨酸积累的影响

【目的】比较分析苏氨酸吸收系统TdcC、SstT和LIV-1缺失对大肠杆菌吸收和积累胞外苏氨酸的影响。【方法】从菌株E.coli W3110出发,敲除tdcC、sst T和liv J基因,构建Tdc C、SstT和LIV-1系统单缺失和多缺失菌株,将过量表达苏氨酸操纵子基因的重组质粒pKKthr AC1034TBC分别转入原始菌和重组菌,考察各菌株吸收和积累胞外苏氨酸的能力。【结果】敲除tdc C和sst T基因的重组菌T04的苏氨酸吸收能力比原始菌W3110降低了43.28%,T04(pKKthr AC1034TBC)胞外苏氨酸积累量最高达到1.09 g/L,比对照菌W3110(pKKthr AC1034TBC)高出172.5%。敲除tdcC、sstT和livJ基因的重组菌T07的苏氨酸吸收能力比T04降低了12.97%,然而T07(pKKthr AC1034TBC)胞外苏氨酸积累量最大为0.63 g/L,与T04(pKKthr AC1034TBC)相比降低了42.2%。【结论】阻断Tdc C和Sst T系统,能有效降低大肠杆菌吸收苏氨酸的能力,提高苏氨酸的胞外积累量。阻断LIV-1系统,虽然能减少大肠杆菌对苏氨酸的吸收,却不利于菌株积累胞外苏氨酸。     

重组番茄食品的安全性在英国得到认可并于年内销售

英国Zeneca公司1月5日宣布以该公司开发的重组番茄为原料生产的加工食品得到英国农业部的安全性认可。Zeneca公司预计95年底在英国销售使用这种重组番茄生产的番茄糊和番茄酱等加工食品。顺利的话,在英国将是第一个重组食品。 Zeneca公司的重组番茄是抑制使细胞壁软化的酶—聚半乳糖醛酸酶(PG)的表达的。1994年3月经在美国Calgene公司、美国Campbell Soup公司之间协商。Zeneca公司仍具有加工用重组番茄(使     

Archer Daniels公司获得柯达公司的氨基酸技术的专有允许

最近,Eastman Kodak(柯达)公司生物产品部向Archer Daniels Midland(ADM)公司颁发其氨基酸技术允许,并进一步寻求生物技术合作机会。在此交易中,ADM将拥有上述技术的全球独家销售和生产权,而柯达将拥有专利权,并将接受转让费及专利使用费。柯达还能选择性地生产部分产品。该技术是传统方法与重组DNA技术的结合,它采用独特的菌体来生产赖氨酸、色氨酸及苏氨酸,效率高于     

产L-苏氨酸重组大肠杆菌的构建和发酵性能

【背景】大肠杆菌由于生长性能优良、遗传背景清晰,常被用作苏氨酸生产菌。【目的】敲除大肠杆菌Escherichia coli THR苏氨酸合成途径的非必需基因,并异源表达苏氨酸合成必需的关键酶,构建一株苏氨酸高产菌株。【方法】利用FLP/FRT重组酶系统,敲除E. coli THR中lysC、pfkB和sstT,同时进行谷氨酸棒杆菌中lysC~(fbr)、thrE和丙酮丁醇梭菌中gapC的重组质粒构建并转化到宿主菌中。【结果】以E. coli THR为出发菌株,敲除其苏氨酸合成途径中表达天冬氨酸激酶Ⅲ (AKⅢ)的基因lysC、磷酸果糖激酶Ⅱ基因pfkB及苏氨酸吸收蛋白表达基因sstT,使菌株积累苏氨酸的产量达到75.64±0.35g/L,比出发菌株增加9.9%。随后异源表达谷氨酸棒杆菌中解除了反馈抑制的天冬氨酸激酶(lysC~(fbr))、苏氨酸分泌转运蛋白(thrE)及丙酮丁醇梭菌中由gapC编码的NADP+依赖型甘油醛-3-磷酸脱氢酶,获得重组菌株E. coli THR6菌株。该菌株积累苏氨酸的产量提高到105.3±0.5 g/L,糖酸转化率提高了43.20%,单位产酸能力提高到5.76 g/g DCW,最大生物量为18.26 g DCW/L。【结论】单独敲除某个基因或改造某个途径不能使苏氨酸大量合成和积累,对多个代谢途径共同改造是构建苏氨酸工程菌的最有效方法。     

重组牛壁虱疫苗的销售

澳大利亚Biotech Australia公司宣布从8月起开始销售牛壁虱用的基因重组疫苗制剂“Tick GARD”。这是世界首批重组寄生虫疫苗,由亲公司—Hoechst Australia公司销售。“Tick GARD”是抗澳大利亚较严重的牛壁虱(Boophilus microplus)的疫苗。在澳大利亚由壁虱造成的损失每年有1亿澳元(约70亿日元)。 “Tick GARD”是Biotech Australia公司和澳大利亚的国立研究机构CSIRD花10年时间开发的。它是用微生物基因重组技术生产纯化壁虱消化道中的蛋白Bm86,包在油性佐剂内的制剂。在牛耳后接种含     

重组杂交油菜的商业化在加拿大获得认可

比利时PGS International公司95年5月9日宣布加拿大粮农部批准该公司商业栽培重组杂交油菜(F_1油菜)。该部认为,这种重组F_1油菜可作动物饲料使用。栽培重组F_1油菜,对环境也无不利影响。该公司已得到加拿大卫生部许可作为食品销售重组F_1油莱。 该公司领先世界开发了生产F_1种子用的亲株制作技术“Seedlink”(通过结合使用向花粉细胞特异的     

91年12月销售重组胰岛素

新北欧药物公司在12月销售5种重组人胰岛素制剂。这是用美国Zymogenetics公司开发的酵母为宿主,利用基因操作技术制造的。该公司现也已申请引进配合型和注射制剂等,1992年将胰岛素制剂更换成重组人胰岛素,分割该公司和日本市场的盐野义制药公司、美国Eli Lilly公司从1986年销售重组人胰岛素。日本决定1992年用基因操作技术制造胰岛素。丹麦Novo Nordisk公司开发用蛋白分解酶将猪胰岛素(有一个氨基酸序列与人的不同)变换成人型的制造     

大肠杆菌全细胞转化联产L-2-氨基丁酸和D-葡萄糖酸

以大肠杆菌BL21(DE3)为表达宿主,构建两株分别表达L-苏氨酸脱氨酶(LTD,基因来源大肠杆菌)和共表达亮氨酸脱氢酶(LDH,来源蜡样芽孢杆菌)/葡萄糖脱氢酶(GDH,来源枯草芽孢杆菌)的重组大肠杆菌,在此基础上,构建了一种以L-苏氨酸和D-葡萄糖为底物联产L-2-氨基丁酸(L-ABA)和D-葡萄糖酸的全细胞转化系统。通过转化条件(温度、p H、细胞通透性和菌体量)优化,并采用分批补料策略,164 g/L L-苏氨酸和248 g/L D-葡萄糖最终转化得到141.6 g/L的L-ABA和269.4 g/L的D-葡萄糖酸,时空得率分别达到7.1 g/(L?h)和13.5 g/(L?h),得率超过99%。本研究使用价格低廉的大宗化学品高效率生产出有较高附加值的产物,全细胞转化系统无需额外添加昂贵的辅酶,更适用于工业化生产。     

日本氨基酸生产研究又获进展

在1987年日本农艺化学会年会上,协和发酵工业公司防府工厂技术研究所报告说,仅通过突变育种技术就能大幅度提高L-苏氨酸产生菌(大肠杆菌)的产酸量。原株一旦积累苏氨酸,回复变异就易发生,发酵生产24次中正常生产只能维持5次,产酸浓度为20g/L左右。现在只通过突变育种获得了发酵68小时可稳产58g/L的菌种,达到工业化     

日年内销售重组γ干扰素

日本厚生大臣的咨询机关——中央药事审议会抗恶性肿瘤剂调查会,这月批准盐野义制药公司提出制造申请的重组γ干扰素(rIFN)作为肾癌的治疗药。如果在药品特别会议,且在常务会议上顺利通过的话,估计今秋就能得到正式批准。另外,如赶上年底的药价收载,年内就可以销售。但最迟明年上半年在日本销售γ干扰素。该公司研制的γ干扰素是从美国Biogen公司技术引进,以大肠杆菌为宿主生产的,1986年11月就向厚生省提出     

鲑生长激素的基因操作宿主由大肠菌杆转向酵母菌

为用基因操作制造鲑生长激素,所用宿主由大肠杆菌的实用化研究,已在日本协和发酵公司开始。该公司从美国菲利普(Phillips)石油公司引进了甲醇同化酵母菌巴斯德毕赤酵母(Pichia Pastoris)的基因操作技术和高浓度培养技术,并着手共同研究。 这次的引进表明,用大肠杆菌工业生产具有活性的鲑生长激素(SGH)看来是困难的。SGH是疏水性高、难溶于水的蛋白,用大肠杆菌制造的重组SGH也难于提纯。     

用酵母分泌表达味觉变革蛋白

研究将酸味变成甜味等修饰味觉的蛋白(味觉变革蛋白)的横滨国立大学教育部教授栗原良枝等小组着手研究用基因重组酵母分泌表达味觉变革蛋白奇异果素、葡糖醛酸。奇异果素是与东燃公司,葡糖醛酸是与旭电化工业,东京大学农学部教授荒井综一共同开发的。4月2日在日本农艺化学会上发表了用大肠杆菌表达重组基因的成果,但是用重组大肠杆菌表达的蛋白都没有味觉变革活性。目的是用酵母分泌表达,获得活性型蛋白。为味觉变革蛋白的结构活性的解明和大量生产开辟道     

肠出血性大肠杆菌毒力因子Z1444的原核表达及其丝/苏氨酸激酶活性验证

目的:在大肠杆菌中表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)毒力岛上的毒力因子Z1444并纯化,对其丝/苏氨酸激酶活性进行初步检测。方法:根据GenBank中Z1444基因序列及pET-28a(+)载体的多克隆位点设计引物,以EHECO157∶H7全菌裂解液为模板,经PCR钓取1047 bp的目的片段,与表达载体pET-28a(+)连接,构建重组表达质粒pET-28a(+)-Z1444,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导蛋白表达并经SDS-PAGE鉴定,利用体外反应体系鉴定重组蛋白的丝/苏氨酸激酶活性。结果:双酶切和测序鉴定表明,pET-28a(+)-Z1444原核表达质粒构建正确;诱导表达后经纯化,获得纯度在90%以上的可溶性重组Z1444,相对分子量约为38×103;体外酶活实验验证了Z1444的丝/苏氨酸激酶活性。结论:Z1444在大肠杆菌中获得高效可溶性表达,为后续功能验证奠定了基础。     

新的表达克隆法

世界最大的产业用酶厂家丹麦Novo Nordisk公司表示正在实用化不必纯化酶、但克隆酶的基因,以曲霉为宿主大量生产酶的新系统。该系统是首先使用大肠杆菌构建编码酶的、真菌的DNA文库。接着在酵母中导入文库基因,获得在平皿上检测酶活性的菌株,再将基因移到曲霉Aspergillus上,大量生产具有目的活性的酶。Novo公司正在配备用该系统大量生产的酶是“Monocomponent enzyme(单一成分酶)”。Novo公司确立以洗涤剂用脂酶为开湍事业化的新系统可以说是很有优势的。 Novo公司11月销售的纤维加工用重组纤维素酶制剂也是用该系统开发的产品。据说这种单一成分酶可高效率地分解非结晶区域的纤维素的结合,但强度不会降低且有效地防止起绒毛。     

谷氨酸棒杆菌YILW苏氨酸脱水酶基因的克隆表达及酶学性质

将L-异亮氨酸生产菌谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum YILW)苏氨酸脱水酶(threonine de-hydratase,TD)的编码基因ilvA在大肠杆菌中进行异源表达及进行初步的酶学性质研究。分别以C.glutamicum ATCC13032、YILW的基因组DNA为模板,利用PCR技术扩增出苏氨酸脱水酶的编码基因ilvA,测序获得编码序列。利用质粒PET-His将该基因在大肠杆菌BL21(DE3)中进行重组表达、金属螯合纯化,对其酶学性质进行初步研究。结果显示C.glutamicum YILW编码基因序列与已报道的ilvA序列相差5个碱基,相似度为99.6%,第383位氨基酸由苯丙氨酸突变为缬氨酸。酶学性质研究表明:重组酶YilwTD最适反应温度为32℃,在20~55℃范围内该酶较稳定,最适pH为6.7,该酶底物专一性强,对最适底物苏氨酸的米氏常数Km=8.32 mmol/L,最大反应速度Vmax=3.18×104U/mg,与野生型酶相比,突变(F383V)后可显著降低终产物对酶的反馈抑制作用。为揭示突变对苏氨酸脱水酶活性的影响及进一步利用基因工程技术改造L-异亮氨酸生产菌,提高L-异亮氨酸产量奠定了基础。     

人IFNa用于家畜

匈牙利TRIGON Biotechnological Company公司宣布作为家畜药今年10月由匈牙利销售人α干扰素(IFNa)制剂、"TRIGOFERON"。是子牛的免疫不全的治疗药。IFN作为动物药实用化是世界首创。在日本东雷公司已在开发重组猫IFN,打算近期申请生产。IFN的用途开始扩大。TRIGON公司是匈牙利的制药企业EGIS Pharmaceuticals公司的100%子公司,为用仙台病毒刺激从血液中抽提的白血球,生产天然的IFNa而成立的。1987年在匈牙利销售作为治疗睫状细胞白血病的药物。     

Mérieux研究所和法国血液中心共同研究与发展重组DNA

两个联合风险公司将为Merieux研究所(法国里昂)和法国全国输血中心(NCBT)生产和销售重组的医疗蛋白。第一个是T.M.Innovation公司,它将利用生物技术研究与发展医疗蛋白,以取代人蛋白。这项研究将由输血中心的生物技术主任Gerard Jaquin主持。一旦得到了销售许可,合作伙伴T.M.SA公司将在Merieux研究所免疫学主任 Jacques Biot的领导下销售重组严品。 T.M.Innovation公司将利用其年预算五千万法朗(合8百万美元)的资金研究三种高价值的蛋白,即治疗血友病的第二代因子Ⅷ类似物、重组的人血清清蛋白以及抗致病病     

瑞氏木霉表达黑曲霉葡萄糖氧化酶

利用高表达分泌纤维素酶的真菌瑞氏木霉表达重组的黑曲霉葡萄糖氧化酶。在大肠杆菌DH5α中构建瑞氏木霉纤维素酶CBHI启动子和CBHI信号肽基因黑曲霉葡萄糖氧化酶基因瑞氏木霉纤维素酶CBHI终止子构巢曲霉的甘油醛3磷酸脱氢酶启动子大肠杆菌抗潮霉素B磷酸转移酶基因构巢曲霉色氨酸C终止子pUC19(命名为pCBHGOD)质粒,线性化后用瑞氏木霉纤维素酶CBHI启动子和CBHI信号肽基因黑曲霉葡萄糖氧化酶基因瑞氏木霉纤维素酶CBHI终止子构巢曲霉的甘油醛3磷酸脱氢酶启动子大肠杆菌抗潮霉素B磷酸转移酶基因构巢曲霉色氨酸C终止子(命名为CBHGOD)核酸片段转化瑞氏木霉QM9414原生质体。用PCR扩增方法筛选出同源重组葡萄糖氧化酶基因的瑞士木霉突变株。用麦杆诱导瑞氏木霉突变株,生产黑曲霉葡萄糖氧化酶,Westernblot分析重组的葡萄糖氧化酶分子量与Sigma公司的天然黑曲霉葡萄糖氧化酶一致,生产的重组酶活性25umL,相当于Sigma公司葡萄糖氧化酶标准品的产量为0.5gL。瑞氏木霉可用于生产黑曲霉葡萄糖氧化酶。     

固相E.Coli细胞管在L-苏氨酸分析中的应用

具有增进生物降解L-苏氨酸脱氨酶水平丙酮干燥细胞,容易而牢固地用乳胶型—光-交联树脂前聚合物固定于玻璃管内壁。用此微生物细胞管的连续流动系统,证明适合于分析发酵液中的L-苏氨酸或L-丝氨酸,并具有快速(每次分析<9分钟)、底物专-性极好(专-L-苏氨酸或L-丝氨酸)以及经重复分析(至少60次)还非常稳定等特点。本文讨论应用具有L-苏氨酸脱氨酶性的大肠杆菌细胞管对L-苏氨酸进行分光光度计分析。     

用重组大肠杆菌生产的Bt杀虫蛋白

住友化学工业公司宝塚综合研究所使用基因重组大肠杆菌,经24小时培养生产20 g/1的苏云金杆菌杀虫蛋白.该小组曾开发了用大肠杆菌JM103株的基因重组大量生产IP的方法.这次以繁殖速度快而菌体产率高的大肠杆菌K12株为寄主,确立了高效率的TP制造法.这项成果于4月1日在京都召开的日本农艺化学会上发表. 这次生产的是对粉蛾的杀虫效果强但对蚕无毒性的IP(130 kD).如使用基因重组技术,能生产出不含对蚕有害的135kD的IP.但是比医药品附加价值低的农药,应用基因重组