Ag85A真核表达重组体的构建及稳定转染细胞系的建立

构建结核杆菌抗原85A（AgS5A）的真核表达重组体,转染L929细胞,建立稳定转染细胞系。从质粒V1 Jns．tPA—Ag85A中经PCR扩增出Ag85A基因,利用DNA重组技术将其插入到真核表达载体peDNA3．1／myc—HisA中,经酶切和测序鉴定后,脂质体转染法转染L929细胞,通过G418选择培养,建立稳定转染细胞系,Western Blot检测Ag85A的表达。成功构建pcDNA3．1／mye—HisA—Ag85A真核表达载体并稳定转染L929细胞,成功表达了目的基因。为进一步研究Ag85ADNA疫苗对结核杆菌的免疫防护作用奠定了基础。     

人P2X7真核表达载体的构建及稳定转染细胞株的建立

目的：构建人P2X7基因的真核表达载体,并通过转染获得稳定表达P2X7分子的HEK293细胞株。方法：以人脑组织P2X7cDNA为模板扩增出P2X7基因,插入到真核表达载体pEGFP-N1中,构建重组质粒pEGFP-N1/P2X7。用X-fect试剂盒将重组质粒转染HEK293细胞,通过G418辅助荧光筛选建立稳定表达P2X7-EGFP细胞株。经流式细胞仪、Western blot和激光共聚焦显微镜检测,了解人P2X7在HEK293细胞中的表达水平及细胞内定位。结果：重组质粒pEGFP-N1/P2X7构建正确,建立了稳定表达人P2X7的HEK293细胞系。Western blot和流式细胞仪检测证实,P2X7在HEK293细胞系中成功表达,激光共聚焦显微镜检测显示P2X7-EGFP定位在细胞膜上。结论：重组载体pEGFP-N1/P2X7构建成功并建立了稳定表达人P2X7的HEK293细胞系,为进一步研究P2X7离子通道结构和功能奠定基础。     

FKBP12真核表达载体的构建及稳定转染A549细胞株的建立

目的:构建FK506结合蛋白12(FK506 binding proteins 12,FKBP12)真核表达载体并建立稳定转染A549细胞株。方法:RT-PCR扩增人平滑肌细胞FKBP12基因片断,构建pcDNA3.1/Hygro(+)-FKBP12真核表达载体,经琼脂糖电泳、特异性内切酶切割及测序验证其正确性。脂质体法转染真核细胞A549,HygromycinB筛选建立稳定转染的细胞株,免疫印迹法检测稳定转染的细胞株。结果:构建了FKBP12真核表达载体并建立了稳定转染的A549细胞株,成功表达FKBP12蛋白。结论:FKBP12真核表达载体成功构建及稳定转染A549细胞株的建立,为深入研究基于FKBP12靶点药物的机制奠定基础,进而为探索安全、高效的免疫抑制剂提供新的途径。     

hERG shRNA 表达载体构建及其稳定转染骨肉瘤细胞系MG-63、 SOSP-9607 的建立

目的:构建hERG钾离子通道蛋白(human ether-a-go-go-related gene potassium channel)shRNA表达载体质粒,获得稳定转染干扰质粒的人骨肉瘤细胞系MG-63、SOSP-9607。方法:将4对合成的寡核苷酸链退火形成双链,连接入pGPU6/GFP/Neo表达载体,并测序鉴定。使用脂质体法将重组的质粒转染至MG-63、SOSP-9607,通过G418筛选建立稳定转染的两种细胞系,采用免疫印迹(Western blot)技术检测hERG蛋白的表达。结果:测序结果证实shRNA与载体连接正确,免疫印迹实验证实hERG蛋白表达显著降低。结论:成功构建了hERG shRNA真核表达载体,获得了稳定表达hERG shRNA的人骨肉瘤细胞系MG-63和SOSP-9607。     

MIR-122 慢病毒表达载体构建及稳定转染HepG2 细胞系

目的:构建人mir-122慢病毒表达载体,感染肝癌细胞HepG2,建立稳定表达mir-122的HepG2细胞系。方法:以人has-mir-122成熟序列,设计并合成引物,采用PCR的方法扩增目的基因,并连接到慢病毒表达质粒pGCSIL-GFP(含绿色荧光蛋白GFP基因)中。对重组质粒进行双酶切鉴定后,进行mir-122基因慢病毒(pGCSIL-GFP-miR-122)的包装及病毒滴度测定,用构建好的慢病毒表达载体感染HepG2细胞,qPCR检测感染后细胞中MIR-122的变化。通过流式细胞仪检测荧光蛋白GFP,westernblot检测mir-122靶分子CAT-1,验证pGCSIL-GFP-miR-122在HepG2细胞中的表达效果。结果:pGCSIL-GFP-miR-122经双酶切分析及测序,插入序列正确。qPCR检测显示转入病毒后mir-122在细胞中的表达显著提高。表明mir-122慢病毒表达载体构建成功。流式细胞仪根据GFP荧光筛选纯化感染后细胞,感染率达90%以上。Western blot显示mir-122明显抑制其靶分子表达。进一步验证pGCSIL-GFP-miR-122在细胞中的稳定表达。结论:成功构建mir-122慢病毒表达载体,并建立稳定表达的细胞系,为研究mir-122在人体所起的作用及功能机制打下基础。     

MIR-122 慢病毒表达载体构建及稳定转染HepG2 细胞系

目的:构建人mir-122慢病毒表达载体,感染肝癌细胞HepG2,建立稳定表达mir-122的HepG2细胞系。方法:以人has-mir-122成熟序列,设计并合成引物,采用PCR的方法扩增目的基因,并连接到慢病毒表达质粒pGCSIL-GFP(含绿色荧光蛋白GFP基因)中。对重组质粒进行双酶切鉴定后,进行mir-122基因慢病毒(pGCSIL-GFP-miR-122)的包装及病毒滴度测定,用构建好的慢病毒表达载体感染HepG2细胞,qPCR检测感染后细胞中MIR-122的变化。通过流式细胞仪检测荧光蛋白GFP,westernblot检测mir-122靶分子CAT-1,验证pGCSIL-GFP-miR-122在HepG2细胞中的表达效果。结果:pGCSIL-GFP-miR-122经双酶切分析及测序,插入序列正确。qPCR检测显示转入病毒后mir-122在细胞中的表达显著提高。表明mir-122慢病毒表达载体构建成功。流式细胞仪根据GFP荧光筛选纯化感染后细胞,感染率达90%以上。Western blot显示mir-122明显抑制其靶分子表达。进一步验证pGCSIL-GFP-miR-122在细胞中的稳定表达。结论:成功构建mir-122慢病毒表达载体,并建立稳定表达的细胞系,为研究mir-122在人体所起的作用及功能机制打下基础。     

CRMP-1真核表达载体的构建及其突起生长抑制作用

为研究坍塌反应调节蛋白-1(collapsin response mediator protein-1,CRMP-1对神经元突起生长的作用,构建了CRMP-1真核表达载体,以神经生长因子(NGF)诱导的PC12细胞为模型,采用基因转染、突起生长时差成像、突起提取和免疫印迹技术进行观察.结果显示,NGF诱导的PC12细胞具有典型的神经元形态特征,脂质体转染技术可成功地把CRMP-1基因导入细胞.过表达CRMP-1可明显抑制突起生长,促进突起坍塌,首先是细小突起缩短,然后是长突起,细胞突起的长度随CRMP-1蛋白表达时间延长呈逐渐缩短的趋势.突起提取液的测定显示,CRMP-1过表达的细胞较NGF诱导的和转染空载体的细胞突起明显减少(P<0.01.说明CRMP-1具有明显的突起生长抑制作用.     

线虫Fat-1基因密码子的优化及其真核表达载体构建

目的:为使线虫Fat-1基因能够在牛中高效表达,通过密码子优化及全基因合成方法制备Fat-1基因,并构建其转基因表达载体。方法:通过生物信息学手段,将来源于线虫的Fat-1基因以牛为表达宿主进行密码子优化,将优化后的Fat-1基因命名为bFat-1;通过全基因合成方法获得bFat-1基因,构建pcDNA3.1-bFat-1真核表达载体。结果:通过密码子优化,影响Fat-1基因在牛中表达的密码子适应指数、优势密码子频率及GC含量等各项指标均有显著改善;全基因合成、克隆及测序结果显示已获得bFat-1基因;构建并鉴定了pcDNA3.1-bFat-1载体。结论:获得了适合牛体表达的Fat-1基因并构建了其转基因载体,为获得高效表达Fat-1基因的转基因牛细胞系奠定了基础。     

p16真核表达载体的构建及其稳定表达的NIH3T3细胞株的建立

目的　构建pCR○R3 1 p16真核表达质粒 ,并建立其稳定表达的NIH3T3细胞株。方法　将人的p16cDNA亚克隆至pCR○R3 1,将该重组质粒转化DH5α感受态大肠埃希菌 ,筛选阳性克隆 ,进行EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定及DNA测序 ,将已鉴定的pCR○R3 1 p16经脂质体介导转染至NIH3T3细胞中。结果　重组质粒双酶切后 ,出现约 80 0bp片段 ,提示p16cDNA片断已插入pCR○R3 1多克隆位点内 ,DNA测序显示p16cDNA按照正确方向和阅读框插入表达载体pCR○R3 1。通过pCR○R3 1 p16转染NIH3T3细胞 ,获得 10个G4 18抗性克隆 ,其中 2个为RT PCR阳性。结论　成功构建pCR○R3 1 p16真核表达载体并建立了其稳定表达的NIH3T3细胞株。为建立p16转基因鼠奠定基础。     

尘螨变应原Derf1真核表达载体的构建及转染CHO细胞

目的：构建尘螨变应原Der f1真核表达载体,转染真核细胞并进行蛋白表达。方法：根据Genebank中Der f1基因的核酸序列（AB034946）,设计引物,采用PCR法,从保存的JM109工程菌中扩增Der f1编码基因,克隆到真核表达质粒pcDNA3.1/myc-his A上,以脂质体法转染CHO细胞,经G418筛选,进行稳定表达细胞株的筛选和鉴定。结果：将目的基因Der f1成功连接到pcDNA3.1/myc-hisA-Derf1并转染CHO细胞,获得稳定表达的CHO细胞株。结论：成功构建了尘螨变应原Der f1真核表达载体,并转染CHO细胞表达蛋白质。     

shRNA沉默CBS基因的慢病毒载体构建及稳定转染PC12细胞系的建立

目的:硫化氢是一种重要的气体信号分子,作为一种神经调质在神经系统中起重要作用。胱硫醚-β-合成酶(CBS)是脑内硫化氢合成的主要酶。构建针对大鼠CBS基因的shRNA干扰载体,稳定转染PC12细胞,观察该载体对PC12细胞CBS基因的沉默效应。方法:构建三条针对大鼠CBS基因的shRNA,经前期实验筛序一条最有效靶点与载体GV248(h U6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin)连接,经转化及PCR阳性克隆筛选及测序鉴定。将LV-CBS-ShRNA慢病毒载体连同包装载体经脂质体2 000共转染到293T细胞,慢病毒包装后用荧光法进行滴度测定。将包装好的慢病毒转染到PC12细胞,用嘌呤霉素进行筛选,得到稳定转染LV-CBS ShRNA的PC12细胞。实时荧光定量PCR检测CBSmRNA的表达,Western-blot检测CBS蛋白的表达。结果:PCR扩增和测序结果证明,成功构建大鼠LV-CBS ShRNA慢病毒载体,经包装产生的慢病毒滴度为1×109TU/m L。与转染阴性对照慢病毒(LV-NC-ShRNA)的细胞比较,LV-CBS ShRNA慢病毒转染可使PC12的CBSmRNA和CBS蛋白表达分别下降51.2%和48%。成功构建CBS基因ShRNA干扰的PC12细胞株,为后续研究CBS在神经系统中的作用奠定基础。     

稳定表达人Eps8基因的胶质瘤U251细胞系的建立

应用亚克隆方法构建pEGFP-C3／Eps8真核表达载体,经测序鉴定后,用脂质体进行胶质瘤U251细胞的转染,应用G418筛选出稳定表达pEGFP-C3／Eps8和pEGFP—C3的细胞系,最后通过Western blot和荧光定位证明印娼在U251细胞中过量表达。本实验成功建立了稳定转染Eps8的U251细胞系,为进一步研究Eps8基因在胶质瘤中的功能奠定了良好的实验基础。     

小鼠pEGFP-Hoxa11真核表达载体的构建及表达

目的 构建和鉴定Hoxa11和EGFP双基因共表达真核载体.方法 采用DNA重组技术,将目的 基因Hoxa11克隆至含有报告基因EGFP的pEGFP-N1真核表达载体中,构建的真核表达载体pEGFP-Hoxa11经PCR,双酶切及基因测序鉴定;转染至CHO细胞,荧光显微镜下观察重组质粒的表达,提取细胞蛋白Western印迹检测蛋白表达.结果 pEGFP-Hoxa11重组质粒构建成功.构建的真核表达载体pEGFP-Hoxa11能在CHO细胞中有效表达.结论 成功构建了共表达Hoxa11和EGFP的真核表达载体,并能在CHO细胞中有效表达.为进一步研究Hoxa11的功能提供实验基础.     

真核表达载体pcDNA3.1(-)+KG的构建及在HeLa细胞中的表达

为了将绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)引入细胞核内,采用两轮PCR方法从原先克隆在pcD-NA3.1(-)+GFP载体中将GFP编码序列扩增出来并引入Kozak序列和核定位信号,使用常规酶切和连接方法将其重组至pUCm-T克隆载体中,再将目的片段重组至pcDNA3.1(-)中,对阳性克隆进行酶切、PCR和测序鉴定后,构建了带有Kozak序列和核定位信号的绿色荧光蛋白(GFP)真核表达载体pcDNA3.1(-)+KG。真核表达载体pcDNA3.1(-)+KG被转染试剂Su-perfect转染至HeLa细胞中,绿色荧光蛋白基因在HeLa细胞中得到表达而且在细胞核中观察到绿色荧光。该研究以绿色荧光蛋白为标记初步建立了活体观察真核细胞核动态变化的研究体系。     

AQP1真核表达载体的构建及其在FRT细胞的表达

目的：构建小鼠AQP1基因真核表达质粒并观察其在FRT细胞中的表达。方法：采用RT—PCR方法从小鼠肾脏组织的总cDNA中扩增出小鼠的AQP1基因,采用基因重组技术将AQP1的cDNA片段插入真核表达载体pCAGGS,构建小鼠AQP1的真核表达质粒,脂质体转染FRT细胞进行表达。结果：酶切和测序结果证实AQP1真核表达质粒构建成功,经脂质体转染FRT细胞后,免疫荧光检测证明AQPI蛋白在真核细胞中成功表达。结论：成功构建真核表达质粒pCAGGS—AQP1-myc,并在FRT细胞中得以表达。为进一步研究小鼠AQP1过表达时的功能及机制奠定了实验基础。     

基因枪介导真核表达质粒转染体外培养的COS-7细胞系的实验研究

目的：建立基因枪子弹制备及转染体外培养COS-7细胞系的方法。方法：以亚精氨、氯化钙沉淀法制备子弹（DNA＋金颗粒）,利用原子力显微镜观察子弹制备情况;采用基因枪方法分别将真核表达质粒pVax-Dsred-IRES-EGFP转染对照组和实验组COS-7细胞,转染后24h,利用激光扫描共聚焦显微镜观察细胞中红、绿荧光蛋白的表达。结果：制备了基因枪子弹,DNA紧密包裹在金颗粒周围;基因枪介导的pVax-Dsred-IRES-EGFP被转染入体外培养的COS-7细胞,转染后24h可检测到红、绿荧光,而对照组则没有荧光蛋白的表达。结论：国产新芝SJ-500型基因枪能够有效介导外源基因转移,基因枪转染的COS-7细胞能够有效表达报告基因。     

表达人去唾液酸糖蛋白受体分子细胞系的建立

目的构建稳定表达人肝细胞表面分子去唾液酸糖蛋白受体（asialoglycoprotein receptor,ASGPR）的细胞系。方法逆转录PCR扩增人肝组织ASGPR大亚基H1全编码序列,插入到真核表达载体plRES2EGFP中,重组质粒pIRES2EGFP／ASGPRH1转染HeLa细胞,G418筛选,RT—PCR,Western印迹及免疫荧光检测ASGPRH1的表达。结果成功构建了pIRES2EGFP／ASGPRH1重组质粒,该质粒转染HeLa细胞后,Western印迹及免疫荧光均检测到ASGPRHI蛋白的表达。结论成功建立了稳定表达人ASGPRH1的细胞系,为进一步研究ASGPR分子奠定了基础。     

猪GM-CSF基因的克隆及其真核表达载体的构建

采用PCR方法从猪外周血液淋巴细胞cDNA中扩增出与预期设计大小相符的GM-CSF基因特异性条带,PCR产物经EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后,插入到载体pIRES2-EGFP构建成真核表达载体pIRES2-EGFP-GM-CSF.经PCR鉴定、限制性内切酶酶切分析和克隆片段序列测定、比较,证实了重组质粒的正确性.将构建好的真核表达质粒转染到山羊胎儿成纤维细胞中进行瞬时表达,荧光检测证实细胞转染成功.pIRES2-EGFP-pGM-CSF真核表达载体的成功构建为下一步在细胞水平研究GM-CSF蛋白功能以及进一步将其开发为高档疫苗佐方剂奠定了基础.