Prdx Ⅴ在链脲佐菌霉素诱导MIN6细胞凋亡过程中的调控作用

Prdx Ⅴ(peroxiredoxin Ⅴ)是过氧化物还原酶家族中一员,可有效地保护细胞免受氧化应激造成的氧化损伤。该文主要阐明了链脲佐菌霉素(streptozotocin,STZ)诱导MIN6小鼠胰岛瘤细胞凋亡的分子机制及Prdx Ⅴ在这一过程中的调控作用。该研究利用STZ处理MIN6小鼠胰岛瘤细胞,通过MTT法、荧光显微镜照相、流式细胞术、蛋白质免疫印迹分析等方法检测细胞存活率、细胞内活性氧类(reactive oxygen species,ROS)及细胞凋亡水平、一氧化氮(nitric oxide,NO)含量、凋亡相关蛋白质及相关信号通路蛋白质水平。结果表明,STZ主要通过激活p38信号通路调控NO的生成,引起MIN6细胞发生凋亡,而与细胞内增加的ROS无内在联系。与此同时,STZ可致使细胞内Prdx Ⅴ蛋白质水平明显上升,当Prdx Ⅴ基因沉默之后,发现STZ诱导的Prdx Ⅴ缺失型MIN6细胞凋亡率明显高于对照组,提示Prdx Ⅴ对STZ诱导MIN6细胞凋亡过程具有一定的调控作用。该研究结果揭示了STZ诱导MIN6细胞凋亡分子机制,同时初步探析了Prdx Ⅴ对STZ引起MIN6胰岛细胞凋亡的调控作用,为研究氧化应激引起胰岛细胞损伤及死亡机制提供了一定的理论基础。     

高糖通过下调FoxO1磷酸化诱导β细胞去分化

胰岛β细胞发生去分化现象是导致其功能减退的机制之一。已有研究证明,FoxO1与β细胞去分化密切相关。然而,高糖是否可通过FoxO1诱导β细胞发生去分化目前尚未见报告。本研究通过不同浓度高糖干预MIN6细胞,采用葡萄糖刺激胰岛素分泌试验（GSIS）检测β细胞功能|实时荧光定量PCR及蛋白免疫印迹、免疫荧光方法检测高糖干预后β细胞内祖细胞标志基因、β细胞标志基因及FoxO1的表达变化。结果显示,不同浓度高糖干预β细胞后,当浓度达到35 mmol/L时,β细胞祖细胞标志基因表达明显增加。且在该浓度时,检测到β细胞标志基因表达明显降低,MIN6细胞葡萄糖刺激胰岛素分泌功能减退,磷酸化FoxO1表达减少。上述结果提示,高糖可诱导胰岛β细胞去分化的发生,其机制可能是通过FoxO1介导。     

亚砷酸钠对胰岛β细胞的Nrf2及其调控的抗氧化酶表达的影响

目的检测亚砷酸钠对小鼠胰岛B细胞的核转录因子Nrf2及其调控的抗氧化酶硫氧还蛋白（Srx）,y-谷氨酰半胱氨酸连接酶催化亚基（Gele）表达的影响。方法应用2、4、6、8、10t2mol／L亚砷酸钠（NaAs02）作用MIN6细胞6h,通过WesternBlot检测Nrf2蛋白表达;利用Real—timePCR检测抗氧化酶Srx、Oclc的mRNA表达。结果4／μmol／L亚砷酸钠染毒6h后,Nrf2的蛋白表达显著增高,并随着亚砷酸钠剂量的增大,Nrf2蛋白表达也随之增多。抗氧化酶Srx、GelcmRNA在2μmol／L亚砷酸钠染毒6h后开始出现明显的诱导表达,并随亚砷酸钠剂量的增加而表达增强。结论亚砷酸钠能诱导小鼠胰岛B细胞Nrf2蛋白及其调控的抗氧化酶Srx和Gclc基因的表达,并存在显著地剂量依赖性。     

FoxO1在胰岛β细胞代谢灵活性受损及失代偿进程中的作用

葡萄糖及脂肪酸是胰岛β细胞的关键代谢底物,葡萄糖刺激胰岛β细胞分泌胰岛素是维持机体血糖稳态平衡的关键。胰岛素抵抗发生时,β细胞对能量代谢底物的选择失调,加速胰岛β细胞由代偿到胰岛β细胞失代偿的进程,是肥胖胰岛素抵抗最终发展为2型糖尿病的始动因素。核转录因子FoxO1属于Fox家族成员,在胰腺内广泛表达,在β细胞的代谢,发育,增殖过程中发挥着重要的调节作用。鉴于FoxO1在维持胰岛β细胞功能中的关键作用,现着重对FoxO1在胰岛β细胞代谢灵活性受损及失代偿过程发生中的作用调节进行阐述。为其作为调控胰岛β细胞功能的关键靶点提供参考。     

阿托伐他汀抑制PI3K/AKT/FoxO1通路及高糖诱导的足细胞增殖、凋亡及氧化应激损伤

目的 基于磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/转录因子叉头框转录因子O亚族1(PI3K/AKT/FoxO1)通路研究阿托伐他汀对高糖诱导的足细胞增殖、凋亡、迁移、炎症因子[肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素（IL）-6]及氧化因子超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）水平的影响。方法 体外培养人肾小球足细胞HGPC,分为对照组、高糖组、阿托伐他汀组、PI3K/AKT/FoxO1信号通路抑制剂组、阿托伐他汀+抑制剂组及阿托伐他汀+PI3K/AKT/FoxO1信号通路激活剂组。分别测定细胞增殖、凋亡、迁移能力、炎症因子（TNF-α、IL-6）水平、氧化因子（SOD、MDA）水平及PI3K/AKT/FoxO1信号通路相关蛋白表达水平。结果 10μmol/L阿托伐他汀为干预细胞活力的最佳浓度。高糖组细胞增殖率、SOD水平降低,凋亡率、迁移率、TNF-α、IL-6、MDA水平、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT和p-FoxO1/FoxO1比值升高;阿托伐他汀组和抑制剂组细胞增殖率、SOD水平升高,凋亡率、迁移率、TNF-α、IL-6、MDA水平、p-PI3K/PI3K、p-AKT/A...     

20E诱导家蚕抗菌肽CecropinB6的上调表达

蜕皮激素(20-hydroxyecdysone, 20E)是调控昆虫发育的重要激素,在昆虫的蜕皮和变态中起关键作用。近年来的研究表明,20E也调控昆虫抗菌肽的表达,揭示昆虫的发育和免疫之间具有重要的联系。家蚕是重要的经济昆虫,家蚕抗菌肽对蜕皮激素(20E)的应答及其调控机制仍有待研究。本文利用20E注射家蚕5龄第3天幼虫,qRT-PCR结果表明20E处理的脂肪体中抗菌肽CecropinB6基因(BmCecB6)的表达上调。通过对抗菌肽BmCecB6上游启动子的截短和双荧光素酶活性分析,结果显示BmCecB6响应20E的调控位点在启动子-448～-170区域,该区域内存在潜在的FoxO、E74A和BR-C等结合位点。本研究表明20E抑制了ILS通路水平,暗示ILS下游的转录因子FoxO被激活。进一步对BmCecB6的启动子进行FoxO结合位点的缺失突变,双荧光素酶检测结果表明20E对BmCecB6的诱导活性并没有丧失,推测BmCecB6对20E的应答不是通过转录因子FoxO结合BmCecB6启动子中的顺式调控元件直接调控的。20E激活BmCecB6表达的分子调控机制还需要进一步深入研究。     

D-柠檬烯对衣霉素诱导的胰腺MIN6细胞损伤的保护作用

本研究主要探讨D-柠檬烯对衣霉素(Tm)诱导胰腺MIN6细胞损伤的保护作用。设置溶剂对照组、Tm组、4-苯基丁酸(PBA)组和不同浓度的D-柠檬烯组,用Griess试剂检测Tm刺激胰岛β细胞产生的NO水平;Annexin V-FITC/PI双染法流式检测细胞凋亡; RT-PCR法检测mRNA的表达水平; Western Blot法检测相关蛋白的表达。结果显示,D-柠檬烯组与Tm组相比,NO产生量减少、细胞凋亡率降低、内质网应激相关基因sXbp1和CHOP的mRNA表达量显著降低、p-eIF2α的蛋白表达量显著下降。结果表明D-柠檬烯对衣霉素(Tm)诱导的胰腺MIN6细胞损伤具有显著的保护作用。     

乳腺癌细胞中人血小板衍生生长因子受体β启动子的基础活性研究

目的:探讨低迁移表型的乳腺癌细胞MCF-7和高迁移表型的乳腺癌细胞MDA-MB-231中血小板衍生生长因子β启动子的基础活性及转录调控差异。方法:Real-Time PCR,Weastern blot等技术检测PDGFRβ在2株细胞中的转录和表达差异。双荧光报告系统检测PDGFRβ启动子各缺失突变片段在2株细胞中的活性,筛选差异片段。生物信息学预测启动子区可能存在的转录因子。凝胶迁移实验研究转录因子在两株乳腺癌细胞中对PDGFRβ启动子的调节活性。结果:两株细胞中都有PDGFRβ的内源性表达,且在MDA-MB-231中表达较高。在2株细胞中找到了人PDGFRB 启动子的重要活性调节区,(+539bp,+1457bp)在2株细胞中均呈负调控,(+54bp,+539bp)在两株细胞中均呈正调控,(-983bp,+54bp)在MDA-MB-231中呈显著正调控,在MCF-7中没有活性。转录因子AP1的转录活性和与DNA的结合活性在MDA-MB-231中均高于MCF-7。结论:不同迁移表型的乳腺癌细胞中PDGFRβ存在不同的表达调控机制,PDGFRβ启动子活性片段(-983bp,+54bp)在两株细胞中存在显著活性差异。转录因子AP-1在两株细胞中有表达水平和结合活性差异。     

胰岛因子1在胰腺中的转录调控机制CSCD

胰岛因子1(ISL1)是重要的转录因子,在胚胎发育期广泛分布于全身多种组织细胞,而在成体组织中主要表达于胰岛和神经组织。在胰腺中,ISL1主要调控胰岛素、胰高血糖素、生长抑素、胰多肽等内分泌激素的表达,在胚胎期促进胰腺背侧间充质细胞和胰岛内分泌细胞的分化、发育、成熟,在出生后通过抑制细胞凋亡、促进细胞增殖来维持胰岛β细胞数量的稳态。ISL1通过与基因启动子上的特定元件TAAT/ATTA结合,并与其它蛋白质相互作用,实现对下游靶基因的转录调控,以完成多种生理功能。     

胰岛因子1在胰腺中的转录调控机制

胰岛因子1(ISL1)是重要的转录因子,在胚胎发育期广泛分布于全身多种组织细胞,而在成体组织中主要表达于胰岛和神经组织。在胰腺中,ISL1主要调控胰岛素、胰高血糖素、生长抑素、胰多肽等内分泌激素的表达,在胚胎期促进胰腺背侧间充质细胞和胰岛内分泌细胞的分化、发育、成熟,在出生后通过抑制细胞凋亡、促进细胞增殖来维持胰岛β细胞数量的稳态。ISL1通过与基因启动子上的特定元件TAAT/ATTA结合,并与其它蛋白质相互作用,实现对下游靶基因的转录调控,以完成多种生理功能。     

Mip1对大鼠心肌细胞凋亡基因Bid转录调控作用的初探

目的:研究转录因子Mip1对大鼠心肌细胞H9C2凋亡相关基因Bid的转录调控作用.方法:以H9C2细胞基因组DNA为模板,扩增Bid核心启动子片段,将其克隆入荧光素酶报告基因质粒PGL3-Basic中,构建重组载体,并采用双酶切法、PCR法及基因测序对其进行鉴定.用脂质体转染法将该载体转入Mip1不同程度过表达的H9C2细胞,检测该细胞Bid基因启动子区的转录活性.结果:成功克隆Bid基因启动子区,双酶切、PCR和基因测序均显示PGL3-Basic-Bid promoter重组载体构建成功.荧光素酶相对活性检测显示在H9C2细胞中,随着Mip1转入的增多,Bid启动子区转录活性逐渐下降.结论:Mip1作为一个新的转录抑制因子,可以下调凋亡基因Bid的转录.     

lncRNA TUG1在胰岛β细胞分泌胰岛素中的功能研究

目的:关于lncRNA TUG1在体内外胰岛β细胞分泌胰岛素中的功能研究。方法:通过qRT-PCR检测lncRNA TUG1在小鼠胰腺,脑,肌肉等不同组织的表达。体外干扰MIN6胰岛素瘤细胞系lncRNA TUG1后,通过MTT法和流式细胞计数检测对β细胞增殖和周期影响;通过GSIS检测β细胞不同糖浓度刺激下的胰岛素分泌水平;采用qRT-PCR检测β细胞Insulin及相关特异转录因子Pdx1,Maf A,Neuro D,Glut2的变化;外源性封闭正常成年小鼠中lncRNA TUG1的表达后,采用ELISA法检测对血清胰岛素的影响,采用免疫组化检测对胰岛形态的影响。结果:lncRNA TUG1在胰腺组织中高度表达。干扰lncRNA TUG1后可致β细胞增殖活力受到抑制,糖刺激下的胰岛素分泌水平下降,Insulin及相关特异转录因子Pdx1,Maf A,Neuro D,Glut2减少;外源性封闭正常成年小鼠中lncRNA TUG1的表达后,血清胰岛素减少,胰岛面积减小。结论:干扰lncRNA TUG1后在体内外均可导致胰腺β细胞分泌胰岛素减少,提示lncRNA TUG1可在体内外影响β细胞的胰岛素分泌,lncRNA TUG1是调节胰岛β细胞功能的因素之一。     

p21WAF1在丁酸钠诱导的人成纤维细胞凋亡中的表现

用丁酸钠（NaBu）诱导了人胚肺二倍体成纤维细胞凋亡（2BS）,检测其诱导过程中凋亡相关基因的表达变化,结果表明,p21^WAF1的表达在凋亡发生前即有明显下降,并持续至凋亡发生时, bcl-2的表达仅在凋亡发生时有所下降,c-myc和c-fos的表达有所上升,而p53和HER-2的表达无明显变化.用稳定转染了不同长度p21^WAF1启动子片段和下游绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的2BS-WP系列细胞进一步研究发现,其GFP的表达水平在NaBu诱导过程中下降,主要调控区域为p21^WAF1启动子的TATA box上游0～－800 bp.说明NaBu诱导的人胚肺二倍体成纤维细胞凋亡与p21^WAF1启动子的转录活性下降与密切相关,并且可能不依赖于p53.     

鼻病毒非结构蛋白2B 诱导细胞发生内质网应激

为探讨鼻病毒非结构蛋白2B诱导内质网应激和细胞凋亡的机制,本研究构建了鼻病毒非结构蛋白2B的真核表达载体p2B‐GFP ,通过转染BHK‐21细胞检测相关标志蛋白的变化情况。结果显示,非结构蛋白2B定位表达于BHK‐21细胞内质网,诱导内质网应激标志蛋白Grp78、CHOP的表达增加,并使活化转录因子6（ATF6）的转录活性增加,还诱导BHK‐21细胞发生核浓缩而凋亡,使凋亡标志蛋白PARP发生降解而减少。结果提示,鼻病毒非结构蛋白2B可诱导细胞发生内质网应激,并经该途径诱导细胞凋亡。     

p21WAF1在丁酸钠诱导的人成纤维细胞凋亡中的表现

用丁酸钠 (NaBu)诱导了人胚肺二倍体成纤维细胞凋亡 (2BS) ,检测其诱导过程中凋亡相关基因的表达变化 ,结果表明 ,p2 1WAF1的表达在凋亡发生前即有明显下降 ,并持续至凋亡发生时 ,bcl 2的表达仅在凋亡发生时有所下降 ,c myc和c fos的表达有所上升 ,而 p5 3和HER 2的表达无明显变化 .用稳定转染了不同长度p2 1WAF1启动子片段和下游绿色荧光蛋白 (GFP)报告基因的 2BS WP系列细胞进一步研究发现 ,其GFP的表达水平在NaBu诱导过程中下降 ,主要调控区域为 p2 1WAF1启动子的TATAbox上游 0～ - 80 0bp .说明NaBu诱导的人胚肺二倍体成纤维细胞凋亡与p2 1WAF1启动子的转录活性下降与密切相关 ,并且可能不依赖于p5 3.     

EB病毒潜伏膜蛋白1在鼻咽癌细胞中通过STAT3促进VEGF表达

探讨了EB病毒编码的潜伏膜蛋白1(LMP1)是否通过STAT3调控诱导血管内皮细胞生长因子(VEGF)的表达.利用蛋白质印迹的方法对HNE2、HNE2-LMP1以及瞬时转染STAT3显性负性突变体STAT3β的HNE2-LMP1细胞中VEGF含量进行检测,发现LMP1可以上调VEGF的表达,而STAT3β可以抑制VEGF的上调;利用LMP1可控表达细胞系tet-on-LMP1-HNE2进行LMP1时间和剂量诱导表达研究,发现VEGF可以随LMP1的动态表达而表达;将VEGF野生型报告基因和VEGF潜在的STAT3转录因子突变体报告基因与LMP1表达载体分别共转染研究发现,LMP1可以激活VEGF的转录,这种转录通过VEGF启动子区STAT3转录因子的结合位点发挥作用;电泳迁移率变动分析(EMSA)确证了STAT3的这种DNA位点的特异性活性.结果表明：EB病毒编码的LMP1 在鼻咽癌细胞中可以增加VEGF的转录和表达,并能通过VEGF启动子区STAT3转录因子结合位点发挥作用.     

乙型肝炎病毒上调的lnc-HUR1抑制肝癌细胞凋亡北大核心CSCD

Lnc-HUR1是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)上调的长链非编码RNA,具有促进肝癌细胞增殖和促进肝癌发生发展的功能。为探究lnc-HUR1对肝癌细胞凋亡的影响,通过免疫印迹、实时荧光定量PCR、双荧光素酶报告基因、免疫共沉淀、流式细胞术等实验方法,检测lnc-HUR1对肝癌细胞凋亡的影响。转化生长因子-β(tansforming growth factor-β,TGF-β)、五氟尿嘧啶和星孢菌素诱导肝癌细胞凋亡的实验结果显示,过表达lnc-HUR1能够显著降低caspase3/7的活性以及PARP-1的剪切,而敲低lnc-HUR1则能够显著增加caspase3/7的活性,促进PARP-1的剪切;Annexin-Ⅴ和PI联合染色实验也表明过表达lnc-HUR1能够抑制细胞凋亡,敲低lnc-HUR1能够促进细胞的凋亡。同时过表达lnc-HUR1能够在RNA水平和蛋白水平上调凋亡抑制因子Bcl-2(B cell lymphoma-2)、下调促凋亡因子BAX(B cell lymphoma-2-associated x),从而抑制细胞的凋亡。在CCL4诱导的小鼠急性肝损伤模型中,lnc-HUR1转基因小鼠肝组织中Bcl-2的表达高于对照小鼠。染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)实验也证实lnc-HUR1能够降低p53在Bcl-2和BAX启动子区的富集。以上结果说明,lnc-HUR1通过促进凋亡抑制因子Bcl-2及抑制凋亡促进因子BAX的表达抑制肝癌细胞的凋亡。进一步的实验表明,在HCT116细胞中lnc-HUR1能够调控Bcl-2和BAX的转录,而在HCT116 p53−/−细胞中,lnc-HUR1对Bcl-2和BAX的表达没有影响,说明lnc-HUR1对肝癌细胞凋亡的抑制作用依赖于p53的活性。综上所述,HBV上调的lnc-HUR1具有抑制肝癌细胞凋亡的作用,lnc-HUR1通过抑制p53转录活性,上调凋亡抑制因子Bcl-2、抑制凋亡促进因子BAX的转录,从而抑制细胞凋亡。上述结果提示Lnc-HUR1在HBV相关肝癌发生发展中发挥重要作用。     

过表达MicroRNA-199a促进TNFα诱导的脂肪细胞凋亡

旨为探明micro RNA-199a(mi R-199a)对脂肪细胞凋亡的影响及核转录因子κB(nuclear factorκB,NF-κB)在其中的作用。培养3T3-L1脂肪细胞,使用肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNFα)诱导细胞凋亡。在此基础上分别使用NF-κB阻断剂PDTC和mi R-199a mimic处理细胞,判断过表达mi R-199a对TNFα诱导的脂肪细胞凋亡的影响及NF-κB在其中的作用。使用流式细胞仪分析细胞凋亡率,试剂盒检测Caspase3/7酶活,双荧光素酶报告系统检测NF-κB活性,q RT-PCR检测mi R-199a的表达水平,Western blotting检测NF-κB相关蛋白变化。结果显示,TNFα可以诱导分化的脂肪细胞凋亡并同时激活NF-κB,激活的NF-κB在TNFα诱导的脂肪细胞凋亡中发挥负调控作用。在脂肪细胞过表达mi R-199a明显抑制NF-κB的激活进而显著促进TNFα诱导的凋亡。mi R-199a通过调控NF-κB活性参与TNFα诱导的脂肪细胞凋亡。