在DH5α中拼接构建ADAM10全长真核表达载体的基因突变

目的:构建ADAMI0真核表达载体,为进一步研究其生物学功能打基础.方法:将人ADAM10的上下两部分基因片段(分别为全长基因的1 ～910bp和911 ～2 247bp片段),依次与真核表达载体pcDNA3.1相连,以大肠杆菌DH5α或BL21(DB)作为感受态宿主菌用于转化连接产物,拼接成全长的阳性克隆通过PCR、酶切和测序鉴定.结果:ADAM10下段基因与已正确连入上段的pcDNA3.1重组质粒拼接时,若用DH5α为感受态菌,则下半段出现碱基插入增加512bp,测序结果显示为ADAM10基因第1 531 bp～2 042 bp间的序列有紧邻的双份;若用BL21(DE3)为感受态,则无突变.结论:将ADAM10基因与pcDNA3.1真核表达载体依次拼接构建重组质粒时,以DH5α为宿主菌可出现基因序列增加的罕见突变,而以BL21(DE3)为宿主则无突变,由此成功构建ADAM10全长基因与pcDNA3.1的重组质粒.     

中国春小麦puroindoline a基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的:puroindoline(pin)基因在控制麦类作物的籽粒硬度中起着重要作用。构建真核表达载体pcDNA3.1( )-pina-gfp,为pina基因在哺乳细胞中的表达提供基础。方法:利用PCR方法从中国春小麦基因组中克隆到了pina基因,将其插入真核表达载体pcDNA3.1( )-gfp,用PCR和酶切鉴定重组子。结果:PCR和酶切鉴定表明,所构建的真核表达重组质粒为pcDNA3.1( )-pina-gfp;将该片段克隆到pCF-T载体中,经测序验证,表明其为目的基因。结论:构建的pina基因真核表达载体pcDNA3.1( )-pina-gfp为pina基因在哺乳动物细胞中的表达提供了基础。     

人尿激酶型纤溶酶原激活因子截短型突变体与绿色荧光蛋白在真核细胞HEK293F中的融合表达

目的:构建人尿激酶型纤溶酶原激活因子(uPA)截短型突变体与绿色荧光蛋白(EGFP)分泌型融合表达载体并在真核细胞中表达。方法:采用PCR法,分别以质粒pIRES2-EGFP和重组质粒pcDNA3.1(+)/uPA为模板,扩增出带BamHⅠ和XbaⅠ酶切位点的EGFP及带NheⅠ和HindⅢ酶切位点的uPA截短体基因片段,先后将EGFP和截短型uPA基因片段克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)上,转入HEK293F细胞,用G418对转染细胞进行加压筛选,通过共聚焦显微镜观察和ELISA方法鉴定表达产物。结果:DNA测序结果显示,uPA不同截短型突变体基因片段与EGFP基因融合的真核表达载体构建成功,共聚焦显微镜观察发现HEK293F细胞中有绿色荧光且定位于细胞质中,ELISA检测到HEK293F细胞培养上清中分泌型融合蛋白的表达。结论:构建了uPA截短型突变体与EGFP分泌型融合表达载体并在真核细胞中表达,为后期研究uPA的相互作用蛋白及其生理功能奠定了基础。     

grp78真核表达载体构建及其稳定转染HeLa细胞系建立

目的构建人grp78基因真核表达载体,并建立稳定高表达grp78的人宫颈癌HeLa细胞系。方法用RT—PCR方法从人宫颈癌HeLa细胞中扩增grp78基因编码区,将PCR产物克隆到pcDNA3．1（＋）真核表达载体,构建重组质粒pcDNA3．1（＋）／grp78并测序鉴定。用构建成功的pcDNA3．1（＋）／grp78真核表达载体转染入人宫颈癌HeLa细胞,经G418筛选获得grp78稳定高表达的HeLa细胞系,并用RT—PCR及Western印迹方法鉴定。结果成功构建pcDNA3．1（＋）／grp78真核表达载体,筛选获得稳定高表达人grp78的HeLa细胞系。结论grp78真核表达载体的成功构建和稳定高表达grpTS的HeLa细胞系的建立为进一步研究grp78的功能奠定了基础。     

pcDNA3.1（＋）-LYVE-1真核表达质粒的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的 构建人淋巴管内皮细胞特异标志物LYVE-1融合基因表达质粒,观察其在COS-7细胞中的表达,为进一步探讨该标志物在肿瘤淋巴转移中的作用提供工具.方法 从本院结肠癌根治术患者术所取组织中的淋巴结抽提总RNA,RT-PCR扩增LYVE-1基因片段,并将其插入pMD19-T Simple Vector进行测序,鉴定正确后构建pcDNA3.1（＋）-LYVE-1并转染COS-7细胞,RT-PCR、Western印迹检测目的 蛋白表达,间接免疫荧光检测该基因表达在COS-7细胞上.结果 成功获取了人淋巴管内皮细胞特异标志物LYVE-1全长cDNA,构建了其真核表达载体pcDNA3.1（＋）-LYVE-1,转染COS-7细胞后检测出目的 蛋白的表达,并且证明该基因表达在细胞上.结论 成功构建了pcDNA3.1（＋）-LYVE-1重组质粒,为进一步研究LYVE-1在肿瘤淋巴管转移中的功能提供了重要的实验材料.     

人同源盒基因NKX3.1对前列腺癌细胞的诱导凋亡作用

构建人同源盒基因NKX3.1 cDNA真核表达载体,研究其在前列腺癌细胞PC-3、LNCaP 中的表达及对细胞的促凋亡作用.以人前列腺癌细胞LNCaP细胞中的总RNA为模板,RT-PCR扩增NKX3.1基因全长编码片段,将NKX3.1 cDNA重组到真核表达载体pcDNA3.1（+）中; 将pcDNA3.1-NKX3.1表达载体瞬时转染前列腺癌细胞PC-3和LNCaP 细胞,用RT-PCR和Western印迹检测NKX3.1 cDNA在转录水平和蛋白水平的表达;绘制细胞生长曲线,观察NKX3.1对前列腺癌细胞增殖的抑制作用;用DNA/ladder和流式细胞术检测NKX3.1对前列腺癌细胞凋亡的影响,进一步用RT PCR检测凋亡相关基因caspase3、caspase8、caspase9、Apaf1、survivin和Bcl2表达的变化.人同源盒基因NKX3.1 cDNA真核表达载体pcDNA3.1-NKX3.1经酶切及测序鉴定正确. pcDNA3.1-NKX3.1转染PC-3和LNCaP细胞后,经RT-PCR和Western印迹证明能有效表达NKX3.1.生长曲线显示,前列腺癌细胞转染NKX3.1 cDNA后细胞增殖受到抑制;前列腺癌细胞转染NKX3.1 cDNA 48 h后,DNA电泳呈现具有凋亡特征的DNA ladder;流式细胞术检测出现明显凋亡峰;RT-PCR检测凋亡相关基因.结果显示,caspase3、caspase8、caspase9基因表达明显增加,Bcl2基因表达明显减少.本研究成功构建了真核表达载体pcDNA3.1 NKX3.1, 转染PC3和LNCaP细胞后能有效表达,并对细胞具有诱导凋亡作用     

Fat-1 基因真核表达载体的构建及其对人口腔鳞癌细胞 脂肪酸含量的影响

目的:构建真核表达载体pcDNA3.1-Fat1,线性化稳定转染人口腔鳞癌细胞株Tca8113,检测其细胞内脂肪酸含量变化。方法:通过重叠延伸PCR方法人工合成利于真核表达的Fat-1基因,用基因重组技术构建真核表达载体pcDNA3.1-Fat-1,用脂质体转染真核细胞的方法转染人口腔鳞癌细胞株Tca8113,用气相色谱仪检测脂肪酸的变化情况。结果:测序及酶切鉴定成功合成真核偏好表达的Fat-1基因。与对照组相比,转染Fat-1基因的口腔癌细胞的n-3脂肪酸明显增多,n-6/n-3明显下降。结论:成功构建真核表达载体pcDNA3.1-Fat1,并对口腔鳞癌细胞内脂肪酸含量产生明显影响,为进一步研究Fat-1基因在口腔鳞癌中的生物学功能奠定了基础。     

小鼠Uncv基因克隆及真核表达

目的 克隆小鼠的Uncv基因并在真核细胞表达.方法 采用RT-PCR方法扩增小鼠皮肤组织中Uncv基因编码区,以真核表达质粒pcDNA 3.1-Flag为载体,构建Uncv真核表达质粒,将重组载体转染Hela细胞并用Western blot法检测基因表达.结果 构建Uncv基因真核表达载体pcDNA 3.1-Flag/Unev,重组质粒在Hela细胞中有效表达约95×103的融合蛋白.结论 成功构建真核表达载体pcDNA 3.1-Flag/Uncv,并且在真核细胞中有效表达,为研究Uncv基因生物学功能奠定基础.     

DH结构域缺失对SGEF在293T细胞中定位的影响

目的:通过构建带EGFP标签的SGEF基因DH结构域缺失的真核表达载体pEGFP-C1-SGEF-△DH并使其在293T细胞表达,观察DH结构域缺失后SGEF在293T细胞中的定位。方法:利用重叠PCR技术在pcDNA3.1-SGEF质粒上扩增缺失DH结构域的SGEF基因,然后将PCR产物亚克隆到真核表达载体pEGFP-C1上,对阳性克隆进行双酶切和测序鉴定,利用脂质体转染方法转染293T细胞,并用Western印迹和细胞免疫荧光技术对重组质粒pEGFP-C1-SGEF-△DH在293T细胞中的表达及其蛋白定位进行分析。结果:双酶切和测序鉴定表明,pEGFP-C1-SGEF-△DH真核表达质粒构建成功,转染实验发现该质粒能够在293T细胞中表达,表达产物主要定位在细胞核内。结论:构建了带EGFP标签的人SGEF基因DH结构域缺失的真核表达载体,该载体能够在哺乳动物细胞293T中表达,表达产物定位于细胞核,为进一步研究SGEF基因DH结构域的细胞生物学功能提供了一个重要的工具。     

人snail真核表达载体构建与鉴定

目的:构建人snail基因真核表达载体并鉴定。方法:使用RT-PCR法获取人snail基因全长c DNA,经Bam H I、Eco R I双酶切、连接,插入pc DNA3.1(+)真核表达载体,转化TOP10感受态细胞,用含氨苄青霉素的LB培养基筛选阳性克隆,提取质粒双酶切电泳及测序鉴定,瞬时转染siha细胞Western-blot从蛋白水平鉴定重组质粒在真核细胞内的表达。结果:pc DNA3.1-snail重组质粒经酶切电泳符合预期片段,测序鉴定插入片段与NCBI Gen Bank文库中人snail序列一致,重组质粒瞬时转染后snail蛋白表达量明显增高。结论:成功构建pc DNA3.1-snail重组质粒载体,为进一步探讨snail基因生物学功能奠定了基础。     

靶向IRE1a干扰质粒构建及对ERS时细胞增殖及凋亡的影响

目的构建靶向人IRE1a的shRNA干扰质粒（pSUPER-IRE1a）并观察其对人HeLa细胞和HepG2细胞增殖及凋亡的影响。方法设计并合成靶向IRE1a基因的两条shRNA,分别克隆至真核表达载体pSUPER构建重组质粒pS1、pS2,依次转染入HeLa细胞和HepG2细胞中。采用RT—PCR检测pS1、pS2转染前后IRE1a在HeLa细胞和HepG2细胞中的mRNA水平,免疫印迹检测pS1、pS2转染前后IRE1a蛋白的表达;MTT比色法、BrdU／DAPI双免疫荧光法及流式细胞仪分别检测各重组质粒对HeLa细胞和HepG2细胞增殖及凋亡的影响。结果干扰质粒（pSUPER-IRE1a）能有效抑制HeLa细胞和HepG2细胞中IRE1a基因的表达;成功转染后,细胞处于内质网应激（ER stress）状态时,各实验组细胞增殖率及凋亡率与对照组比较,差异均具有统计学意义P〈0．05）。结论成功构建靶向人IRE1a的shRNA真核表达载体pS1、pS2,有效抑制了HeLa细胞和HepG2细胞中IRE1a的表达;细胞处于ERS状态时,IRE1a-shRNA有效促进HeLa、HepG2两种肿瘤细胞的增殖;抑制HeLa和HepG2细胞的凋亡。     

USP22基因克隆及其融合蛋白真核表达载体的构建

目的克隆人类泛素水解酶22（ubiquitin—specific processing enzyme22,USP22）基因,构建与绿色荧光蛋白融合表达的真核载体。方法利用RT—PCR技术以HeLa细胞总RNA为模板分别扩增USP22基因cDNA序列两片段,依次插入真核表达载体pEGFP—N1;重组质粒转染HEK293T细胞,观察融合蛋白表达及绿色荧光的分布。结果测序结果显示USP22序列与GenBank收录数据一致,酶切显示重组质粒pEG—FP—USP22构建无误,质粒转染后有80％左右HEK293T细胞表达绿色荧光,且在胞质与胞核中广泛分布。结论成功克隆USP22基因并构建与GFP融合表达的真核载体,为进一步深入研究USP22基因的生物学功能奠定了基础。     

PSF不同功能片段融合蛋白的构建及其在细胞内的分布

目的将人类PSF基因的不同功能片段定向连入pEGFP—C2质粒,使PSF蛋白的各功能片段与绿色荧光蛋白在HeLa细胞内融合表达,观察其在HeLa细胞中的表达及定位。方法以重组质粒pEGFP—C2-PSF为模板,PCR法扩增出目的基因,将扩增片段双酶切后连接到质粒pEGFP—C2上,构建重组质粒pEGFP—C2-PSF（I—V）。将构建成功的pEGFP—C2-PSF（I—V）质粒脂质体法转染HeLa细胞,Western印迹检测融合蛋白的表达,并在荧光显微镜下观察融合蛋白的定位与分布。结果成功构建质粒pEGFP—C2-PSF（I～V）,并在HeLa细胞中实现表达;Western印迹检测到融合蛋白GFP—PSF（I～V）;在激光共聚焦显微镜下观察到绿色的融合蛋白表达和定位。结论人类PSF基因的不同功能片段的重组质粒pEG—FP—C2-PSF（I～V）构建成功,可用于标记PSF蛋白的不同功能片段,为进一步研究PSF在信号转导中的作用机制以及其生物学功能奠定基础。     

ω-3多聚不饱和脂肪酸脱氢酶的真核表达及鉴定

目的：构建ω-3多聚不饱和脂肪酸脱氢酶真核表达载体,并在293T细胞（人胚肾细胞）中实现表达。方法：通过RT-PCR法扩增得到ω-3多聚不饱和脂肪酸脱氢酶基因fat1,构建重组真核表达载体pCMV－Myc－fat1,用脂质体法转染293T细胞,Western Blot检测fat1的表达,并用间接免疫荧光（IFA）确定其在293T细胞中的定位情况。结果：构建真核表达质粒pCMV－Myc－fat1,转染293T细胞后,可检测到细胞内有fat1的表达并确定其在细胞中的位置。结论：成功构建真核表达质粒pCMV－Myc－fat1,可检测出细胞内有fat1的表达并确定其在细胞膜和细胞质内均有表达,为进行fat1的功能研究奠定了基础。     

多拷贝异种化前列腺干细胞抗原融合基因片段的构建及真核表达

目的：构建一系列含有人前列腺干细胞抗原（PSCA）主要T细胞表位的多拷贝异种化融合基因片段,并分别在人胚肾293T细胞中表达。方法：通过重叠延伸PCR法合成单拷贝异种化PSCA基因片段PSCA1,随即应用同尾酶法将该片段串联形成2、3、4拷贝异种化PSCA基因片段PSCA2、PSCA3和PSCA4,并将上述4种基因片段分别插入真核表达载体pCI-Fc-GPI中,构建最终目的片段1～4拷贝异种化PSCA-Fc-GPI（即PSCA1-Fc-GPI～PSCA4-Fc-GPI）,随即分别将重组质粒pCI-PSCA1-Fc-GPI～PSCA4-Fc-GPI体外转染293T细胞,利用间接免疫荧光和流式细胞仪检测其表达情况。结果：测序证实PSCA1片段与设计一致,酶切鉴定证明目的基因片段PSCA1-Fc-GPI～PSCA4-Fc-GPI构建成功;间接免疫荧光和流式细胞仪的检测结果显示,在293T细胞中1～4拷贝异种化PSCA融合基因片段均获得较好表达。结论：构建了目的基因片段PSCA1-Fc-GPI～PSCA4-Fc-GPI,为以PSCA为靶抗原的抗前列腺癌DNA疫苗的构建及功能研究奠定了重要基础。     

介导大鼠结缔组织生长因子基因沉默的慢病毒载体转移质粒的构建及鉴定

目的：构建介导大鼠结缔组织生长因子（CTGF）基因沉默的慢病毒载体转移质粒pGCL-CTGF,为进一步包装慢病毒载体奠定基础。方法：以大鼠CTGF基因为靶基因,根据RNA干扰（RNAi）序列设计原则,设计4对有小发夹结构的RNAi靶点序列,退火形成双链DNA,双酶切后定向克隆到慢病毒载体转移质粒pGCL-GFP中,构建4个含靶基因片段的重组慢病毒载体转移质粒pGCL-CTGF,并对质粒进行PCR及测序鉴定。结果：CTGF的短发夹RNA（shRNA）片段被成功克隆到慢病毒载体转移质粒pGCL-GFP中,4个插入序列与设计的靶基因片段完全一致。结论：构建了能够表达4个含CTGF靶基因片段的慢病毒载体转移质粒,为进一步包装介导CTGF基因沉默的慢病毒载体奠定了基础。     

hERG shRNA 表达载体构建及其稳定转染骨肉瘤细胞系MG-63、 SOSP-9607 的建立

目的:构建hERG钾离子通道蛋白(human ether-a-go-go-related gene potassium channel)shRNA表达载体质粒,获得稳定转染干扰质粒的人骨肉瘤细胞系MG-63、SOSP-9607。方法:将4对合成的寡核苷酸链退火形成双链,连接入pGPU6/GFP/Neo表达载体,并测序鉴定。使用脂质体法将重组的质粒转染至MG-63、SOSP-9607,通过G418筛选建立稳定转染的两种细胞系,采用免疫印迹(Western blot)技术检测hERG蛋白的表达。结果:测序结果证实shRNA与载体连接正确,免疫印迹实验证实hERG蛋白表达显著降低。结论:成功构建了hERG shRNA真核表达载体,获得了稳定表达hERG shRNA的人骨肉瘤细胞系MG-63和SOSP-9607。     

重组pEGFP—C2-p100-TSN点突变质粒构建及表达

目的将6个不同的p100-TSN．Mutants基因片段分别定向连入PEGFP—C2质粒中,使P100-TSN突变蛋白能够与绿色荧光蛋白在COS7细胞中融合表达,从而为进一步研究p100蛋白TSN结构域的功能奠定实验基础。方法利用EcoR I和Xho I双酶切方法从6个pcDNA3．1（＋）-p100-TSN．Mutants重组质粒中分别获得p100-TSN．Mutants的cDNA片段,将其连人pEGFP—C2质粒载体中,再将成功构建的6个pEGFP—C2-p100-TSN．Mutants质粒分别转染COS7细胞中,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达。结果①将重组质粒进行双酶切鉴定可见p100-TSN．Mutants的cDNA片段;②转染重组质粒后可观察到绿色荧光蛋白的表达。结论①6个pEGFP—C2-p100-TSN．Mutants重组质粒构建成功;②p100-TSN突变蛋白可与绿色荧光蛋白在COS7细胞中融合表达。     

T7噬菌体转运真核表达载体入胞表达平台的构建

[目的]构建携带锚定序列的真核表达载体,研究T7噬菌体识别、包裹和转运真核表达载体进入细胞实现蛋白表达的可行性,为DNA疫苗研发建立新的技术平台.[方法]本研究通过重叠延伸PCR方法获得候选锚定序列并插入真核表达载体;建立荧光定量PCR方法比较T7噬菌体识别、包裹真核表达载体的效率;激光共聚焦显微镜观察T7噬菌体转运真...     

人Polo样激酶1活性缺失突变体和结构域在293细胞中的瞬时表达

目的:构建人Polo样激酶1(Plk1)活性缺失突变体及结构域突变体的真核表达载体,并在293细胞中表达。方法:用二次PCR方法扩增Plk1基因并点突变,将82位赖氨酸突变为精氨酸,定向克隆到pcDNA3-Flag载体中;用普通PCR方法扩增Plk1激酶区域及Polo盒区域(PBD)基因,定向克隆到pcDNA3-Flag载体中;将上述质粒转染293细胞进行瞬时表达,Western印迹检测Plk1蛋白的表达。结果:构建了Flag-Plk1(K82R)、Flag-Plk1KD、Flag-Plk1PBD真核表达质粒,在293细胞中均可有效表达,蛋白相对分子质量分别为68×103、45×103、31×103。结论:在293细胞中表达了Flag-Plk1(K82R)、Flag-Plk1KD、Flag-Plk1PBD蛋白,有助于进一步探究Plk1对底物的功能。