幽门螺杆菌重组vacA-CtxB蛋白的原核表达及免疫学研究

目的原核表达幽门螺杆菌pQE-vctB(含H.pylori细胞空泡毒素毒性片段与霍乱毒素B亚单位的融合基因)在E.coil DH5α中诱导表达,以获得重组蛋白,鉴定其抗原性和免疫原性,为制备防治H.pylori感染的口服疫苗奠定基础。方法 (1)pQE-vctB转化E.coli DH5α,IPTG诱导表达重组蛋白VCTB,Western blot分析抗原性,镍离子柱纯化。(2)重组蛋白VCTB口服免疫小鼠,ELISA检测小鼠血清特异性IgG、小肠冲洗液IgA,以鉴定其免疫原性。结果重组蛋白VCTB经SDS-PAGE分析相对分子量(Mr)约为40kD,亲和层析后可获得纯度为92%以上的蛋白。Western blot分析显示能与VacA抗血清反应。ELISA检测显示,免疫小鼠的血清特异性抗体IgG,肠粘液IgA显著高于VacA对照组(P0.01)。结论 vacA和ctxB融合基因原核表达质粒转化E.coli DH5α表达菌获得了重组蛋白VCTB,表达量较高,纯度较高,有良好的抗原性和免疫原性,口服免疫小鼠可明显提高其免疫效果,产生较高水平的IgA,可用于制备防治H.pylori感染的口服疫苗。     

26肽蜂毒素与基因变构IL-2嵌合蛋白的原核表达、纯化及活性测定

在E .coliDH5α中表达26肽蜂毒素与基因变构人白细胞介素2的嵌合体蛋白 ,并进行初步纯化和抗原性检测。利用剪接式重叠延伸 (splicedoverlapextension ,SOE)技术在26肽蜂毒素与基因变构IL-2的基因之间导入四个易形成空间结构的氨基酸残基组成的连接肽 (Gly4Ser)₃,构建嵌合体蛋白的基因,克隆到原核表达载体pGEX4T-2中,重组质粒转化宿主菌DH5α,经IPTG诱导表达目的融合蛋白,纯化蛋白经Thrombin酶切后进行SDS-PAGE与Western-blot鉴定。结果表明重组蛋白有良好的抗原性 。     

人源抗TNF—α抗体Fab基因的单链化及其表达和纯化

构建人源抗TNF－α单链抗体基因,并尝试其在E.coli中的表达和纯化,采用人工接头,按VH－linkerVL的结构将人源抗TNF－a的VH,VL基因拼接成单链抗体（ScFv)基因,并将构建好的ScFv基因插入表达载体pQE30,转染E.coli M15,以IPTG诱导表达,Ni-NTA树脂纯化表达产物,构建的ScFv基因长723bp, 列分析表明,该序列拼接正确,SDS－PAGE显示,用重组的pQE30转化的M15菌经诱导后,有相对分子质量（M）约为52000的外源蛋白表达,Ni-NTA树脂纯化的表达产物纯度大于90％,因此,成功地构建了人源抗TNFa的ScFv基因,并在E.coli DH5a中表达和纯化的该基因的产物。     

p65蛋白的诱导表达及电子显微镜观察其显微结构

目的:构建重组原核表达载体pGEX-5x-1-p65,诱导GST-p65融合蛋白的表达并观察其包涵体的显微结构.方法:应用PCR技术扩增得到p65全长序列,并亚克隆至带有GST标签的pGEX-5x-1载体中.经酶切、测序鉴定后,在原核细胞中诱导表达GST-p65融合蛋白并将诱导后的菌体制作透射电镜标本,观察菌体内部显微结构.结果:成功构建表达载体pGEX-5x-1-p65,原核细胞中诱导表达、凝胶电泳后未见可溶性融合蛋白的高效表达.透射电镜观察到在承载有重组载体的菌体内部出现大量高电子密度的包涵体.结论:成功构建了原核表达载体pGEX-5x-1-p65,电子显微镜观察并证实在原核细胞内p65蛋白诱导表达形成包涵体.     

骆驼蓬脂转移蛋白基因克隆、表达及体外抗癌活性分析

[目的]构建骆驼蓬脂转移蛋白(Ph LTP)原核表达载体,并研究表达产物的体外抗癌活性。[方法]采用RT-PCR法从骆驼蓬(Peganum harmala)叶中扩增Ph LTP基因,将其成熟肽片段克隆至p ET-30a载体上,构建表达载体p ET-30a-Ph LTP,将重组质粒转化E.coli BL21进行原核表达,通过镍柱纯化获得重组骆驼蓬脂转移蛋白(r Ph LTP),经SDS-PAGE和Western blot分析鉴定,用MTT法检测其体外抗癌活性。[结果]成功构建骆驼蓬脂转移蛋白c DNA表达载体p ET-30a-Ph LTP,其在E.coli中以可溶性融合蛋白形式表达,分子量约为18 k Da。经镍柱纯化后重组蛋白r Ph LTP能够显著抑制宫颈癌He La、黑色素瘤B16和食管癌Eca-109细胞的生长,IC50值分别为16.76±1.23、38.92±2.16和9.01±1.01μg/m L。[结论]克隆了骆驼蓬脂转移蛋白基因并在原核表达系统中成功表达,r Ph LTP所显示的显著抗癌活性预示其具有临床应用的潜能。     

粉尘螨1类变应原T细胞表位重组蛋白的构建及鉴定

目的构建Der f1的T细胞表位融合肽基因的原核表达载体并表达鉴定。方法利用基因工程方法构建Der f1的T细胞表位融合肽嵌合基因,命名为Der f1T,并插入到原核表达载体p ET28a(+)中,形成重组原核表达载体p ET28a(+)-Der f1T,进行双酶切和测序验证后的阳性克隆转化到E.coli BL21(DE3)诱导其表达。制样进行SDS-PAGE分析表达产物,再进行纯化,并Western bloting鉴定表达的蛋白。ELISA法测定重组蛋白对粉尘螨过敏的患者血清Ig E抗体的结合能力。结果双酶切和测序结果说明原核表达载体p ET28a(+)-Der f1T构建成功;SDS-PAGE说明Der f1T诱导且纯化成功;Western bloting进一步说明Der f1T蛋白纯化成功;ELISA试验结果说明Der f1T对粉尘螨过敏的患者血清中Ig E结合能力与Der f1相比明显下降(P0.05)。结论成功表达Der f1的T细胞表位重组蛋白,为后续粉尘螨过敏患者提供特异性免疫治疗奠定基础。     

东亚三角涡虫RhoA基因的原核表达及组织定位

为了表达东亚三角涡虫RhoA蛋白,采用温控表达载体pBV220-IL1,构建了原核表达重组质粒pBV220-IL1-RhoA,转化到E.coli DH5α中,利用42℃热激诱导表达,并进行了分离纯化和Western杂交鉴定,利用荧光免疫组织化学技术检测了在涡虫体内的分布。SDS-PAGE电泳表明诱导表达的融合蛋白约为18 kDa,Western杂交结果显示是目的蛋白,荧光免疫组织化学结果表明RhoA蛋白在东亚三角涡虫神经系统处表达。     

原核表达载体pET30a/ATRX-C_(2193-2492)的构建与诱导表达

[目的]构建大鼠ATRX抗原端氨基酸序列的原核表达载体,为进一步制备ATRX多克隆抗体以及探讨ATRX蛋白在HPV16致宫颈癌中的作用奠定基础。[方法]以IF-GFP-ATRX质粒为模板,PCR扩增获得ATRX-C_(2193-2492)基因片段,并克隆至p ET30a(+)空载体上,转化E.coli BL21感受态细胞,构建原核表达载体p ET30a/ATRX-C_(2193-2492),经PCR、双酶切以及测序鉴定。将构建好的质粒p ET30a/ATRX-C_(2193-2492)转化,经IPTG诱导表达,利用镍离子亲和层析法纯化6His-ATRX-C_(2193-2492)蛋白。[结果]成功获得900 bp的ATRX-C_(2193-2492)基因片段并构建了原核表达载体p ET30a/ATRX-C_(2193-2492),且该载体能在E.coli中诱导表达分子量约34 k Da蛋白产物。[结论]原核表达载体p ET30a/ATRX-C_(2193-2492)能成功诱导表达分子量约34 k Da的ATRX-C_(2193-2492)蛋白,该蛋白纯化产物能为后续ATRX多克隆抗体的制备提供实验基础。     

人Hsp90α基因克隆、中试发酵及生物信息学分析

目的:克隆获得人热休克蛋白90α(Hsp90α)基因,构建其原核表达载体,分离纯化重组蛋白,为Hsp90抑制剂的体外筛选奠定基础.方法:TRIzol Reagent法提取K562细胞总RNA,通过RT-PCR获得Hsp90α-cDNA.以该cDNA为模板PCR扩增Hsp90α基因,目的基因和质粒pET28a(+)经Nco Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后,连接酶切片段,将重组DNA转化DH5α,酶切及测序鉴定重组体.将构建好的重组质粒转化Rosetta(DE3)菌株,IPTG诱导,经条件优化后进行中试发酵、纯化以及Western blot鉴定.结果:原核表达载体pET28a(+)-Hsp90α成功构建,可在Rosetta(DE3)中正确表达,中试发酵收菌574g且表达产物以可溶性形式存在,纯化产物纯度为97%.结论:利用分子克隆技术建立了Hsp90α基因的原核表达和中试发酵的条件,为更深入地研究其在抗肿瘤治疗中的作用打下基础.     

结核分枝杆菌持续感染期抗原Rv1733c 的表达、纯化和鉴定

目的:克隆结核分枝杆菌持续感染期抗原Rv1733c基因,构建其原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达和纯化。方法:采用聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Rv1733c基因片段,克隆入pMD18-T载体,序列测定正确后将其亚克隆入原核表达载体pPro-EXHTb,并在大肠杆菌DH5α中进行表达,表达蛋白经SDS-PAGE及Western-blot分析后,以Ni-NTA亲和层析纯化蛋白。结果:成功克隆了Rv1733c基因片段并构建了其原核表达载体pPro-EXHTb-1733c,转化E.ColiDH5α后能表达大小约30 KD的蛋白,Western-blot分析表明表达产物正确。通过亲和层析获得纯化蛋白。结论:成功构建结核分枝杆菌持续感染期抗原Rv1733c原核表达载体pPro-EXHTb-1733c,并获得纯化蛋白,为研究新型结核疫苗的靶抗原奠定了基础。     

沙眼衣原体L2型主要外膜蛋白的原核表达及其抗原性分析

克隆表达沙眼衣原体(Ct)L2血清型的主要外膜蛋白(MOMP)基因,并鉴定重组MOMP(rMOMP)的抗原性,为进一步研究Ct感染的诊断和预防技术奠定基础。应用PCR技术对CtL2型标准株的MOMP基因进行特异性扩增,将扩增产物克隆入表达载体pET-32a(+),成功构建了rMOMP-pET-32a(+)表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)后摇菌进行rMOMP的诱导表达、鉴定和纯化,免疫印迹和ELISA法分析显示rMOMP可与兔源抗CtL2多克隆抗体发生特异性反应,表明rMOMP具有良好的抗原性。     

汉滩病毒截短核蛋白在大肠杆菌中的表达及其初步应用

利用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)从急性期HFRS病人外周血清总RNA中扩增获得汉坦病毒S片段部分编码基因 (SA) ,使用NCBIBlast软件对排分析证实为汉滩型 ,申请GenBank号 :AY42 5 61 2。将该片段克隆入原核表达载体 ,并在大肠杆菌中高效表达。所表达的蛋白分子量约为 490 0 0kDa,重组蛋白在菌体中主要以包涵体形式存在。Western blot分析表明该核蛋白具有较好的抗原活性。该蛋白在肾综合征出血热 (HFRS)的血清学诊断中具有一定的价值。     

Epstein-Barr病毒包膜糖蛋白gp85的原核表达

目的:利用大肠杆菌BL21诱导表达GST-gp85融合蛋白,进行动物免疫制备多克隆抗体。方法:通过PCR反应从EB病毒转染的绒猴淋巴细胞系B95-8细胞中获得了gp85BXLF2基因,将此基因克隆到大肠杆菌表达载体pGEX-5T,得到阳性克隆pGEX5T-85。转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达重组蛋白,表达产物经SDS-PAGE分析、尿素变性、复性和亲和层析纯化,并用初步纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠。结果:SDS-PAGE可见在相对分子质量约100000处有蛋白条带,Western印迹表明该蛋白可与免疫的BALB/c小鼠血清及鼻咽癌血清起特异性反应。结论:在大肠杆菌细胞中成功表达了GST-gp85融合蛋白,该蛋白具有较好的抗原性和免疫原性。     

猪脑心肌炎病毒非结构蛋白3AB的原核表达及其单克隆抗体的研制

摘要　目的　利用原核表达系统表达猪脑心肌炎病毒 (EMCV) 非结构蛋白3AB,并通过杂交瘤细胞技术制备其单克隆抗体,为相关研究工作奠定基础。方法　利用大肠杆菌系统表达具有良好抗原性的重组3AB蛋白,经包涵体纯化后免疫BALB/ c 小鼠, 取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合, 间接ELISA筛选阳性的杂交瘤细胞, 并结合免疫荧光(IFA)和Weatern Blot对抗体的特异性进行鉴定。 结果　经间接ELISA 筛选阳性的杂交瘤细胞, 获得1株能稳定分泌抗3AB蛋白抗体的杂交瘤细胞株,将其命名为2D12,其亚类测定为IgG1 /κ。Western Blot和间接免疫荧光试验证明该单抗能特异性识别3AB蛋白。结论　成功获得了针对EMCV-3AB 的特异性单抗,为进一步研究猪脑心肌炎病毒非结构蛋白3AB的结构与功能及临床诊断试剂的研发奠定必要的物质基础。     

抗AIDS新型导向毒素CVN-LP1融合基因的构建及原核表达

目的：构建重组抗病毒融合蛋白CVN-LP1原核表达载体,并进行表达和鉴定。 方法：将本室已经构建好的pET-CVN和pET-LP1,用EcoRⅠ和HindⅢ同时进行双酶切,将所得的CVN片段连入pET-LP1载体上,构建pET-CVN-LP1表达载体,转入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。用SDS-PAGE,Western-blot等方法分析鉴定表达产物。 结果：重组载体pET-CVN-LP1经PCR和双酶切鉴定,证实构建成功。将其导入大肠杆菌BL21(DE3)中表达,表达产物相对分子量为20KD左右,与理论预期值完全相符。凝胶成像分析表明最高表达量可占菌体总蛋白的16.86%。SDS-PAGE、Western-blot分析表明目的蛋白得到了很好的表达。 结论：构建了pET-CVN-LP1原核表达载体,并成功地获得表达,为进一步研究其生物学功能奠定了坚实的基础。     

淋球菌nspA和大肠杆菌ltB融合基因的构建、表达及鉴定

通过基因工程的方法构建奈瑟氏淋球菌表面蛋白A(Neisseria gonorrhoeae surface protein A,nspA)和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(B subunit of Escherichia coli heat-labile enterotoxin,ltB)融合基因的原核表达载体,对其进行表达与鉴定,为后续融合蛋白LTB-NspA的生物活性分析及其作为淋球菌粘膜免疫疫苗的研究奠定基础.用PCR法从标准菌株分别扩增出nspA、ltB基因,用重组PCR法通过接头将ltB与nspA融合,将其插入pET-30a中,转入BL21中表达.经测序、SDS-PAGE和Western blot分析,证实成功构建了1tB-nspA融合基因的原核表达载体,并在BL21中表达.ltB-nspA融合基因的成功表达,为进一步研究其生物活性及淋球菌粘膜免疫疫苗的研究奠定了一定基础.     

结核分枝杆菌esat6-rpfD融合基因的原核表达及产物纯化

目的：构建结核分枝杆菌融合基因esat6-rpfD的原核表达载体,表达和纯化ESAT6-RpfD融合蛋白。方法：从结核分枝杆菌H37Rv株基因组中经PCR分别扩增esat6和慢周基因,克隆入pMD19-T载体,测序后克隆入原核表达载体pProExHTB,酶切重组质粒,转化大肠杆菌DH5α,IPTG诱导表达融合蛋白,亲和层析纯化融合蛋白。结果：PCR扩增的esat6、rpfD基因序列与GenBank报道一致;诱导表达后,经SDS-PAGE和Western blot分析,在相对分子质量约30000处有目的条带,融合蛋白以包涵体形式表达。结论：构建了esat6-rpfD融合基因原核表达载体,并在大肠杆菌中表达并纯化得到ESAT6-RpfD融合蛋白。     

猪白细胞介素18成熟蛋白基因的克隆与表达

目的克隆猪白细胞介素18(pIL-18)成熟蛋白基因,并在植物乳杆菌(Lb.plantarum)NC8中进行表达。方法通过RT-PCR方法从猪脾脏细胞中扩增出pIL-18成熟蛋白基因,克隆到T载体pMD18-T后测序;将阳性基因片段克隆至大肠埃希菌-乳酸菌穿梭表达载体pSIP-409构建重组表达载体pSIP-409-IL-18,进行酶切和PCR鉴定;应用电穿孔技术将其转化至Lb.plantarum NC8中,经SppIP诱导表达后,进行SDS-PAGE及Western-blot分析。结果经测序,pIL-18成熟蛋白基因核苷酸长度为579 bp,编码193个核苷酸;酶切和PCR鉴定证明成功构建了重组表达载体pSIP-409-IL-18;SDS-PAGE及Western-blot分析表明重组菌表达了18 kD的融合蛋白,该重组蛋白可以与鼠抗猪IL-18多克隆抗体反应。结论成功克隆了pIL-18成熟蛋白基因,并获得有生物活性的pIL-18重组乳酸菌,为研制开发IL-18重组乳酸菌制剂奠定基础。