安徽省流行性出血热病毒杂交瘤单克隆抗体的研制与应用

用流行性出血热病毒(EHFV)李株和陈株血凝素(HAN)分别免疫Balb/C小鼠,取其脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/O融合,杂交瘤生长孔率为97.5％和60％,阳性率各为2.5％和22％,克隆化培养阳性率达到100％。通过筛选得2株杂交瘤细胞、一株为2B_7、另一株为1H_8。其腹水单克隆抗体(McAb)滴度均达1∶16×10~4—32×10~4。1H_8的血凝抑制滴度达1∶5120。经染色体核型分析,杂交细胞染色体2B_7为80—97条,1H_8为85—105条,每个细胞均含一条中着丝点标记染色体。McAb的Ig类别和IgG亚类检测结果2B_7为IgM,1H_8为IgG_(2b)。两者对19株不同来源的EHFV具有不同的反应,1H_8McAb与19株都具有不同程度的免疫荧光反应,滴度都较高,且对5株不同来源的EHFV-HAN具有血凝抑制活性,滴度在1∶1280—5120,故1H_8为血凝抑制抗体;2B_7只对12株EHFV起反应,对7株不起反应,且没有血凝抑制活性。这说明1H_8与2B_7具有不同的特性。     

抗人PAI—1单克隆抗体制备,鉴定和应用

以重组PAI-(rPAI-1)为抗原,通过杂交瘤技术获得6株阳性杂交瘤细胞(AP1、AP2、AP3、AP4、AP5和AP6),并用SPA亲和层析纯化了抗PAI-1单克隆抗体(McAb)。所有McAb均能识别rPAI和天然PAI-1,腹水滴度均为10~6以上。6种McAb对PAI-1亲和常数在3.45×10~7—1.05×10~9mol/L之间。AP2、AP3 McAb能完全抑制PAI-1活性,AP4、AP和AP6只能部分抑制PAI-1活性,AP1则不抑制PAI-1活性。6种McAb中只有AP1、AP4和AP5能识别PAI-1/t-PA复合物。利用AP1、AP3、和AP4 McAb制备免疫亲和柱一步纯化HepG_2细胞分泌的PAI-1,纯度大于98％,回收率92％,纯化倍数51倍。利用抗PAI-1 McAb建立了夹心法ELISA,测定了人血浆PAI-1水平,正常人血浆PAI-1平均含量(±D)为24.7±7.75ng/ml。     

利用单克隆抗体对乙型脑炎病毒不同毒株抗原分析的研究

实验发现,应用动物免疫血清(多克隆抗体,PcAb)进行抗原分析时,我国分离到的乙型脑炎病毒SA14、P3、A2和高株的抗原性无明显差别,与从日本分离到的中山株有些差别,但仍被PcAb所中和;而用单克隆抗体(McAb)进行分析,情况就明显不同:SA14和P3株抗原性相似,高株和中山株不能被51-8McAb所中和,A2株则介于两者之间。A2和高顺生株的寡核苷酸指纹图谱分析表明,高株比A2株多两个斑点,但大多数斑点是一样的,证实了上述结果。实验还发现不同毒株的保护效果不同,A2株的免疫效果明显优于高株。     

抗B型葡萄球菌肠毒素单克隆抗体的研制及其鉴定

本文用纯化B型葡萄球菌肠毒素(SEB)免疫Balb/c小鼠的脾细胞与SP2/O骨髓瘤细胞融合,经筛选及克隆化共获6株能稳定分泌抗SEB的单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞株。通过将以混合佐剂(降植烷 FIA的混合物)和杂交瘤细胞同时注射制备McAb腹水的方法与常规法相比较,不仅量多(多1.56～1.84倍),而且活性好(高1个数量级)。初步鉴定表明:6株McAb均属IgGl亚类;其培养上清和腹水的ELISA滴度分别为10~(-3)～10~(-4)和10~(-5)～10~(-8)。它们与SEA均不起反应,其中3株(Sl.B4和E7)与SECl有轻微交叉反应;都能被10μg/m的SEB完全阻断等。说明其免疫学活性及特异性均较良好。     

抗甲3型(H3N2)流行性感冒病毒单克隆抗体的建立

将SP2/0 Ag小鼠骨髓瘤细胞与经蔗糖梯度离心纯化的甲3型流感病毒沪防/32/84(H3N2)免疫的BALB/C鼠脾细胞融合,经初步克隆获得了25个能稳定分泌抗甲3型流感病毒单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株,部份McAb的一些生物学性状如下。 经ELISA测定25个腹水McAb、除4株为10~(-4)外,其余滴度在10~(-5)～10~(-(?))间。此25个McAb中,16个为抗血凝素McAb,其中15个的血凝抑制效价在1:1,280～1:20,480,1个为1:320,在鸡胚内均有不同     

抗甲型肝炎病毒单克隆抗体(抗-HAV McAb)的研究

应用细胞融合技术成功地建立了3株持续高效分泌抗-HAV McAb的杂交瘤细胞株(AG_3,AD_2和AE_8株),所得腹水中的抗-HAV滴度达1:128000～1:1024000。这3株McAb都能与粪便提取HAV和细胞培养HAV反应,且这种反应均能被甲肝病人恢复期血清阻断。这些McAb作用于HAV的不同抗原位点,其中AE_8 McAb具有中和HAV感染性的能性。这些McAb作包被抗体检测HAV时,所测的HAV滴度较人抗体作包被时测得的滴度高2～8倍。将AE_8 McAb标记酶后,用以检测Abbott药盒标化的50份甲肝IgM血清,49份结果一致,符合率98％。     

抗CD52单克隆抗体ADCC转基因测活方法的建立

目的 建立转基因细胞法测定抗CD52单克隆抗体(单抗)的抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用(antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity,ADCC)生物学活性检测方法。方法 ①以Ramos细胞系作为靶细胞,以Jurkat-hFcγRⅢa/FcεRIγ-NFAT转基因细胞系作为效应细胞,通过荧光素酶检测系统(Bright-GloTM luciferase Assay System)建立抗CD52单抗的ADCC生物学活性检测方法;②对靶细胞、量效范围、效靶比及诱导时间进行优化并进行方法学验证;③研究建立的方法应用于对不同抗CD52单抗的ADCC生物学活性检测。结果 建立抗CD52单抗的ADCC生物学活性检测方法,抗CD52单抗在该方法中存在量效关系,符合四参数方程:y=(A-D)/[1+(x/C)B]+D;经优化后确定抗体量效范围为起始质量浓度360μg/mL,4倍系列稀释9个稀释度;效靶比为3∶1,诱导时间为6.0h;该方法具有良好的专属性;4个不同稀释组回收率样品经3次测定,相对效价分别为(45.58±4.67)%、(71.61±9.45)%、(122.92±7.92)%和(149.94±14.58)%;对应的回收率分别为(91.16±9.34)%、(95.49±12.60)%、(98.34±6.34)%和(99.96±9.72)%,上述结果的变异系数(coefficientofvariation,CV)均小于15%;且该方法也适用于不同抗CD52单抗的ADCC效应评价。结论 利用转基因细胞法成功建立了抗CD52单抗ADCC生物学活性检测方法,该方法专属性强、准确性高、重复性好,可用于评价抗CD52单抗的ADCC生物学活性。     

抗人PAI－1单克隆抗体制备、鉴定和应用

以重组PAI－（rPAI－1)为抗原,通过杂交瘤技术获得6株阳性杂交瘤细胞(Apl、AP2、AP3、AP4、AP5和AP6),并用SPA亲和层析纯化了抗Pal－1单克隆抗体(McAb)。所有McAb均能识别rPAI和天然PAI－1,腹水滴度均为10　6以上。6种McAb对PAI－1亲和常数在3．45×10⁷--1.05×10⁹mol／L之间。AP2、AP3McAb能完全抑制PAI－1活性,AP4、AP和AP6只能部分抑制PAI－1活性,Apl则不抑制PAI-1活性。6种McAb中只有Apl、AP4和AP5能识别Pal－1／t－PA复合物。利用Apl、AP3、和AP4 McAb制备免疫亲和柱一步纯化HepG2细胞分泌的PAI－1,纯度大于98％,回收率92％,纯化倍数51倍。利用抗PAI－1 McAb建立了夹心法ELISA,测定了人血浆PAI－1水平,正常人血浆PAI－1平均含量(X士D)为24．7±7．75ng／ml。     

人心肌肌钙蛋白Ⅰ单克隆抗体及多克隆抗体的制备

目的:以重组人心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)为抗原制备鼠源单克隆抗体(McAb)及兔源多克隆抗体,并鉴定抗体的特性。方法:以纯化的重组人cTnⅠ为抗原免疫BALB/c小鼠,取鼠脾细胞同Sp2/0骨髓瘤细胞融合,利用选择培养基筛选融合的杂交瘤细胞,用有限稀释法分离获得能够稳定分泌抗cTnⅠ的McAb阳性克隆,并利用体内诱生法大规模制备McAb,用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化抗体;兔多抗制备以cTnⅠ为抗原常规免疫后取其血清;用间接ELISA和Western印迹鉴定抗体的性质。结果:经ELISA鉴定,筛选出5株能分泌cTnⅠMcAb的杂交瘤细胞株,即C5B2、C5B3、C5B4、C5B1、B1A6,效价最高的B1A6株分泌的McAb为IgG3型,纯化后效价为1∶10000,亲和常数为1.08×10-9mol/L,Western印迹鉴定表明cTnⅠMcAb有良好的特异性;兔多抗纯化后的效价为1∶8000。结论:制备了具有良好特性的cTnⅠMcAb和多克隆抗体。     

重组人红细胞生成素单克隆抗体的制备

本文应用常规淋巴细胞杂交瘤技术制备了4株能稳定分泌抗人重组红细胞生成素(rHuEPO)单克隆抗体(McAb)的小鼠杂交瘤细胞系:BⅡ1B5、DⅡ6B9、MⅡ1H4、GⅠ3E7,用鼠单克隆抗体分型试剂盒鉴定,其分泌的McAb的类型分别是:IgM、IgM、IgG1和IgG2a。间接ELISA法测定细胞上清的效价为1×10~(-2)～1.25×10~(-1),腹水效价为1×10~(?)～1×10~(?)。培养上清经ELISA鉴定,与IL-2、GM-CSF、IFN-α等细胞因子均无交叉反应。只与rHuEPO特异性结合。     

安徽省两株流行性出血热病毒杂交瘤单克隆抗体性质的比较

两个流行性出血热病毒(EHFV)单克隆抗休(McAb)的性质是不同的,1Hg是血凝抑制抗体,2B_7则不然。前者对14株不同来源EHFV抗原部有免疫荧光反应,后者只对9株起反应,对5株不起反应。这意味着14株EHFV都具有血凝素(HAN)的抗原决定簇,但是1H_8对它呈现不同的活性。     

应用单克隆抗体对烟草花叶毒病抗原决定簇及其抗原型的分析研究

收集国内9省、市、自治区14个烟草花叶病毒(TMV)分离物,在隔离条件下繁殖毒源,以同一方法,相同条件提纯并定量。以20μg/ml 为起始浓度,作10~(-1),10~(-2)、10~(-3)、10~(-4)……10~(-9)9个稀释度(设健康寄主对照),分别与适宜浓度(通过逐一测定滴度而选定的)10个 TMV 单克隆抗体(McAb)〔设多克隆抗体、正常细胞腹水(SP2/0)对照〕进行 ELISA 试验,结果从14株分离 TMV 分离物中识别到8种抗原决定簇,并将这些 TMV 分离物划分为六个抗原型。这揭示了应用 McAb 区分 TMV 株系是一个很有希望的方法     

用乙脑病毒减毒株单克隆抗体分析乙脑病毒强毒株和减毒株的抗原差别

用乙型脑炎(乙脑)病毒强毒株免疫制备的单克隆抗体(McAb)分析证明强毒株之间的抗原差别,已有研究报道。本实验用乙脑病毒减毒活疫苗2-8株免疫制备的McAb分析强毒株和减毒株之间的抗原差别。 一、乙脑病毒株 2-8株和5-3株均为减毒活疫苗株。SA14株和A2株均为强毒株,SA14株是2-8株和5-3株的母株,A2株是国内实验室标准株。     

牛轮状病毒单克隆抗体的制备及其应用

以纯化浓缩的HN-7株牛轮状病毒(牛RV,从河南腹泻犊黄牛粪样中分离)作为免疫原,免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与同系小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,经克隆化筛选出2株(2C_7和3C_9)具群特异性的单克隆杂交瘤细胞株。2C_7与3C_9的小鼠腹水单克隆抗体(McAb)与牛HN-7、BRV007、BRV014及NCDV,猪Na86,猴SA-11和人Wa株RV细胞培养物的间接ELISA反应效价均达1∶10~5,但它们的HI和NT滴度分别≤1∶8和≤1∶100。McAb的Ig类别和IgC亚类检测结果2C_7为IgG1,3C_9为IgG2b。分别用3C_9 McAb和多克隆抗血清(PcAb)包被微量反应板进行粪样中RV抗原检测,共检测犊黄牛腹泻粪样36份、婴幼儿腹泻粪样40份,McAb和PcAb两系统检测结果的符合率分别达到97.2％(35/36)和100％(40/40)。     

流行性出血热病毒单克隆抗体的特性鉴定及其对病毒结构蛋白作用的初步研究

本文运用放射免疫沉淀法(RIP)、Western-blot及ELSA夹心法,对一组针对流行性出血热病毒(EHFV)L99株、C4株的单克隆抗体(McAb)进行特性鉴定,其中4株McAb针对糖蛋白G2,29株针对核壳蛋白(NP),1株针对糖蛋白G1和NP。微量中和试验和血凝抑制(HI)试验分析表明,虽绝大多数抗NP McAb既无中和活性亦无HI活性,但有1株例外。具有明显的中和活性和HI活性,提示EHFV核壳蛋白上可能存在中和抗原和血凝抗原决定簇。2株抗G2 McAb具有较高的HI活性,1株抗G2 McAb有较低的中和活性和较高的HI活性,另一株抗G2 McAb仅具有中和活性,表明EHFV糖蛋白G2上存在独立的中和与血凝抗原决定簇,也可能存在具有中和、血凝双重功能的决定簇。竞争ELISA分析显示。G2蛋白上某些中和位点和血凝位点虽然独立分布,但在某一区域可能相当靠近或有部分重叠。     

马铃薯卷叶病毒单克隆抗体的制备

马铃薯卷叶病毒(Potato leafroll virus,PLRV)在植物体内数量很少,难以提纯足够量病毒进行免疫,至今未见国内有制备PLRV单克隆抗体(McAb)的报道.本文以本室以前报道的方法提纯马铃薯卷叶病毒作为抗原,直接注入Balb/c小鼠脾脏,随后从尾静脉加强注射,采用杂交瘤技术建立了4个分泌抗PILRV McAb的杂交瘤细胞株。经微量免疫双扩散法鉴定,杂交瘤细胞株A1、A3、D3分泌的McAb均属gG1亚类,C3株者属IgG2a,它们的轻链都是λ型。将0.5ml含10~8个A1,A3,C3,D3杂交瘤细胞注入     

流行性乙型脑炎单克隆抗体的酶解及其F(ab′)2段免疫活性的研究

利用单克隆抗体(McAb)治疗病毒病,是人们关心的重要课题。陈伯权等获得具有良好中和活性的乙脑McAb51-8,并进行小白鼠的实验性治疗,证明有一定疗效。但鼠—鼠McAb在人体内应用存在异性蛋白反应的问题。为此我们开展了乙脑51-8 McAb的酶解及其F(ab′)_2段免疫活性的研究。     

玉米赤霉烯酮单克隆抗体和免疫酶技术研究

采用蛋白质连接技术合成玉米赤霉烯酮抗原,免疫Balb/c鼠,通过淋巴细胞杂交瘤技术建立六株分泌抗玉米赤霉烯酮的单克隆抗体杂交瘤细胞株。间接酶联免疫吸附试验测定细胞上清抗体效价为1:2084(4H8)、1:256(6H9、4H3、2H5、2C8)、1:16(3F10);腹水抗体效价为10~9(4H3、4H8)、10~8(2H5)、10~7(6H9)、10~5(3H10)。竞争间接酶联免疫吸附试验测定六株单克隆抗体对玉米赤霉烯酮的敏感度为0.3—0.8ng/ml。六株抗体与玉米亦霉烯醇的交叉反应率为1.3—9.0％。六株单克隆抗体均属IgG类。细胞体外传代培养和冻存复苏后分泌抗体稳定。纯化抗体在37℃保存12天稳定,-30℃保存90天抗体滴度不变。用该抗体建立竞争间接酶联免疫吸附试验检测掺合玉米赤霉烯酮的玉米、小麦、饲料,平均回收率分别为105％、90％、103％,平均批间变异系数为5.8％、2.8％、6.8％,批内变异系数为3.8％、12.7％、15.7％。样品中玉米赤霉烯酮掺合量与竞争间接酶联免疫吸附试验检出量有良好相关性(r≥0.9996)。     

用单克隆抗体ELISA研究和分析霍乱弧菌抗原结果

本文用ELISA以12株单克隆抗体(McAb)对55株EI Tor弧菌和用遗传学方法突变的28株霍乱弧菌的菌体抗原进行了研究,同时与四种常规分型方法进行对比试验。用12株McAb可将55株El Tor弧菌分成11种抗原决定簇和18个McAb型,将遗传学方法的突变株分成9种抗原决定簇和10个McAb型。其中一株McAb2B_1H_1F_3能识别所有55株EI Tor弧菌和大部分突变株霍乱弧菌,表明有种的特异性;其余11株McAb与各型霍乱弧菌的抗原反应,均有差异,与这些菌株的反应百分比各不相同(21.0％～100％),表明可能存在着亚型和亚群。文中着重讨论了用McAb研究分析抗原的重要意义和McAb用于诊断的价值。     

呼吸道合胞病毒融合抑制活性单克隆抗体的鉴定及应用

用杂交瘤技术制备了抗呼吸道合胞病毒 (RSV Long株 )的单克隆抗体F3细胞株。经IFA及ELISA证明 ,F3株McAb对RSV抗原特异 ,具中和活性及融合抑制活性 ,其腹水中和效价和融合抑制效价分别为 1∶12 8和 1∶6 4。将F3株McAb与商售混合单抗试剂盒进行临床诊断比较 ,二者阳性符合率 96 .9% ,阴性符合率 10 0 %。