登革病毒流行株的分离鉴定及其毒力位点变异研究

目的:从登革热患者血清中分离登革病毒,鉴定流行株的血清型及其毒力。对其中两分离株E基因进行序列测定,分析其可能的毒力位点变异。方法:采集临床诊断为登革热患者急性期血清91份,接种于C6/36细胞分离病毒,应用间接免疫荧光法鉴定及分型。并通过乳鼠脑内接种和空斑试验,测定分离株的毒力。扩增2株分离株E基因,克隆到pGEM-T载体进行序列测定,分析变异位点。结果:在91份血清中经2~3次传代分离出8株病毒,鉴定为登革1型病毒。在E蛋白影响毒力的3个区段中,两分离株有3处存在变异。结论:推测此次广州地区流行登革热可能由DEN 1型病毒感染引起,流行株的毒力较弱。毒力减弱可能和其基因位点变异有关。     

DENV2海南分离株NS1全序列测定和生物信息学分析

目的:对登革病毒2型海南分离株NS1全序列进行测定和生物信息学分析,了解其系统 进化和分子流行病学特征.方法:采用RT-PCR法扩增D2-Hainan全长NS1基因,将其克隆入载 体pPIcZáB,测序,采用相关软件进行生物信息学分析.结果:获得D2-H ainan株NS1全长基 因1056bp,其序列与登革病毒2型NGC株的同源性为95%.系统进化树分析显示该毒株与登革 病毒2型China04株的亲缘关系最近.初步分析了NS1蛋白的氨基酸序列特征和二级结构.结论:登革病毒流行株存在地域性和复杂性,对D2-Hainan株NS1基因及其编 码蛋白信息特征的了解,有助于进一步研究其基因特征与病毒毒力的关系.     

登革病毒疫苗研究现状与展望

登革病毒是属于黄病毒科的小型包膜病毒,在热带和亚热带地区通过蚊媒传播。其感染可引起临床症状轻微的登革热,甚至危及生命的登革出血热和登革休克综合征。登革病毒包含4种血清型,有效的登革病毒疫苗需对4种血清型的登革病毒均具有抗病毒保护作用。目前,尚未有针对登革病毒的特效药和成熟的疫苗产品。各类登革病毒疫苗均在研发中,其中一些已进入临床试验阶段。本文就登革病毒疫苗研究进展作一综述并对未来发展进行展望。     

登革病毒的系统发生树

登革病毒在除欧洲以外的所有大陆都有流行,弄清登革病毒在全世界的流行趋势及其致病机理对控制登革流行非常重要。本文就登革病毒系统发生树的构建方法及系统发生树的登革病毒分子流行病学、致病机理研究中的应用作一综述。     

登革病毒包膜E蛋白III区

登革病毒包膜E蛋白III区(DENV ED3)是登革病毒与敏感细胞受体结合的功能区域,对其结构和功能的研究,将有助于理解登革病毒与其敏感细胞间的相互作用和致病机理,为登革病毒受体研究和研发特异性阻断剂控制DENV感染奠定基础。现就DENV ED3的研究进展作一综述。     

登革病毒基因组研究进展

登革病毒基因组研究的进展有利于相关疫苗研制及针对性药物设计。本文就登革病毒基因组特征、功能、抗原表位及登革病毒感染后宿主体内产生的化学增活素作用等方面的研究进展加以综述。     

登革病毒检测技术研究进展

登革病毒可导致登革热、登革出血热和登革休克综合征,准确快速的早期诊断对其预后非常关键,因此登革病毒检测技术的发展势在必行。在此,我们简要综述目前的登革病毒分离、血清学检测、分子生物学检测技术进展。     

两例输入性登革病毒合并基孔肯雅病毒感染实验室检测

对不明原因发热病人开展登革病毒和基孔肯雅病毒合并感染的检测,明确合并感染的可能性,为防御这两种虫媒传染病的传播提供依据。通过流行病史调查,临床症状和实验室检测对两名从泰国普吉岛旅行归来的发热病人进行了登革病毒和基孔肯雅病毒感染的诊断。两名患者在泰国旅行停留10天,在此期间两人均有蚊虫叮咬史。回国3天后两患者相继出现高热症状(39℃以上),且伴有皮疹,肌肉酸痛和乏力。实验室血常规检测发现轻度血小板降低伴淋巴细胞减少,登革病毒IgG/IgM快速诊断试剂盒检测发现一名患者登革病毒IgM阳性。实时荧光RT-PCR检测证实两患者血液中登革病毒和基孔肯雅病毒核酸均阳性,同时用RT-PCR方法扩增获得了登革病毒C-prM蛋白部分基因,经测序和同源性分析,证实感染登革病毒属于Ⅰ型登革热病毒。这是我国首次出现的输入性登革病毒合并基孔肯雅病毒感染病例,本研究建议对流行病史和临床症状满足的病例要同时进行两种病毒的实验室检测。     

2型登革病毒检测基因芯片的研制

利用长片断PCR扩增含几乎全长的2型登革病毒cDNA,酶切PCR扩增产物,通过建立2型登革病毒。DNA文库获取芯片探针用点样仪将探针制备成2型登革病毒检测基因芯片,杂交时采用限制性显示(Restriction Display RD)技术标记样品,Scan Array芯片扫描仪检测杂交信号．杂交结果显示,样品和2型登革病毒基因芯片杂交的敏感性强、特异性高．     

表达登革病毒prM基因小干扰RNA的Vero细胞系的建立

prM蛋白是登革病毒膜蛋白M的前体,膜蛋白M对病毒的组装与成熟有重要作用,针对prM基因设计的小干扰RNA（siRNA）可短期抑制登革病毒复制.为了达到长期抑制登革病毒的效果,本研究构建了插入prM siRNA序列的重组慢病毒,利用流式细胞术分选以及杀稻瘟霉素抗性,筛选出稳定表达prM siRNA的非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）系.经逆转录PCR及测序验证siRNA序列表达正确. Vero细胞中prM siRNA的表达率约为976%.当受到登革病毒攻击时,表达prM siRNA的Vero细胞能够明显抑制登革病毒prM基因的表达,并抑制登革病毒在Vero细胞中的复制.建立的Vero细胞系可用于RNA干扰防治登革病毒感染的进一步应用研究.     

应用DNA-RNA斑点杂交法检测登革病毒核酸

新近制备了大量纯化的pEH920 DNA,该质粒DNA插入了登革病毒2型核酸片段的互补DNA。以[a-~(32)P]dCTP按缺口转译法标记pEH 920 DNA作为探针,以感染病毒的蚊细胞c_6/36培养上清作标本,应用DNA-RNA斑点杂交法检测了登革病毒核酸。结果显示同位素标记探针(pEH 920)与登革病毒2型标本反应最强,具有一定的型特异性。但与其它血清型登革病毒也呈一定交叉反应。初步探讨了探针的敏感性,至少可检出TCID_(50)625的登革病毒2型核酸。     

RNA干扰抑制登革病毒复制的研究

为了研究RNA干扰(RNAi)对Ⅰ型登革病毒(DENV-1)在白纹伊蚊C6/36细胞内复制的影响,本研究设计并合成针对I型登革病毒Pr M基因的小干扰RNA,以脂质体法转染入C6/36细胞后,用DENV-1感染已转染的细胞,观察细胞病变效应,MTT法检测细胞存活率,荧光定量RT-PCR检测登革病毒RNA含量。结果表明:转染siRNA的C6/36细胞在受登革病毒攻击7天后仍无明显细胞病变效应,细胞存活率比对照组提高2.26倍,细胞内登革病毒RNA拷贝数比对照组降低约97.54%。说明利用RNA干扰技术能有效抑制登革病毒核酸在C6/36细胞内复制,并对细胞具有一定保护作用,为登革热的防治提供了新的思路。     

我国两株登革2型病毒基因组的全序列分析

本研究对我国两株登革2型病毒D2-43株、D2-04株的基因组进行了全序列测定,在此基础上对这两株引起不同临床症状及鼠神经毒力的登革病毒的基因组序列进行了比较分析,结果表明D2 43株与D2-04株基因组全长约为10 723nt,核苷酸序列的同源性为95.1%,氨基酸序列的同源性为97 6%,不存在特别的高变区.这两株序列中共有83个核苷酸的变化导致了氨基酸的变化,其中21个差异氨基酸可引起所在位点电荷或极性的变化,位于登革病毒粒子表面的E糖蛋白第126位氨基酸由Glu(D2-04株)→Lys(D2-43株)的变化对其抗原性有影响,可能引起了病毒对鼠神经毒力的改变.对结构糖蛋白E基因的聚类分析表明D2-43株与新几内亚株、台湾87株及菲律宾83株亲缘关系较近,D2-04株与牙买加株及巴西90年分离株的亲缘关系较近,表明我国存在不同起源的登革2型病毒感染.     

001基于3种抗原以IgM捕获酶联免疫吸附试验对登革病毒血清分型

登革热是由黄病毒科的登革病毒引起，并影响全世界热带和亚热带城镇的地方性病毒流行病。近年来，登革热及更严重的登革出血热和登革休克综合征已成为分布更广的公共卫生问题和重点流行病。登革病毒有4个不同血清型，初次感染后，对同型登革病毒可导致终身保护性免疫，而对再次感染其他3型登革病毒，     

我国两株登革2型病毒基因组的全序列分析

本研究对我国两株登革２型病毒Ｄ２－４３株、Ｄ２－０４株的基因组进　行　了全序列测定,在此基础上对这两株引起不同临床症状及鼠神经毒力的登革病毒的基因组序　列进行了比较分析,结果表明Ｄ２－４３株与Ｄ２－０４株基因组全长约为１０　７２３ｎｔ,核苷酸序列的同源性为９５．１％,氨基酸序列的同源性为９７．６％,　不存在特别的高变区。这两株序列中共有８３个核苷酸的变化导致了氨基酸的变化,其中２１个　差异氨基酸可引起所在位点电荷或极性的变化,位于登革病毒粒子表面的Ｅ糖蛋白第１２６位氨　基酸由Ｇｌｕ　（Ｄ２－０４株）→Ｌｙｓ（Ｄ２－４３株）的变化对其抗原性有影响,可能引起了病毒对鼠神　经　毒力的改变。对结构糖蛋白Ｅ基因的聚类分析表明Ｄ２－４３株与新几内亚株、台湾８７株及菲律　宾　８３株亲缘关系较近,Ｄ２－０４株与牙买加株及巴西９０年分离株的亲缘关系较近,表明我国存　在不同起源的登革２型病毒感染。     

一种前景广阔的单剂量、四价减毒登革热疫苗候选物

正登革病毒(Dengue virus,DENV)的迅速传播在全球范围内造成了巨大的健康威胁,居住在超过100个国家,约占全球40%的人口面临着登革病毒传播的风险,其中包括美国。2010年,全球共报告登革病毒感染案例3.9亿,其中0.96亿出现了感染症状。感染登革病毒会造成一系列临床症状,包括与其他疾病无明显差别的轻微发热、典型登革热或者重症登革热。重症登革热的特征是出血和/或血     

登革病毒包膜蛋白的原核表达及免疫原性研究

登革病毒感染引起的登革热和登革出血热/登革休克综合征是目前流行最为广泛的虫媒病毒病,但其发病机制不明,也无疫苗和特异性抗病毒药物用于防治。登革病毒包膜蛋白(E蛋白)在病毒致病和免疫过程中发挥重要作用。本研究构建了登革病毒2型E蛋白基因的重组质粒E/pGEX-6P-1,并优化表达条件,获得登革病毒E蛋白的高效可溶性表达;用谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B亲和层析柱纯化,获得纯度较高的蛋白。该蛋白具有较好的免疫原性,免疫小鼠后可获得高效价抗体。本研究为进一步了解登革病毒E蛋白的功能及其在相关疾病中的应用奠定了基础。     

一种前景广阔的单剂量、四价减毒登革热疫苗候选物

<正>登革病毒的迅速传播在全球范围内造成了巨大的健康威胁,居住在超过100个国家,约占全球40%的人口面临着登革病毒传播的风险,其中包括美国。2010年,全球共报告登革病毒感染案例3.9亿,其中0.96亿出现了感染症状。感染登革病毒会造成一系列临床症状,包括与其他疾病无明显差别的轻微发热、典型登革热或者重症登革热。重症登革热的特征是出血和/或血浆渗漏(登革出血热和登革休克     

登革病毒四型联合重组包膜蛋白III区的表达和免疫原性鉴定

登革热在全球范围内广泛流行,但是目前为止却仍然没有疫苗上市,疫苗的开发迫在眉睫。抗体依赖增强感染效应是登革病毒疫苗开发中遇到的一个瓶颈问题。研究表明登革病毒的包膜蛋白III区能够介导中和抗体产生,且诱导产生较少的交叉抗体或无交叉抗体,能够大大减弱抗体依赖增强感染效应,因而是登革热重组蛋白疫苗的首选靶标。通过酵母密码子优化后合成同时包含4种血清型登革病毒包膜蛋白III区的四价联合DV EDIII蛋白序列,随后构建酵母表达质粒,并获得酵母表达菌株,经诱导后四联DV EDIII蛋白获得高效表达。通过Western blot、ELISA检测及蛋白质免疫原性鉴定,结果表明登革病毒四联DV EDIII蛋白表达质粒构建成功,重组蛋白在毕赤酵母获得高效表达,免疫小鼠后能够介导产生较高水平的血清效价。这表明已获得了能引起有效免疫反应的四型登革病毒EDIII蛋白,为登革病毒疫苗的研究提供了良好的基础。     

登革病毒ADE发生机制的研究进展

在登革病毒致病机理中,抗体依赖增强感染效应(Antibody-dependent enhancement,ADE)占据重要地位,可能在人体二次感染登革病毒后引起严重疾病。对近年来重症登革病毒感染作用机制研究中常用的细胞系、动物模型、ADE对于病毒进入宿主细胞的促进作用以及ADE引起的细胞因子变化等方面的研究进展进行了综述。