限制和修饰系统LlaBⅢ在构建抗噬菌体菌株中的作用

限制和修饰(restriction and modification,R/M)系统是指由限制性内切酶和甲基化酶组成的单亚基或多亚基复合酶系统,两者通常成对出现,具有相同的DNA识别位点,其作用相反.R/M系统在原核生物中普遍存在,在保护细胞免遭外源病毒侵害方面具有重要作用[1].     

限制和修饰酶基因LlaBⅢ的克隆及分析

Pjw5 66是从丹麦乳酪生产菌株Lactococcuslactissubsp .cremorisW5 6中分离到的 ,一个 2 2 4kb、具有限制和修饰作用的质粒。内切酶ClaⅠ对Pjw5 66不完全消化 ,所得片段与来自于质粒Pvc5的氯霉素抗性基因连接得到一个携带有完整限制和修饰酶基因的质粒pJK1。基因亚克隆分析发现该基因位于约 5kb的SphⅠ HindⅢDNA片段上。序列分析表明该片段包含一个 4572bp的开放阅读框架 ,编码一个由 1576/1584个氨基酸残基组成的蛋白质 ,该基因命名为LlaBⅢ。蛋白质同源性查询发现在该蛋白的N 末端有 7个保守区域 ,与R M系统Ⅰ型和Ⅲ型内切酶有较高同源性 ,在蛋白的中间区域有 4个代表N⁶-腺苷酰甲基转移酶的特征序列 ,而蛋白的C 末端不同于任何已知蛋白。这种具有限制、修饰和可能的DNA识别作用的多功能蛋白 ,可能是一新的R M系统。     

乳酸乳球菌乳脂亚种W56中质粒pJW566的生物学特性

从丹麦乳酪发酵启子乳酸乳球菌乳脂亚种 (Lactococcuslactissubsp .cremoris)W56中 ,分离到一个 2 2 4kb的质粒pJW566,将该质粒转化到无质粒且噬菌体敏感的L .lactisMG1 61 4、SMQ86菌株中 ,所得转化子对常见 963、c2和P335属的噬菌体具有一定抗性。经测定噬菌体以及含有pJW566的菌株所繁育的噬菌体效价 ,发现该质粒对外源DNA具有限制和修饰 (Re strictionandModification ,R M)作用。将pJW566转化到一株噬菌体敏感的乳酪工业生产菌株L .lactisCHCC2 2 81 ,在牛奶发酵中 ,表现出较强的噬菌体抗性。体外内切酶活性测定表明 ,该质粒具有的限制性内切酶需要Mg2 +和ATP ,而AdoMet(S adenosylmethionine,AdoMet)对酶活有促进作用     

限制和修饰酶基因Lla BⅢ的克隆及分析

pJW566是从丹麦乳酪生产菌株Lactococcus lactis subsp.cremoris W56中分离到的,一个22.4kb,具有限制和修饰作用的质粒,内切酶ClaⅠ和pJW566不完全消化,所得片段与来自于质粒pVC5的氯霉素抗性基因连接得到一个携带有完整限制和修饰酶基因的质粒pJK1。基因亚克隆分析发现该基因位于约5kb的Sph0Ⅰ-Hin dⅢDNA片段上。序列分析表明该片段包含一个4572bp的开放阅读框架、编码一个由1576／1584个氨基酸残基组成的蛋白质,该基因命名为Lla BⅢ。蛋白质同源性查询发现在该蛋白的N－末端有7个保守区域,与R／M系统Ⅰ型和Ⅲ型内切酶有较高同源性,在蛋白的中间区域有4个代表N^6-腺苷酰甲基转移酶的特征序列,而蛋白的C－末端不同于任何已知蛋白。这种具有限制、修饰和可能的DNA识别作用的多功能蛋白,可能是一新的R／M系统。     

基因工程技术在建立噬菌体抗性机制研究中的应用

在自然发生的噬菌体抗性机制的基础上,应用基因工程技术可以建立广泛的噬菌体抗性机制,为有效解决噬菌体感染问题提供了新的策略。噬菌体编码的抗性、反义RNA技术、自杀陷阱及限制/修饰系统的应用是近年来发展起来的几种抗噬菌体策略,着重对其作用机制、研究进展及其意义作一介绍。同时指出应用基因工程技术构建的噬菌体抗性菌株应用于食品发酵工业中所存在的问题,并对其应用前景作了展望。     

BstNI同功酶限制—修饰系统基因的表达检测和定位分析

鉴定了Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１和ＪＭ１１０的部分遗传标记,作为受体菌分别用于ＢｓｔＮＩ同功酶限制－修饰系统中限制性内切酶（Ｒ）基因和甲基化酶（Ｍ）基因表达的检测。用外切酶Ⅲ单向删切含Ｒ－Ｍ基因的ＤＮＡ片段,获得２３个缺失突变亚克隆。通过检测各亚克隆表达的Ｒ酶和Ｍ酶活性,将Ｒ和Ｍ基因分别定位在距克隆位点ＰｓｔＩ和０．２→１．４ｋｂ和１．５→３．３ｋｂ范围内。分析表明：该系统属于Ⅱ类限制－修饰系统,两     

产抑菌素菌株SM-A的分离和鉴定

自市售酸乳酪中分离到一株乳球菌SM-A菌株。该菌株产生的抑菌素能抑制或杀死芽孢杆菌、葡萄球菌、微球菌、链球菌、棒杆菌和梭菌等革兰氏阳性细菌,但对革兰氏阴性细菌、霉菌和酵母无效。SM-A菌株多为链球状,也有成对存在。革兰氏染色阳性,抗酸染色阴性,兼性厌氧生长,最适生长温度32℃,不形成芽孢,无荚膜和鞭毛,不运动;可从多种糖类产酸,但不产气;接触酶、苯丙氨酸脱氨酶和酪氨酸脱羧酶均为阴性,精氨酸双水解酶阳性;不液化明胶,还原石蕊牛奶并胨化,生长温度范围10～43℃,DNA中G+Cmol为36.4％。经鉴定,SM-A菌株为乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)。     

大肠杆菌抗噬菌体基因的挖掘及其抗噬菌体菌株的构建

【目的】噬菌体是工业发酵侵染底盘细胞的专一性病毒,由于其广泛存在以及难以根除,极大影响了发酵生产,从基因水平进行抗噬菌体基因的挖掘以及功能验证可以显著增强底盘细胞的抗噬菌体的能力,从而达到从源头上抵御噬菌体污染的目的。为了选育具有噬菌体抗性的工程菌株,本研究旨在分析选取抗噬菌体的基因以及构建抗噬菌体的工程菌株。【方法】采用共进化筛选、重测序手段、重组菌株构建以及噬菌体侵染的敏感验证实验等方法,获得具有抗噬菌体属性的工程菌株。【结果】实验通过共进化共筛选得到7株抗噬菌体驯化菌株,基因组重测序以及Annovar软件分析,发现了12个基因发生位点突变,选取位点突变频率较高的dnaE (DNA聚合酶III亚基α)、yhjH (环状二GMP磷酸二酯酶)及rzoD (假定的噬菌体裂解脂蛋白) 3个基因分析对噬菌体的抗性,突变基因过表达菌株对噬菌体BL21 Virus 01、BL21 Virus 02、BL21 Virus 06、T1和T7具有明显的抗性;吸附率测定结果表明,基因dnaE和yhjH影响噬菌体复制,而基因rzoD突变影响噬菌体吸附过程。使用定量PCR进一步分析突变基因dnaE和yhjH对噬菌体的抗性作用,结果表明基因dnaE、yhjH突变影响噬菌体基因组BL21 Virus 01的复制过程,而rzoD突变影响噬菌体BL21 Virus 01的吸附过程。【结论】基因dnaE、yhjH、rzoD的位点突变能够有效抵御噬菌体的侵染,同时含有3个位点突变的工程菌株BC11具有较广范围内的噬菌体抗性,是潜在的抗噬菌体底盘细胞。本研究为抗噬菌体基因挖掘与初步解析以及开发抗噬菌体工程菌株提供借鉴。     

产抑菌素菌株SM—A的分离和鉴定

自市售酸乳酪中分离到一株乳球菌SM-A菌株。该菌株产生的抑菌素能抑制或杀死芽孢杆菌、葡萄球菌、微球菌、链球菌、棒杆菌和梭菌等革兰氏阳性细菌,但对革兰氏阴性细菌、霉菌和酵母无效。SM-A菌株多为链球状,也有成对存在。革兰氏染色阳性,抗酸染色阴性,兼性厌氧生长,最适生长温度32℃,不形成芽孢,无荚膜和鞭毛,不运动;可从多种糖类产酸,但不产气;接触酶、苯丙氨酸脱氨酶和酪氨酸脱羧酶均为阴性,精氨酸双水解酶阳性;不液化明胶,还原石蕊牛奶并胨化,生长温度范围10～43℃,DNA中G Cmol为36.4％。经鉴定,SM-A菌株为乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)。     

stNI同功酶限制 修饰系统基因的表达检测和定位分析

鉴定了Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１和ＪＭ１１０的部分遗传标记,作为受体菌分别用于ＢｓｔＮＩ同功酶限制－修饰系统中限制性内切酶（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ,简称Ｒ）基因和甲基化酶（Ｍｅｔｈｙｌａｓｅ,简称Ｍ）基因表达的检测。用外切酶ＩＩ单向删切含ＲＭ基因的ＤＮＡ片段,获得２３个缺失突变亚克隆。通过检测各亚克隆表达的Ｒ酶和Ｍ酶活性,将Ｒ和Ｍ基因分别定位在距克隆位点ＰｓｔＩ的０２→１４ｋｂ和１５→３．３ｋｂ范围内。分析表明：该系统属于Ｉ类限制修饰系统,两个基因受控于不同的启动子;该系统与Ｅ．Ｃｏｌｉ染色体编码的胞嘧啶ＤＮＡ甲基转移酶（Ｄｃｍ）的识别序列相同,后者的甲基化作用也能阻止Ｒ酶的切割。Ｒ＋Ｍ－的重组质粒对Ｄｃｍ＋和Ｄｃｍ－的宿主都是致死性的,这说明在进化过程中,与Ｒ基因紧密连锁的Ｍ基因对系统的存在至关重要     

限制修饰系统cglI赋予钝齿棒杆菌抗噬菌体功能活性

为解决氨基酸发酵工业中的噬菌体污染问题, 对cglI基因复合体在钝齿棒杆菌中的功能活性表达进行研究。通过PCR从谷氨酸棒杆菌基因组扩增cglI基因复合体, 构建重组质粒pJL23-cglI, 转化钝齿棒杆菌T6-13后得到重组菌株。定性和定量检测重组菌株的噬菌体抗性。实验结果表明, 携带cglI基因复合体的重组钝齿棒杆菌显示了明显的抗噬菌体功能活性和较广的抗噬菌体谱, 进而证实了cglI基因复合体用于构建钝齿棒杆菌抗噬菌体菌株的可行性, 为解决氨基酸发酵生产中的噬菌体污染问题提供了一种有效方法。     

限制修饰系统cglI赋予钝齿棒杆菌抗噬菌体功能活性

为解决氨基酸发酵工业中的噬菌体污染问题, 对cglI基因复合体在钝齿棒杆菌中的功能活性表达进行研究。通过PCR从谷氨酸棒杆菌基因组扩增cglI基因复合体, 构建重组质粒pJL23-cglI, 转化钝齿棒杆菌T6-13后得到重组菌株。定性和定量检测重组菌株的噬菌体抗性。实验结果表明, 携带cglI基因复合体的重组钝齿棒杆菌显示了明显的抗噬菌体功能活性和较广的抗噬菌体谱, 进而证实了cglI基因复合体用于构建钝齿棒杆菌抗噬菌体菌株的可行性, 为解决氨基酸发酵生产中的噬菌体污染问题提供了一种有效方法。     

Identification of three different plasmid-encoded restriction/modification systems in Streptococcus lactis subsp. cremoris W56

Abstract Streptococcus lactis subsp. cremoris W56 ( S. cremoris W56) is a strain partially resistant to phage attack. Derivatives which had lost either plasmid pJW563 or pJW566 no longer expressed the restriction and modification systems encoded by these plasmids. Genetic evidence for the correlation between the plasmids and the R/M systems was obtained by transformation. In addition, a third R/M system was discovered among the transformants and was shown to be encoded by pJW565. Thus, genetic evidence for at least 3 distinct R/M systems encoded by plasmids in S. cremoris W56 is presented. One of the R/M-systems showed stronger restriction of the isometric phage p2 than of the prolate phage c2. The other two systems restricted both classes of phages with equal efficiencies.     

Cold shock response in Lactococcus lactis ssp. diacetylactis: a comparison of the protection generated by brief pre-treatment at less severe temperatures

Acquired freeze–thaw tolerance was investigated for Lactococcus lactis ssp. diacetylactis. Pre-treatment of microorganisms at less severe temperatures to initiate cold tolerance gave L. lactis ssp. diacetylactis improved cell viability after successive freezings and thawings. The ability of cells to survive freezing–thawing was dependent on factors experienced prior to freezing. Factors affecting lactic acid bacteria survival during freezing–thawing cycles include different diluents, growth phase, and cold temperatures. Viability experiments showed that this strain displaying cold shock cryotolerance had an improved survival capacity in stationary phase. The plasmid contents of lactic acid bacteria isolated from different types, strains DRC-2 and DRC-2C, were examined and compared with the plasmid contents of culture collection strains both before and after cold shock treatment. Using agarose gel electrophoresis, no obvious correlation between the cold shock response and the number of plasmids in the cell could be observed.     

Improvement of phage defence in Lactococcus lactis by introduction of the plasmid encoded restriction and modification system LlaAI

AIMS: To study the ability of the plasmid-encoded restriction and modification (R/M) system LlaAI to function as a bacteriophage resistance mechanism in Lactococcus lactis during milk fermentations. METHODS AND RESULTS: Plasmid pAIcat4, carrying the R/M system LlaAI and a chloramphenicol resistance cassette, was introduced into the plasmid-free strain L. lactis MG1614 and the industrial strain L. lactis 964. By measuring changes in conductivity the influence of different phage on the growth was determined. CONCLUSIONS: The plasmid-encoded R/M system LlaAI significantly improves the bacteriophage resistance of L. lactis during milk fermentations. SIGNIFICANCE AND IMPACT OF THE STUDY: It is essential to determine the potential of a phage defence mechanism in L. lactis starter culture strains during growth in milk before steps are taken to improve starter cultures. This study shows that LlaAI is useful for improvement of starter cultures.     

利用Cre/lox重组系统获得无选择标记的SKTI抗虫转基因烟草

将置于两个同向lox位点之间的Bar基因表达盒与大豆胰蛋白酶抑制剂SKTI基因表达盒融合后获得相应植物表达载体,转化烟草Wisconsin 38后获得对棉铃虫具有明显抗性的SKTI转基因植株。SKTI转基因植株通过叶盘二次转化法导入Cre基因,对再生植株叶盘进行Basta的抗性检测,检测Bar基因的删除情况。结果表明:绝大多数再生植株对应叶盘在含8 mg/L PPT的筛选培养基上无法再生,Bar基因被删除的效率在38%~100%之间。对Bar基因删除区域进行PCR及克隆测序后发现Bar基因表达盒被精确删除。对Bar基因删除植株开花自交获得的分离后代进行NPTⅡ抗性检测,5株NPTⅡ敏感植株分子检测显示均只含有SKTI基因而无Cre基因存在,为无选择标记基因的SKTI转基因植株。     

Large increase in brazzein expression achieved by changing the plasmid /strain combination of the NICE system in Lactococcus lactis

Aims:  To evaluate brazzein production in Lactococcus lactis using the nisin-controlled expression (NICE) system. The approach is through analysis of different plasmid/strain combinations.
Methods and Results:  Two plasmid/strain combinations of the NICE system were used in brazzein expression: L. lactis NZ9000 harbouring plasmid pNZ8148, and L. lactis IL1403 harbouring plasmid pMSP3545. The former combination proved superior, with a >800-fold increase in His-tagged brazzein expression (to 1·65 mg l⁻¹ of fermentation broth), comparable to expression levels in Escherichia coli . Improved expression resulted in a minor increase in secretion to the medium with the use of the Usp45 signal peptide. The yield of wild-type brazzein corresponded to that of His-tagged brazzein. Wild-type brazzein was partially soluble and low-intensity sweetness was detected.
Conclusions:  The plasmid/strain combination of the NICE system has a significant impact on the expression of brazzein where a >800-fold increase was achieved. The greatly increased expression of brazzein resulted in minor improvement in secretion and low-intensity sweetness.
Significance and Impact of the Study:  The choice of the plasmid/strain combination of the NICE system was shown to be of extreme importance in brazzein expression.     

谷胱甘肽/谷胱甘肽过氧化物酶系统在微生物细胞抗氧胁迫系统中的作用

谷胱甘肽(GSH)/谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)系统在不同微生物细胞抵抗氧胁迫中的生理功能不尽相同。该系统在真核模式微生物酿酒酵母中是必需存在的,在维持胞内氧化还原平衡和抵抗氧胁迫中发挥主要作用。然而,在原核微生物中,该系统只是条件性的,即部分胞内存在谷胱甘肽还原酶和GPx的原核微生物,如流感嗜血杆菌和乳酸乳球菌,可通过从胞外吸收GSH,形成条件性的依赖于GSH的GPx系统,参与抵抗氧胁迫。