丙型肝炎病毒核心蛋白对转录因子的调控作用

丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白是HCV病毒粒子核衣壳的组分,同时又是一种多功能蛋白。它能与胞内多种蛋白相互作用,调控NF-κB、AP-1、Sp1、Elk-1、STAT3、ATF-2、NF-AT等多种转录因子,影响一系列基因的表达。核心蛋白在HCV感染的病理发生和慢性化及致癌等过程中起着重要作用。     

新发现的丙型肝炎病毒核心蛋白

近年来,有关新的丙型肝炎病毒核心基因及其编码产物的研究时有报道.与丙型肝炎病毒传统单一阅读框架翻译的病毒蛋白不同,新的核心C蛋白是由该病毒核心蛋白基因阅读框架序列+1移位后翻译产生的.新型C蛋白普遍存在于各个丙型肝炎病毒基因型中,约40%及 20%病毒感染者体内可检测到针对新型C蛋白的抗体和细胞免疫反应.在丙型肝炎病毒感染所致的肝癌患者中,新型C蛋白的表达量增高.新型C蛋白被认为可能与HCV感染慢性化和肝癌有关.     

丙型肝炎病毒核心蛋白抑制乙型肝炎病毒转录的分子机理

为研究丙型肝炎病毒 (HCV)核心蛋白抑制乙型肝炎病毒 (HBV)表达的分子机理 ,从HCV和HBV共感染中国病人血清中分离了 5个含HCV 5′非编码区 ( 5′NCR)和核心区 (CR)cDNA序列的克隆 .序列比较和系统发育分析显示 :从共感染病例中分离的HCV序列与其它已发表的从单独HCV感染病例中分离的序列没有显著差异 .共转染实验证实采用从其中 1例共感染病人中分离的核心蛋白cDNA基因所表达的核心蛋白 ,可抑制HBV表面抗原 (HBsAg)和HBVe抗原 (HBeAg)的表达 ,缺失突变分析说明HCV核心蛋白的C端疏水区对这种抑制作用是必需的 ,报道基因产物分析进一步说明了HBVC启动子和增强子Ⅱ是HCV核心蛋白的效应靶序列之一 ,而HCV核心蛋白在肝细胞和非肝细胞中均对HBV和其他细胞和病毒的基因的转录起负调节作用 .因此 ,认为HCV核心蛋白是一种多功能的负调节因子 ,与HCV和HBV以及HCV与细胞之间的相互作用密切相关     

猪丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白6同源基因的克隆化研究

利用不同种属动物之间重要基因序列高度同源的理论,应用分子生物学与生物信息学技术和方法。克隆猪丙型肝炎病毒(HCY)核心蛋白结合蛋白6(HCBP6)的同源基因。首先应用酵母双杂交技术,以表达HCV核心蛋白的表达栽体作为曾饵,对于百万级的肝细胞cDNA文库酵母进行配合、筛选,首先获得人HCBP6的全长鳊码基因。然后应用美国国立生物工程中心(NCBI)建立的核苷酸序列数据库(CenBank)的同源基因的检索,搜索与之同源的来源于猪的表达序列标签(EST)。然后根据基因同泺性的原则,确定猪HCBP6的同源基因。获得了与HCC核心蛋白结合蛋白的36个基因片段,其中之一命名为HCBP6。根据基因同源性搜索,获得了来源于猪的EST基因序列片段。最终确立了猪HCBP6的同源基因。利用不同物种之间基因同泺性的原理、NCBI数据库GenBank同源基因的搜索,获得了猪HCBP6同源基因。生物信息学技术在后基因组时代具有重要地位和作用。     

丙型肝炎病毒核心蛋白在大肠杆菌和毕赤酵母中表达的比较

为获得丙型肝炎病毒的核心蛋白（Core）,将克隆有Core基因的表达载体pBVIL1-Core转化大肠杆菌HB101,温度诱导表达Core蛋白。同时利用PCR方法以含有丙型肝炎病毒全基因的质粒PBR^TM／HCV为模板扩增Core基因,克隆进表达载体pPICZαA,构建表达载体pPICZαA-Core,转化毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115,在甲醇诱导下表达Core蛋白。Western-blot显示Core蛋白在大肠杆菌中高效表达,表达蛋白量占菌体总蛋白的20％;在酵母培养上清中存在Core蛋白,证明Core蛋白在酵母系统中成功表达。     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因在毕赤酵母中克隆与分析

目的:克隆丙型肝炎病毒核心蛋白基因及其上游DNA序列,为此基因的表达研究作准备。方法:用反转录和PCR方法从HCV的总RNA中扩增得到核心蛋白基因及其上游DNA序列,连接到pMD18-T载体上,用限制性内切酶切下目的基因,插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建成重组质粒,测序证明正确后,再将目的基因在毕赤酵母中进行克隆,鉴定。结果:重组质粒转化毕赤酵母后,经PCR鉴定,证明形成了目的基因的克隆。结论:应用毕赤酵母作为受体菌,pPIC9K为载体,成功克隆了HCV核心蛋白基因。     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因在大肠杆菌内的表达及应用

将从中国丙肝病人血清中扩增克隆的丙型肝炎病毒核心蛋白基因（４０８ｂｐ）酶切处理后插入表达载体ｐＪＬＡ５０２内,获得高表达核心蛋白的重组工程菌。将重组菌经４２℃热诱导５ｈ,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明,表达的核心蛋白占菌体蛋白总量的２０％。经分子筛和吸附层析纯化后获得的核心蛋白,ＥＬＩＳＡ检测证实有较好的抗原性和特异性。用表达的核心抗原加用表达的ＮＳ＿３抗原（Ｃ＿３３）装配的抗－ＨＣＶ试剂盒,经用标准血清验证及与国外第二代抗－ＨＣＶ试剂盒比较,证实符合丙肝诊断试剂要求。     

丙型肝炎病毒基因分型及core蛋白区的分子演化分析

目前有多种方法对丙型肝炎病毒进行基因分型,但尚无一个“金标准”．为确定丙型肝炎病毒基因分型的最佳区域,从GenBank中筛选出15条对各成熟肽区域有注释,来源于不同国家地区的丙型肝炎病毒全基因组序列,分别对5′UTR区、core区、E1区、E2区及NS5B区建系统进化树．结果发现,以5′UTR区建树基因分型不完全正确,而以core区、E1区、E2区及NS5B区建树,基因分型均完全正确,但同一基因型间的核苷酸演化距离存在差异．计算5条1a型序列的core区、E1区、E2区、NS5B区的核苷酸演化距离并和全基因组序列核苷酸演化距离比较,结果发现,NS5B蛋白区基因分型最能反映病毒株间的演化关系．同时分析各序列的core区的分子演化,为发明针对core区的新的PCR-RFLP基因分型方法提供新思路．     

PD-1核心启动子的获得及活性鉴定

目的:构建PD-1(programmed death receptor 1)全长启动子及不同截短体的报告基因,并对其转录活性进行检测。方法:通过PCR及双酶切方法,从人全血基因组DNA中获得PD-1基因编码序列,包含不同长度碱基的PD-1启动子序列,分别克隆到报告基因pGL3-Basic载体上,构建8个不同长度PD-1启动子的报告基因;用脂质体转染法将8个报告基因分别转染至Jurkat细胞系;采用双萤光素酶报告基因系统评估PD-1启动子的活性。结果:经PCR方法扩增出大小分别为1650、1450、1250、1128、874、674、474和274 bp的不同长度的PD-1启动子序列,测序正确(与GenBank报道一致),酶切鉴定正确;瞬时转染Jurkat细胞系后经报告基因检测,8个启动子均具有转录活性。结论:构建了PD-1启动子的报告基因,并证实均有转录活性,且以pGL3-1128活性最高,为PD-1的核心启动子,为进一步研究PD-1的转录调控奠定了实验基础。     

丙型肝炎病毒核心基因置换对病毒复制和感染影响的初步研究

本文旨在探讨丙型肝炎病毒(HCV)核心(core)蛋白在病毒复制和感染中的作用,采取基因置换的方法,用HCV1b型J4株的核心基因平行置换2a型J6JFH1株的核心区,构建了FL-J6JFH/J4core嵌合复制子。体外制备RNA转录体,以脂质体介导转染Huh7.5.1肝癌细胞。转染后第5天,用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测细胞内HCVRNA水平。第8天,以丙型肝炎患者血清为一抗,免疫荧光法(IFA)检测转染细胞内HCV蛋白表达。同时收集转染后第8天的细胞上清液,感染naveHuh7.5.1肝癌细胞,72h后IFA检测HCV蛋白表达。结果显示,FL-J6JFH/J4core转染组第5天细胞内RNA水平与野生型FL-J6JFH1接近,无显著差异(n=4,P0.05)。免疫荧光检测显示,FL-J6JFH/J4core转染细胞后第8天及其上清液感染的naveHuh7.5.1细胞的HCV阳性细胞数都低于野生型。本研究结果初步表明,HCV各株间核心基因的替换会影响HCV的蛋白翻译和感染性病毒颗粒的产生与释放。     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因的克隆与表达

以含有丙型肝炎病毒核心蛋白基因的质粒pJLA502-C为模板,用PCR方法重新扩增克隆了核心蛋白基因,在扩增基因的上下端分别增加了NCOⅠ及SalⅠ酶切位点。将克隆的基因酶切后插入表达载体pBV221内,转化大肠肝菌DH_(5α),获得表达非融合核心蛋白的工程菌,42℃热诱导5hr,表达蛋白占菌体蛋白总量的15％。经包涵体纯化及分子筛纯化等,获得核心蛋白,经ELISA及Western Blotting分析表明有较好的抗原性和特异性。     

绿色荧光蛋白与 HCV 核心蛋白的融合及在大肠杆菌中的高效表达

利用基因工程重组技术获得了绿色荧光蛋白（ｇｆｐ）基因与ＨＣＶ核心蛋白基因的嵌合体,并在大肠杆菌中高效表达了４８ｋＤａ的融合蛋白,经Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ免疫活性分析证实,融合蛋白仍具有ｃｏｒｅ抗原的三个免疫活性部位,同时用荧光显微镜观察并用荧光光度计测定了大肠直菌表达的融合蛋白的荧光光谱,结果证实,我们在大肠杆菌中表达的ＧＦＰ－ｃｏｒｅ融合蛋白既能发射易于检测的绿色荧光,又具     

构建基于折叠核心的全α类蛋白取代矩阵

氨基酸残基取代矩阵是影响多序列比对效果的重要因素,现有的取代矩阵对低相似序列的比对性能较低.在已有的 BLOSUM 取代矩阵算法基础上,定义了基于蛋白质折叠核心结构的序列 结构数据块;提出一种新的基于全α类蛋白质折叠核心结构的氨基酸残基取代矩阵——TOPSSUM25,用于提高低相似度序列的比对效果.将矩阵TOPSSUM25导入多序列比对程序,对相似性小于25%的一组四螺旋束序列 结构数据块的测试结果表明,基于 TOPSSUM25的多序列比对效果明显优于BLOSUM30矩阵;基于一个BAliBASE子集的比对检验也进一步表明, TOPSSUM25在全α类蛋白质的两两序列比对上优于BLOSUM30矩阵.研究结果可为进一步的阐明低同源蛋白质序列 结构 功能关系提供帮助.     

重组PAI－2对肿瘤细胞降解细胞外基质的影响

重组ＰＡＩ－２对肿瘤细胞降解细胞外基质的影响曹祥荣（南京师范大学生物系,２１００２４）关键词纤溶酶原激活剂抑制剂－２,基因重组,细胞外基质降解肿瘤细胞转移过程中最重要的因素是肿瘤细胞侵袭能力,其生化过程即为细胞外基质（ＥＯＭ）降解作用。纤溶酶系统（纤...     

半椎蛋白的生物学作用及其与人类疾病的关系

半椎蛋白作为一种细胞外基质蛋白质,在细胞的生长、分化、迁移以及细胞与基底膜的稳定接触中发挥非常重要的作用。线虫、小鼠等多种动物模型的研究发现:该蛋白质参与稳定细胞有丝分裂时出现的分裂沟、促进胞浆的正常分裂,并且是一种细胞黏附体系B-LINK的重要组成部分;调控新生小鼠心室心肌成纤维细胞对TGF-β信号的反应。多项研究表明,该蛋白质参与到多种人类疾病的发生发展之中,包括舍格伦综合症、年龄相关性黄斑变性、心血管疾病、肾疾病和胰岛瘤。本文主要就该胞外基质蛋白质的生物学作用,以及与人类疾病关系的相关研究进展进行综述。     

用细菌/杆状病毒系统在昆虫细胞中表达GFP与HCV抗原融合蛋白

用细菌／杆状病毒（Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃ）系统在昆虫细胞中高效表达了绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）与ＨＣＶ抗原的双功能融合蛋白,经ＥＬＩＳＡ测定和荧光显微镜观查证实,表达产物既能发射易于检测的绿色荧光,又具有ＨＣＶ的抗原活性,实现了用绿色荧光蛋白等分子标记抗原,为免疫诊断新方法的建立打下了理论基础．     

A Recombinant Matrix Metalloproteinase Protein from Gnathostoma spinigerum for Serodiagnosis of Neurognathostomiasis

Neurognathostomiasis is a severe form of human gnathostomiasis which can lead to disease and death. Diagnosis of neurognathostomiasis is made presumptively by using clinical manifestations. Immunoblotting, which recognizes antigenic components of molecular mass 21 kDa and 24 kDa in larval extracts of Gnathostoma spinigerum (Gs 21/24), has high sensitivity and specificity for diagnosis of neurognathostomiasis. However, only very small amounts of the Gs 21/24 antigens can be prepared from parasites harvested from natural or experimental animals. To overcome this problem, we recently produced a recombinant matrix metalloproteinase (rMMP) protein from G. spinigerum. In this study, we evaluated this rMMP alongside the Gs 21/24 antigens for serodiagnosis of human neurognathostomiasis. We studied sera from 40 patients from Srinagarind Hospital, Khon Kaen University, Thailand, with clinical criteria consistent with those of neurognathostomiasis, and sera from 30 healthy control adults from Thailand. All sera were tested for specific IgG antibodies against both G. spinigerum crude larval extract and rMMP protein using immunoblot analysis. The sensitivity and specificity for both antigenic preparations were all 100%. These results show that G. spinigerum rMMP protein can be used as an alternative diagnostic antigen, in place of larval extract, for serodiagnosis of neurognathostomiasis.