紫贻贝(Mytilus edulis)血淋巴液乙酰胆碱酯酶的性质研究

紫贻贝(Mytilus edulis)血淋巴液乙酰胆碱酯酶是溶解状态的酶。我们制备了四种接有不同配位基或手臂的亲和凝胶,对酶的亲和层析行为作了比较。结果表明,不仅配位基的性质对酶的结合有关,而且手臂的疏水性质也影响酶的结合。用N-甲基吖啶为配位基的凝胶将粗酶制剂纯化了480倍。该酶对碘化硫代乙酰胆碱的米氏常数Km为6.8×10~(-5)M,对抑制剂BW284C51的可逆抑制常数Ks为1.03×10~(-5)M,过量底物使酶活力受到抑制。另外,我们还初步观察到不同季节的材料,其酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离图谱有所差异。     

乙酰胆碱酯酶的别构作用——某些胆碱能效应剂与钙离子激活作用的关系

钙离子对纯化的黄姑鱼肌肉乙酰胆碱酯酶的激活作用是依赖于底物浓度的。在钙离子存在时,表现最高活力的底物浓度在0.3mM 左右,随着底物浓度的增高,激活作用消失。钙离子与酶结合作用的表观解离常数为6×10~(-4)M 左右。钙离子浓度的增加并不解除底物对钙离子激活作用的抑制,表明钙离子似不可能结合在酶的外周底物结合部位。非竞争性抑制剂箭毒,在酶的外周阴离子部位有表现不同亲和力的两种结合作用,只有其中高亲和力的抑制作用为钙离子解除。在箭毒接近全抑制酶活性以后,再增加箭毒浓度,钙离子仍表现竞争作用。箭毒对酶的两种不同的抑制作用皆为底物所解除。竞争性与非竞争性混合类型抑制剂十甲鎓及1,5-双-(4-三甲铵苯)戍酮-3的抑制作用部份地为钙离子解除。讨论了包括钙离子及硫代丁酰胆碱、箭毒、十甲鎓、1,5-双(4-三甲铵苯)戊酮-3、季铵酚和六甲鎓在内的多种胆碱能配基在酶上三类部位的结合及配基间的相互作用。     

乙酰胆碱酯酶的别构作用——某些胆碱能效应剂与钙离子激活作用的关系

钙离子对纯化的黄姑鱼肌肉乙酰胆碱酯酶的激活作用是依赖于底物浓度的。在钙离子存在时,表现最高活力的底物浓度在0.3mM左右,随着底物浓度的增高,激活作用消失。钙离子与酶结合作用的表观解离常数为6×10~(-4)M左右。钙离子浓度的增加并不解除底物对钙离子激活作用的抑制,表明钙离子似不可能结合在酶的外周底物结合部位。非竞争性抑制剂箭毒,在酶的外周阴离子部位有表现不同亲和力的两种结合作用,只有其中高亲和力的抑制作用为钙离子解除。在箭毒接近全抑制酶活性以后,再增加箭毒浓度,钙离子仍表现竞争作用。箭毒对酶的两种不同的抑制作用皆为底物所解除。竞争性与非竞争性混合类型抑制剂十甲鎓及1,5-双-(4-三甲铵苯)戊酮-3的抑制作用部份地为钙离子解除。讨论了包括钙离子及硫代丁酰胆碱、箭毒、十甲鎓、1,5-双(4-三甲铵苯)戊酮-3、季铵酚和六甲鎓在内的多种胆碱能配基在酶上三类部位的结合及配基间的相互作用。     

乙酰胆碱酯酶的别构作用:两类胆碱能配基在外周阴离子部位的颉颃

纯化的黄姑鱼肌肉乙酰胆碱酯酶,在低离子强度介质中,底物(硫代丁酰胆碱)浓度和活性的关系符合Michaelis方程。底物在外周阴离子部位的结合不抑制酶活性。然而,底物按Kss值(底物在外周结合作用的解离常数)解除箭毒和阿托品对酶的纯非竞争性抑制作用。与箭毒类似的胆碱能配基还有1,5-双-(4-三甲铵苯)戍酮-3及十甲鎓。但它们对酶的催化阴离子部位也有很高的亲和力。我们测定了它们作用于酶上两类部位的抑制常数。另一类胆碱能配基,包括硫代丁酰胆碱、乙酰胆碱、苯酰胆碱、间-三甲铵酚、烟碱、六甲鎓和季铵酚,除了它们在酶的催化阴离子部位有较高的亲和力外,也结合于外周部位,并表现为解除箭毒抑制的颉颃作用。其中某些化合物在外周结合后也有别构激活作用。从这些结果能假定,酶至少可存在三种构象状态。讨论了乙酰胆碱酯酶和乙酰胆碱受体的某些相似性。     

乙酰胆碱酯酶的别构作用:两类胆碱能配基在外周阴离子部位的颉颃

纯化的黄姑鱼肌肉乙酰胆碱酯酶,在低离子强度介质中,底物(硫代丁酰胆碱)浓度和活性的关系符合Michaelis 方程。底物在外周阴离子部位的结合不抑制酶活性。然而,底物按Kss 值(底物在外周结合作用的解离常数)解除箭毒和阿托品对酶的纯非竞争性抑制作用。与箭毒类似的胆碱能配基还有1,5-双-(4-三甲铵苯)戊酮-3及十甲鎓。但它们对酶的催化阴离子部位也有很高的亲和力。我们测定了它们作用于酶上两类部位的抑制常数。另一类胆碱能配基,包括硫代丁酰胆碱、乙酰胆碱、苯酰胆碱、间-三甲铵酚、烟碱、六甲鎓和季铵酚,除了它们在酶的催化阴离子部位有较高的亲和力外,也结合于外周部位,并表现为解除箭毒抑制的颉颃作用。其中某些化合物在外周结合后也有别构激活作用。从这些结果能假定,酶至少可存在三种构象状态。讨论了乙酰胆碱酯酶和乙酰胆碱受体的某些相似性。     

尖镰孢青霉素V酰化酶的纯化及性质

通过硫酸铵沉淀、硅藻土吸附、DEAD-纤维素离子交换层析和Sephadex G-200凝胶过滤,由尖镰孢(Fusarium oxysporum)FP941培养滤液中得到了聚丙烯酰胺凝胶电泳均一的青霉素V酰化酶。酶作用最适pH为7.0,最适温度为50℃。酶在pH6.0—8.0和42℃以下稳定。酶作用青霉素V的米氏常数Km为4.65×10~(-3)mol/L;苯氧乙酸是酶的竞争性抑制剂,抑制常数Ki为23.87×10~(-3)mol/L;6-氨基青霉烷酸是酶的非竞争性抑制剂,抑制常数Ki为30.01×10~(-3)mol/L。某些金属离子对酶有抑制作用,Fe~(2+)最强,其次是Hg~(2+)和Cu~(2+)。用SDS凝胶电泳测定酶亚基分子量为77600;用分子筛测定自然酶分子量为148000。     

Bam HI DNA甲基化酶酶学性质的研究

以Lineweave-Burk plot双倒数作图法测得该酶对底物S-腺苷酰甲硫氨酸(SAM)的K_m=7.69×10~(-6)mol/L,在1mmol/LS-腺苷酰高半胱氨酸(SAH)存在下,Ki=7.33×10~(-4)mol/L,两条直线相交于纵轴,证明SAH是该酶的竞争性抑制剂。该酶最适pH为7.8,对热不稳定。同时还测定了该酶对不同DNA底物的专一性及盐浓度、代谢相关物’两价阳离子、某些酸根等对该酶调节性质的影响。以碘代乙酰胺修饰该酶的SH基’及用二硫苏糖醇(DTT)和巯基乙醇(MSH)保护该酶SH基所作的实验表明SH基是该酶活性中心所必需的,用高效液相色谱(HPLC)法证明该酶所甲基化的碱基为刘氏小球菌(M·L、DNA)分子中的胞嘧啶,且求得甲基化30min后所得甲基化水平为2.39％。同时也证明当用该酶将λDNA甲基化后,可使BamHI限制性核酸内切酶对甲基化后的λDNA丧失切割作用。     

浙江产眼镜蛇毒胆碱酯酶的研究——Ⅰ.酶的纯化

用亲和层析法纯化眼镜蛇毒胆碱酯酶440倍左右,比活力达到203毫克分子底物水解/小时/毫克蛋白。亲和吸附剂的制备是以琼脂糖凝胶4B 为载体,己二胺为“手臂”,(间-羧基苯基)-二甲基乙基碘化铵为配基制成,不同长度的“手臂”对酶的吸附有影响,疏水性强的“手臂”对酶的吸附也强。在纯化过程中,胆碱酯酶在凝胶电泳中始终保持6条条带,可能是它的同工酶。兔抗眼镜蛇蛇毒血清对猪脑尾状核乙酰胆碱酯酶、黄姑鱼肌肉胆碱酯酶无免疫交叉反应,对蛇毒胆碱酯酶形成络合物后仍能表现胆碱酯酶的活力,说明酶的抗原决定簇和活性中心不在同一部位。     

浙江产眼镜蛇毒胆碱酯酶的研究——Ⅰ.酶的纯化

用亲和层析法纯化眼镜蛇毒胆碱酯酶440倍左右,比活力达到203毫克分子底物水解/小时/毫克蛋白。亲和吸附剂的制备是以琼脂糖凝胶4B为载体,己二胺为“手臂”,(间-羧基苯基)-二甲基乙基碘化铵为配基制成,不同长度的“手臂”对酶的吸附有影响,疏水性强的“手臂”对酶的吸附也强。在纯化过程中,胆碱酯酶在凝胶电泳中始终保持6条条带,可能是它的同工酶。兔抗眼镜蛇蛇毒血清对猪脑尾状核乙酰胆碱酯酶、黄姑鱼肌肉胆碱酯酶无免疫交叉反应,对蛇毒胆碱酯酶形成络合物后仍能表现胆碱酯酶的活力,说明酶的抗原决定簇和活性中心不在同一部位。     

关于光合作用光系统Ⅱ(PS-Ⅱ)电子传递的研究

在菠菜叶绿体和光系统Ⅱ颗粒中,DCIP和铁氰化钾的光还原对DCMU或Tris洗涤的抑制作用反应不同,其影响取决于pH(Tris)和浓度(DCMU)。在Tris的pH为8.0时,叶绿体和光系统Ⅱ颗粒的DCIP光还原全部被Tris(0.8M)洗涤抑制,而仍保留有少量残留的铁氰化钾光还原活力。在正常的叶绿体中,DCMU在5×10~(-5)M和5×10~(-4)M的浓度下,DCIP的光还原活力全部丧失,而铁氰化钾的光还原活力分别保留11.5％和10.8％。用Tris洗过的叶绿体,当DCIP的光还原活力被5×10~(-6)M,5×10~(-5)M和5×10~(-4)M的DCMU全部抑制时,铁氰化钾的光还原活力分别保留有对照的14.l％,15.0％和13.5％。在正常的光系统Ⅱ颗粒中,DCIP的光还原全部被5×10~(-6)M和5×10~(-5)M的DCMU抑制,而分别保留有13.8％和11.7％残留的铁氰化钾的光还原活力。用Tris(pH 7.6,0.8M)洗涤过的光系统Ⅱ颗粒,在5×10~(-7)M和5×10~(-6)M DCMU浓度下,残留的铁氰化钾光还原活力是26.2％和19.2％,而DCIP的光还原全部被抑制。 Tris洗涤过的或DCMU处理过的叶绿体和光系统Ⅱ颗粒残留的铁氰化钾光还原活力在短波光(651毫微米)下比在长波光(714毫微米)下高。讨论了光系统Ⅱ中可能包含有两个短波光反应。     

苦荞胰蛋白酶抑制剂的纯化及特性研究

利用固相胰蛋白酶亲和色谱及离子交换色谱,从苦荞种子中分离纯化了三个具有抑制胰蛋白酶活力的组份(BTI-Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ)。经聚丙稀酰胺凝胶等电聚焦测定,三种抑制剂的等电点为6.87,6.7,5.14。根据Sephadex G-75凝胶过滤,SDS-PAGE测定,以及由当量抑制比值和氨基酸组份的推算,它们的分子量范围分别为5200-5700(Ⅰ),5500—6000(Ⅱ),5000—5600(III)。三者对胰蛋白酶的抑制常数分别为2.12×10~(-8),4.78×10~(-9),1.22×10~(-8)。氨基酸分析结果表明,它们均含有很高的极性氨基酸。在酸性条件下,它们均具有很高的热稳定性。化学修饰的结果表明,它们活性中心的氨基酸残基为Lys。     

γ射线对红细胞嘌呤核苷磷酸化酶的影响 二、酶的某些性质

正常大鼠和小鼠、经700或1000拉德照射的大鼠和小鼠,纯化它们的红细胞嘌岭核苷磷酸化酶,并研究酶的某些性质。主要结果如下: 1.在纯化过程中,从DEAE-纤维素柱梯度洗脱大鼠酶时,收集管中酶活力高峰相当Tris-醋酸盐缓冲液浓度0.107±0.003M,而在同样实验条件下,洗脱小鼠酶时酶活力高峰却相当0.213±0.010M。2.大鼠酶反应的Q_(10)小于小鼠酶,但是其米氏常数高于后者。整体照射可使大鼠酶反应的Q_(10)与米氏常数增加,但对于小鼠酶反应的Q_(10)与米氏常数没有影响。3.对氯汞苯甲酸或二氯化汞可抑制红细胞嘌呤核苷磷酸化酶活力,但辐射对酶活力的抑制曲线无显著影响。4.大鼠酶与小鼠酶在聚丙烯酰胺凝胶电泳中相对迁移率是不同的,因而它们的电泳图谱也有差异。整体照射对大鼠酶与小鼠酶在电泳中的相对迁移率无显著影响。5.将大鼠酶与小鼠酶的相对迁移率对数与凝胶浓度作图,可得到两条平行的直线。这表明两种酶的分子量相同,而其净电荷却有明显的差异。以上结果说明,大鼠与小鼠的红细胞嘌呤核苷磷酸化酶不是性质相同的酶。电离辐射可使大鼠酶反应的Q_(10)与表观米氏常数增加,而对小鼠酶却无影响。前者反映酶的结构发生了变化,而后者的结构没有改变。     

芹菜素抑制α-葡萄糖苷酶的分子机制研究

[目的]分析芹菜素对α-葡萄糖苷酶的抑制作用类型,并探讨其抑制的分子作用机制。[方法]采用Lineweaver-Burk双倒数方程,分析芹菜素对α-葡萄糖苷酶的抑制作用类型;荧光光谱和分子对接阐述芹菜素抑制α-葡萄糖苷酶的分子作用机制。[结果]芹菜素对α-葡萄糖苷酶的抑制类型为竞争型抑制,抑制常数Ki=12.08μg/m L。芹菜素和α-葡萄糖苷酶的结合导致酶分子的内在荧光静态猝灭,不同温度(298 K、304 K、310 K)条件下荧光猝灭常数KA分别为0.859 4×104、0.617 7×104、0.486 5×104L/mol。酶分子中Tyr158、Ser240、Pro312、Phe314和Asn415等氨基酸残基为芹菜素与其结合的重要活性位点,芹菜素的A环5-OH和7-OH、B环4'-OH结构对其抑制活性起到关键作用。[结论]芹菜素是α-葡萄糖苷酶的竞争性抑制剂,疏水作用力和氢键是其与酶分子间的主要作用力。     

产气气杆菌茁霉多糖酶的研究II．化学试剂对酶活力的影响

研究了某些化学试剂对产气气杆菌 Aerobacter aerogenes 的茁霉多糖酶 (Pullulanase EC3.2.1.41)活力的影响。Hg2+,Cu2+,Al3+,Fe3+等金属离子对酶活力有强烈的抑制作用,Ca2+,Mg2+有激活作用。1×10-3M的β-环状糊精完全抑制酶的活力,是竞争性抑制剂,其抑制常数Ki为0．55×10-5M。8M尿素,1.0M的盐酸胍,0.5％的SDS等蛋白质变性剂导致酶活力的完全丧失,在反应体系中有5×10-4M的Ca2+时,对酶有明显的保护作用。色氨酸残基的专一性修饰剂N-溴代琥珀酰亚胺(简称NBS)在1×10-4M的浓度下使酶活力完全丧失,甚至在1×10-5M的浓度下,只保留9％的活力,酶液在用NBS处理前加入不同浓度的底物,对活力有明显的保护作用,表明色氨酸残基对于茁霉多糖酶的活力是十分重要的。     

蚕氨基酸代谢之研究 Ⅱ.比较家蚕和野蚕谷氨酰胺酶及天门冬酰胺酶,蓖麻蚕丝腺体中天门冬酰胺酶之提取及其性质之研究

(1)比較家蚕(华九-云瀚)和野蚕(萞麻蚕、柞蚕和樗蚕)之谷氨酰胺酶及天門冬酰胺酶之活力,发現在萞麻蚕絲腺体后部之細胞顆粒部分中,存在有活力甚強之天門冬酰胺酶。(2)自萞麻蚕絲腺体后部提取之天門冬酰胺酶制品中,不含有谷丙轉氨酶、谷天轉氨酶及谷氨酰胺酶。(3)L-天門冬酰胺之酶促水解作用在1小时过程中,活力和作用时間基本土表現直线关系。(4)萞麻蚕絲腺体后部之天門冬酰胺酶和哺乳类动物、植物及微生物之pH影响相同;在pH5以下不稳定,最适pH为8。(5)天門冬酰胺酶对热不稳定,先以不同温度和酶溶液作用10分钟,60℃时,活力丧失80%左右。(6)对氯汞苯甲酸(10~(-4)M)抑制天門冬酰胺酶20%,溴化乙酰胺(10~(-3)M)及DL-环絲氨酸(10~(-3)M)抑制15%。     

重组人脑乙酰胆碱酯酶的基因表达和生化毒理学性质

人脑乙酰胆碱酯酶的全长cDNA序列克隆到真核高效表达载体pcDNA3.1中 ,并将pcDNA AChE转染人胚肾细胞株 2 93细胞 ,进行rhAChE的暂时表达 .真核细胞表达的rhAChE的生化性质与天然人脑AChE十分相似 .rhAChE的Km 值约为 137μmol L ;有过量底物抑制现象 ;可被胆碱酯酶抑制剂huperzineA和eserine抑制 (IC50 分别为 2 5× 10 -8mol L和 1 0× 10 -7mol L) ;肟类化合物HI 6 (10 -4 mol L)可以有效地重活化被sarin(10 -6mol L及 10 -7mol L)抑制的rhAChE ,4h内重活化率分别达 86 %和 97% .rhAChE反复冻融 3次 ,酶活性没有损失 .     

三种双季铵化合物对乙酰胆碱酯酶梭曼膦酰化和老化的影响

本文研究了六甲溴铵(C_6)、十甲溴铵(C_(10))和百草枯(paraquat或PQ)对电鳐电器官乙酰胆碱酯酶的作用。C_6是酶的完全竞争性抑制剂,它对梭曼膦酰化酶的老化反应有明显的延缓作用;C_(10)对酶的抑制分为两相,A相为完全竞争性抑制,B相为混合型抑制,它对老化只有轻微的延缓作用;PQ为酶的激活剂,而它对老化几乎无影响。概据这些结果可以设想,酶的活性区域的阴离子部位在梭曼膦酰化乙酰胆碱酯酶的老化中起重要作用。     

蛇肌果糖-1,6-二磷酸酯酶的别构部位

比较蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶的别构抑制剂AMP和它的类似物对该酶的抑制作用的结果表引,5′-AMP的嘌呤环上6位氨基以及核糖上5′磷酸基团是抑制剂和别构部位结合所必需的。8-BrAMP和5′-AMP具有相似的抑制能力,表明嘌呤环上的咪唑部分对于AMP的抑制作用贡献不大。5′-d-AMP对蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶的抑制作用比较特殊,按照50%抑制该酶时的抑制剂浓度计算,得到的抑制常数为3×10~(-6)M,其数值和5′-AMP的抑制常数接近。但是当抑制剂浓度增大时所能达到的最大抑制程度只有60%左右。表明5′-dAMP和5′-AMP结合后,对果糖1,6-二磷酸酯酶的催化部位的影响不同,2′羟基和酶的结合可能和别构部位的信号传导到催化部位有关系。被水溶性羰二亚胺修饰的蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶受5′-AMP的抑制作用和5′-dAMP的抑制作用相似,推测这个传导变构部位的信息到催化部位去的基团有可能和羧基有关。     

浙江产眼镜蛇蛇毒胆碱酯酶的研究 Ⅱ.酶学性质与生物毒性

浙江眼镜蛇蛇毒胆碱酯酶具有乙酰胆碱酯酶的特征,有以下几点事实:1.乙酰胆碱酯是酶的最适底物;2.过量底物抑制酶活性;3.BW_(62)C_(47)、BW_(284)C_(51)是典型的真性酶抑制剂,对蛇毒胆碱酯酶也同样具有抑制作用。眼镜蛇蛇毒胆碱酯酶最适pH为7.5(0.1M磷酸缓冲液)。反应5分钟时的最适温度在38～39℃,K_m值是1.25×10~(-4)M。稀酶溶液不稳定,在0.1%白明胶中可保护酶活力。原蛇毒和纯化后的胆碱酯酶的底物抑制图形和K_m值是类似的,这说明纯化过程中酶没有矫变。蛇毒中的胆碱酯酶被多种有机磷化合物如二异丙基磷酰氟、敌敌畏、对氧磷所抑制。一些氨基甲酸酯和含季铵盐的化合物也表现有抑制。浙江眼镜蛇毒有较大的毒性,小白鼠腹腔注射最小致死剂量是0.88微克/克,用亲和层析分离除去胆碱酯酶后仍保留有蛇毒的毒性,最小致死剂量是0.77微克/克,纯化的胆碱酯酶含7.5微克/克蛋白,动物未致死,说明蛇毒的主要毒性并不是胆碱酯酶。     

浙江产眼镜蛇蛇毒胆碱酯酶的研究——Ⅱ.酶学性质与生物毒性

浙江眼镜蛇蛇毒胆碱酯酶具有乙酰胆碱酯酶的特征,有以下几点事实:1.乙酰胆碱酯是酶的最适底物;2.过量底物抑制酶活性;3.BW_(62)C_(47)、BW_(284)C_(51)是典型的真性酶抑制剂,对蛇毒胆碱酯酶也同样具有抑制作用。眼镜蛇蛇毒胆碱酯酶最适pH 为7.5(0.1M 磷酸缓冲液)。反应5分钟时的最适温度在38～39℃,K_m 值是1.25×10~(-4)M。稀酶溶液不稳定,在0.1%白明胶中可保护酶活力。原蛇毒和纯化后的胆碱酯酶的底物抑制图形和K_m 值是类似的,这说明纯化过程中酶没有矫变。蛇毒中的胆碱酯酶被多种有机磷化合物如二异丙基磷酰氟、敌敌畏、对氧磷所抑制。一些氨基甲酸酯和含季铵盐的化合物也表现有抑制。浙江眼镜蛇毒有较大的毒性,小白鼠腹腔注射最小致死剂量是0.88微克/克,用亲和层析分离除去胆碱酯酶后仍保留有蛇毒的毒性,最小致死剂量是0.77微克/克,纯化的胆碱酯酶含7.5微克/克蛋白,动物未致死,说明蛇毒的主要毒性并不是胆碱酯酶。