鼻咽癌下调新基因NOR1相互作用蛋白的筛选和鉴定

NOR1基因是新的鼻咽癌相关基因,该基因在鼻咽癌细胞系HNE1和鼻咽癌组织中表达下调．在鼻咽癌细胞HNE1中恢复NOR1基因表达抑制了鼻咽癌细胞的生长和增殖能力．为了探讨NOR1基因的生物学功能,以NOR1基因为诱饵运用酵母双杂交技术在人胎脑文库中筛选其交互作用蛋白,挑选阳性克隆,进行DNA序列分析和同源检索,阳性克隆编码7个不同的蛋白质,其中一个阳性克隆编码线粒体ATP合成酶亚基OSCP蛋白．瞬时转染pCMV-myc-NOR1质粒进入鼻咽癌5-8F细胞,通过密度梯度离心法分离线粒体蛋白,Western blot检测表明myc-NOR1蛋白分布于线粒体与胞浆．免疫荧光检测表明在鼻咽正常上皮细胞NP69中内源性NOR1蛋白与线粒体存在明显共定位．随后采用特异性酵母双杂交、免疫荧光共定位、免疫共沉淀技术证实了NOR1与OSCP在线粒体内存在交互作用．提示,NOR1是一个新的线粒体蛋白,可能通过结合OSCP蛋白调控细胞能量代谢,为深入探讨其功能提供了重要线索．     

肿瘤及胚胎组织特异表达蛋白CEP65相互作用蛋白的筛选与鉴定

CEP65蛋白(cancer and embryo expression protein 65)为肿瘤单克隆抗体3H11所识别的抗原分子, RT-PCR及RNA印迹检测表明, CEP65蛋白表达于肿瘤及胚胎组织.为了研究CEP65在肿瘤发生中的作用机制,以CEP65为诱饵蛋白,通过酵母双杂交体系筛选人胚胎组织cDNA表达文库. 从5.2×10⁶个克隆中筛选得到14个阳性克隆,并在酵母体系中通过不同方法得到验证.在此基础上,选取在双杂交中作用明显的51号克隆,与CEP65作GST pull-down实验, 结果证明, CEP65与51号阳性克隆蛋白确能相互作用. 生物信息学分析发现, CEP65与51号阳性克隆蛋白相互作用, 可能通过WW结构域或者蛋白激酶C对细胞的增殖与分化起到调节作用.     

应用酵母双杂交筛选与CUEDC2相互作用的蛋白质

目的：应用酵母双杂交技术,筛选与包含CUE结构域的人CUEDC2发生相互作用的蛋白质。方法：应用酵母双杂交系统,以CUEDC2为诱饵筛选人乳腺cDNA文库,寻找能与之相互作用的蛋白质,并运用营养缺陷型培养和X-alpha-Gal等实验提供的信息,筛除假阳性克隆。结果：以CUEDC2为诱饵最终筛出了2个阳性克隆,经测序及生物信息学分析,这2个克隆同为GADD34。结论：CUEDC2可以和GADD34发生相互作用,它们的相互作用有可能与CUEDC2的功能调控相关。     

CHK1相互作用蛋白的筛选

将CHK1基因克隆入酵母双杂交载体中,转化入酵母菌AH109,将转化有CHK1基因的酵母菌AH109培养并再转化人前列腺cDNA库质粒,检测报告基因的表达情况,筛选与CHK1相互作用的蛋白。共转化子中有4个β-半乳糖苷酶活性分析和α-半乳糖苷酶活性分析结果为阳性的克隆,但测序结果其中有2个克隆为相同序列。本实验筛选到3个与CHK1相互作用的蛋白,此结果为进一步研究与CHK1相互作用的蛋白奠定了基础。     

PML coiled-coil结构域与RAN结合蛋白9相互作用的验证

目的验证前髓细胞性白血病的卷曲螺旋结构域（PML—C）和RAN结合蛋白9（RANBP9）之间的相互作用。方法构建分别表达诱饵蛋白PML—C和靶蛋白RANBP9的载体pGBKT7-PML-C和pACT2-RANBP9,然后转人酵母AH109,培养3～5d后对其是否有胞内相互作用进行检测。将目的片断PML-C和RANBP9再次构建于真核生物表达载体pCMV—HA和pCMV—myc里,然后共转染人胚肾293细胞里（HEK293）,最后对其是否有体外相互作用通过免疫共沉淀和免疫印迹进行分析。结果在共转化了质粒pGBKT7-PML—C和pACT2-RANBP9的AH109酵母平板里观察到蓝色菌落生长。用抗HA多克隆抗体对共转染过重组质粒的HEK293细胞的蛋白提取物进行免疫共沉淀,再用抗myc单克隆抗体作为一抗进行免疫印迹,最终检测出融合蛋白myc—RANBP9条带。结论酵母双杂交实验验证了PML—C和RANBP9之间存在胞内相互作用,同时免疫共沉淀实验也从体外验证了它们之间的相互作用。     

L1CAM胞内区相互作用蛋白的筛选与鉴定

L1细胞粘附分子(L1cell adhesion molecular,L1CAM)属于神经细胞粘附分子,是属于免疫球蛋白超家族的Ⅰ型跨膜糖蛋白.L1主要在神经系统中表达,参与神经系统发育,学习记忆等重要过程作用.L1的胞内区可能参与信号转导,对于L1的功能非常重要,为探讨L1胞内区信号转导的分子机制,以L1胞内区为诱饵运用酵母双杂交技术在人脑cDNA文库中筛选其结合蛋白,挑选阳性克隆,进行DNA序列分析和同源检索,阳性克隆编码几个不同的蛋白质,其中一个候选蛋白为PAX6转录因子.为进一步验证L1胞内区和PAX6的相互作用,克隆其基因到表达质粒共转染COS-7细胞,免疫共沉淀证实了L1胞内区和PAX6的相互作用,提示L1胞内区可能参与转录调节,为深入探讨其功能提供了重要线索.     

血管生成素相互作用蛋白质的筛选与鉴定

血管生成素（angiogenin, ANG）在肿瘤、神经退行性疾病和先天免疫过程中均发挥作用,但对其具体生理病理功能和作用机制的了解并不深入全面.蛋白质 蛋白质相互作用调控着细胞内的各个生物学过程,可以为目标蛋白质功能和机制的探索提供信息.本文利用酵母双杂交技术,分别从人心肌和肝cDNA文库中筛选了ANG的可能相互作用蛋白质.对筛选获得的20个候选蛋白质进行生物信息学分析,显示10个蛋白质含有EGF结构域;有5个蛋白质在KEGG 数据库已有记录,主要参与细胞黏附、通讯和迁移等过程.在以往的研究中,我们已经验证α 辅肌动蛋白2（α-actinin 2）、卵泡抑素（follistatin）、磷脂混杂酶1（phospholipid scramblase 1）和腓骨蛋白1（fibulin1）与ANG作用的真实性.本文的蛋白质沉降实验显示,ANG与腓骨蛋白2、3、4之间也存在相互作用.     

转录因子X-box结合蛋白1相互作用蛋白的筛选和鉴定

X-box 结合蛋白 1 是一种重要的转录因子,参与体内多项信号转导过程. 为进一步研究 XBP1 的生物学功能,运用酵母双杂交技术在肝细胞文库中筛选 XBP1 的结合蛋白. 首先运用 PCR 技术扩增获得 XBP1 的编码序列,克隆至 pGEM-T 载体,经测序鉴定后,亚克隆至诱饵载体 pGBKT7 中,转化酵母 AH109(a type). 免疫印迹检测诱饵质粒 pGBKT7-XBP1 在AH109 酵母中的表达之后,含有诱饵质粒的酵母 AH109 与含有肝细胞 cDNA 文库质粒 pACT2 的酵母 Y187(αtype)配合,配合后的二倍体酵母生长在含有 X-α-gal 的营养缺陷型培养基上 (SD/-Trp-Leu-His-Ade) 进行选择和筛选,经测序和序列比对确定阳性克隆的开放读码框 ORF,得到 7 种不同的蛋白质. 为了进一步验证这些筛选蛋白质与 XBP1 的相互作用,克隆其中一种蛋白质 MT1E,并运用 GST pulldown 和免疫共沉淀技术成功检测了 MT1E 和 XBP1 的相互作用(体外 / 体内),结果提示,MT1E 可能是 XBP1 的一个新的调节蛋白. 通过酵母双杂交技术筛选得到的 7 种蛋白质分别与肝细胞基础代谢、蛋白质的合成与运输、细胞的增殖与凋亡密切相关. 上述结果有助于揭示 XBP1 的生物学功能,为进一步探讨 XBP1 的表达和调控机制提供新线索.     

酵母双杂交系统筛选GATA-1相互作用蛋白质及功能验证

目的 利用酵母双杂交技术从人脑cDNA文库中筛选与人GATA-1相互作用的蛋白质.方法 从人K562细胞中扩增出全长GATA1基因,设计引物将其3段截断体亚克隆入酵母表达载体pDBLeu中,转化至AH109感受态酵母中,利用酵母双杂交技术筛选人脑cDNA文库中与其相互作用的蛋白质,阳性克隆通过回转及免疫共沉淀试验进行验证,利用3xGATA荧光素酶报告基因对相互作用蛋白质进行功能验证.结果 成功构建出酵母诱饵蛋白表达质粒pDBLeu-GATA1（1）,pDBLeu-GATA1（2）,pDBLeu-GATA1（3）,筛到34个阳性克隆,用生物信息学分析及回转验证得到5个与GATA-1相互作用的候选蛋白,通过免疫共沉淀试验进一步验证,获得3个蛋白质能与GATA-1相互作用,分别是ECSIT,EFEMP1和GPS2.荧光素酶试验表明这3个蛋白质均能对GATA1的转录活性产生影响,证实它们之间的相互作用具有影响GATA1转录的功能.结论 应用酵母双杂交技术及免疫共沉淀试验,从人脑cDNA文库中成功获得3个与GATA-1相互作用并对其转录活性具有调节作用的蛋白质,为研究GATA1蛋白质的功能提供了新的线索.     

与抗辐射性相关蛋白AA12相互作用蛋白的筛选

将AA12基因克隆入酵母双杂交载体中,转化入酵母菌AH109,Western印迹检测其在酵母中的表达;将转化有AA12基因的酵母菌AH109培养再转化人前列腺cDNA库质粒,检测报告基因的表达情况。Western印迹结果表明AA12可以在酵母菌AH109中表达。共转化子中有2个β-半乳糖苷酶活性分析和d-半乳糖苷酶活性分析结果为阳性的克隆,但测序结果为相同序列。本实验筛选到1个与AA12相互作用的蛋白,此结果为进一步研究新基因AA12的功能奠定了基础。     

三氧化二砷下调MG-63骨肉瘤细胞IEX-1基因表达的转录调控机制研究

三氧化二砷(arsenic trioxide, As₂O₃)是中国传统中药砒霜的主要有效成分,最早应用于血液系统肿瘤的治疗,随后研究表明其对实体瘤也具有抑制细胞增殖并诱导凋亡的作用．早期研究发现,1.0 μmol/L的As₂O₃可以体外诱导骨肉瘤细胞系MG-63细胞凋亡,进一步的cDNA芯片分析、RT-PCR、RNA印迹证实细胞凋亡与As2O3干预后IEX-1基因表达下调有关．IEX-1为早期诱导应答基因,调节细胞生长和凋亡．通过荧光素酶分析,EMSA、蛋白质印迹等实验,发现As₂O₃干预骨肉瘤细胞系MG-63后能诱导p53蛋白表达上调,增加的p53蛋白通过与IEX-1的启动子结合,转录抑制IEX-1的转录,导致IEX-1基因表达下调．进一步证实了IEX-1与骨肉瘤的重要关系,同时也阐明As₂O₃诱导IEX-1基因表达下调的转录调控机制．     

IEX-1-induced cell death requires BIM and is modulated by MCL-1

MCL-1 (myeloid cell leukemia-1) is a distinguished and pivotal member of the pro-survival BCL-2 family of proteins, and we isolated IEX-1 (immediate early response gene X-1) as a MCL-1-interacting protein using the yeast two-hybrid system and confirmed their endogenous association in human cells. The underlying mechanisms by which IEX-1 affects cell survival and death are largely unknown. Ectopic expression of IEX-1-induced caspase-dependent apoptosis in 293T cells, and the response was significantly modulated by changes in the MCL-1 expression level in cells. Forced expression of IEX-1 was unable to induce cell death or to perturb mitochondrial membrane potential in BIM-depleted cells. Additionally, knockouts of NOXA or PUMA did not affect the activities of IEX-1, indicating that the pro-death action of IEX-1 specifically requires BIM. Our findings provide insight into a new regulatory circuit that controls cell death and survival by the coordinated action of MCL-1, IEX-1, and BIM.     

BRPF1及其新型转录本BRPF2与RHOX5蛋白间的相互作用

RHOX5基因是最早发现的小鼠RHOX基因簇(reproductive homeobox on the X chromosome)成员,可特异性地在生殖系统中表达.RHOX5蛋白在胚胎发育、生殖组织的发育、精子的生成和成熟等多个环节发挥作用,但其功能的发挥途径尚不明确.在前期筛选与RHOX5蛋白相互作用的分子中初步获得一个BRPF1的新型转录本BRPF2.进一步构建pGBKT7-BRPF2质粒,酵母双杂交实验确定其与RHOX5蛋白的相互作用,GST-pull down实验确定其在体外的直接结合;PCR扩增BRPF1基因,构建pGBKT7-BRPF1和pGADT7-BRPF1质粒,酵母双杂交实验和GST-pull down实验证明RHOX5蛋白亦可以直接结合BRPF1蛋白.BRPF1及其新型转录本BRPF2与RHOX5蛋白间的相互作用证实暗示了BRPF2极有可能与BRPF1竞争性结合RHOX5蛋白,为三种蛋白功能的研究提供了新的思路.     

胃癌相关新蛋白Raf激酶抑制蛋白相互作用蛋白质的鉴定

Raf激酶抑制蛋白(RKIP)的异常表达在胃癌的发生发展中起重要的作用,为了阐明其作用机制,应用脂质体将RKIP-3xFLAG-pcDNA3.1质粒转染至SGC7901细胞,建立RKIP-3xFLAG高表达的SGC7901细胞;并利用3xFLAG标签的亲和层析技术联合质谱分析,分离、鉴定与RKIP相互作用的蛋白质,并应用免疫共沉淀联合Western-blot进一步验证质谱结果．共鉴定出66个RKIP相互作用蛋白质,功能分类包括蛋白质代谢酶类、生物氧化相关酶类,细胞骨架蛋白、分子伴侣、信号转导相关蛋白、酶解相关蛋白等．并首次证实14-3-3蛋白与RKIP存在相互作用．为阐明RKIP在胃癌发生发展中的作用机制提供了重要的线索,为胃癌的早期诊治及预后监测提供了新的靶点．     

NALP1 基因与骨肉瘤细胞的相关研究

目的:探讨NALP1基因在骨肉瘤细胞株MG-63、U-2OS中的表达,以及高表达NALP1基因对于骨肉瘤细胞体外凋亡的影响。方法:使用RT-PCR、Western-blot法检测骨肉瘤细胞株MG-63、U-2OS中的mRNA及蛋白表达水平并与人成骨细胞株hFOB1.19比较。将NALP1基因转染质粒PcDNA3.1,将重组质粒转染骨肉瘤细胞,分成高表达基因组、空质粒组及对照组,加入抗肿瘤药物顺铂及甲氨蝶呤促使肿瘤细胞凋亡,使用流式细胞仪测定各组肿瘤细胞凋亡率。结果:通过统计分析,骨肉瘤细胞株MG-63、U-2OS中的mRNA及蛋白表达水平均低于人成骨细胞株hFOB1.19(P<0.05),NALP1高表达组的肿瘤细胞凋亡率明显高于空白质粒组及对照组。结论:上调骨肉瘤细胞株MG-63、U-2OS中的NALP1的表达量可以促进肿瘤细胞凋亡。     

抗小鼠PLRP1多克隆抗体的制备以及特异性鉴定和应用

小鼠胰泡细胞表达和分泌一种被称为胰甘油三脂酶(PTL)的脂肪酶,主要参与食物来源的甘油三脂的消化吸收,胰泡细胞同时也表达胰脂肪酶相关蛋白1(PLRP1),它同PTL具有很高的同源性．为了研究PLRP1的生物学功能,需要制备其抗体．应用谷胱甘肽S-转移酶(GST)表达系统表达了GST融合蛋白,亲和纯化后用以免疫新西兰大白兔,获得了抗PLRP1的多克隆抗体．免疫印迹分析表明,该多克隆抗血清能检测出0.6 ng的融合蛋白抗原以及在3 μg的小鼠胰液提取物中检测出PLRP1蛋白．在证明抗体的特异性方面,尝试了一种新的方法：用PLRP1基因剔除的小鼠作为阴性对照,通过免疫印迹和免疫组化实验证明了该多克隆抗血清具有很高的特异性．进一步的研究发现,进食能促进胰腺中PLRP1的外分泌,这表明PLRP1可能在食物的消化过程中具有一定的生物学功能．     

蛋白质相互作用研究的新技术与新方法

目前,蛋白质相互作用已成为蛋白质组学研究的热点. 新方法的建立及对已有技术的改进标志着蛋白质相互作用研究的不断发展和完善．在技术改进方面,本文介绍了弥补酵母双杂交的蛋白定位受限等缺陷的细菌双杂交系统;根据目标蛋白特性设计和修饰TAP标签来满足复合体研究要求的串联亲和纯化技术,以及在双分子荧光互补基础上发展的动态检测多个蛋白质间瞬时、弱相互作用的多分子荧光互补技术．还综述了近两年建立的新方法：与免疫共沉淀相比,寡沉淀技术直接研究具有活性的蛋白质复合体;减量式定量免疫沉淀方法排除了蛋白质复合体中非特异性相互作用的干扰;原位操作的多表位－配基绘图法避免了样品间差异的影响,以及利用多点吸附和交联加固研究弱蛋白质相互作用的固相蛋白质组学方法.     

钙通道蛋白Orai1在骨肉瘤细胞转移中的作用研究

目的:骨肉瘤是一种常见的恶性骨肿瘤,恶性程度高,往往在早期就会发生远隔器官的转移,从而导致骨肉瘤的预后非常差。Orai1是一类定位于细胞膜,介导钙离子内流的受体依赖性钙通道蛋白。大量研究发现钙通道蛋白Orai1过表达于多种肿瘤细胞,并对维持肿瘤细胞粘附、侵袭、迁移等恶性表型有非常重要的作用。然而,钙通道蛋白Orai1是否参与了骨肉瘤的转移过程,目前未见相关报道。本研究的目的是探究钙通道蛋白Orai1是否在骨肉瘤转移过程中的发挥作用。方法:利用合成的靶向Orai1的小干扰RNA(Orai1 si RNA)片段,转染至人骨肉瘤细胞系Saos-2细胞。在Saos-2细胞中抑制Orai1的表达。采用细胞黏附实验、细胞划痕实验和细胞Transwell实验检测骨肉瘤细胞的黏附、迁移及侵袭等肿瘤细胞转移能力;Western-blot实验检测Saos-2细胞的中黏着斑激酶(FAK)和桩蛋白(Paxillin)的表达水平和磷酸化水平。结果:靶向Orai1 si RNA瞬时转染至骨肉瘤细胞系Saos-2细胞后,Saos-2细胞中Orai1蛋白表达水平和m RNA转录水平均显著下降。并且,在Saos-2细胞中抑制Orai1表达后,Saos-2细胞的黏附能力、迁移能力、及侵袭能力均显著下降。进一步研究发现,在Saos-2细胞中抑制Orai1表达后,Saos-2细胞的FAK和Paxillin磷酸化水平明显下降。结论:Orai1可以促进骨肉瘤细胞的黏附、迁移和侵袭,增加黏着斑的形成,从而促进骨肉瘤的转移。因此,深入研究钙通道蛋白Orai1调控骨肉瘤转移的分子机制,可为骨肉瘤转移的治疗提供新的新方向和新策略。     

微丝相关新蛋白hHBRK1相互作用蛋白质的鉴定

为了鉴定hHBRK1的相互作用蛋白,通过DNA重组构建重组表达质粒pGEXhHBRK1,并以谷胱甘肽Sepharose4B亲合层析法,获得纯化的重组融合蛋白GSThHBRK1.以小鼠心肌组织为研究对象,采用GSTpulldown技术结合Western印迹法,证实hHBRK1与小鼠心肌肌钙蛋白TEa亚型(EacTnT)相互作用.结果提示,hHBRK1与EacTnT结合,可能参与心肌微丝的聚合,为小鼠cTnT众多的剪接体,提供了一种可能的功能定位.