肽转运载体的分子特征及其分布

动物体内的肽转运载体目前发现的至少有五种,其中研究最为广泛的是：PepT1和PepT2。PepT1和PepT2都是依质子的寡肽转运载体(POT)家族的成员。PepT1是低亲和力／高容量的肽载体,PepT2高亲和力／低容量的肽载体。PepT1主要在消化道中表达,在肾脏中也有微弱的表达;PepT2主要在肾脏中表达。这些肽载体的分子结构特征主要有：(1)有12个假想的穿膜区,在9区和10区之间有一大的胞外环,且所有穿膜区内的序列都高度保守,胞外环上的序列保守的很少;(2)被编码的蛋白上有多个N-糖基化和蛋白激酶的识别位点,它们可能参与肽转运的调控;(3)PepT1上的His-57和PepT2上的His-87是最关键的组氨酸残基,它们可能是转运蛋白发挥吸收功能时最关键的结合位点;(4)不同动物肽转运蛋白的氨基酸范围在707到729之间,且不同动物相同器官肽转运载体的同源性高(大约80％),同种动物不同器官肽转运载体的同源性低(大约50％)。了解肽载体的分子特征和组织分布,可以更好地理解肽吸收的分子机制并有利于肽类药物的研发。     

GnRH及其转运肽基因真核表达载体的构建及表达

目的 构建GnRH/TRS与绿色荧光蛋白(GFP)的融合基因并表达.方法 利用DNA重组技术,将GnRH/TRS片段克隆至真核表达载体pEGFP-C1转化DH5 α,重组体质粒pEGFP-C1-GnRH/TRS用LipoGen脂质体进行转染至Hela细胞,核酸序列测定和Western印迹分析基因表达,激光共聚焦荧光显微镜观察活细胞内荧光布局.结果 重组子pEGFP-C1-GnRH/TR成功构建.激光共聚焦荧光显微镜观察结果表明,GnRH/TKS-GFP融合基因的瞬间和稳定表达均获得了相同结果.结论 GnRH/TRS-GFP融合蛋白具有GFP的自发荧光特性,且不影响GnRH/TRS分子在细胞内的正确表达.     

小肽多拷贝基因表达载体的构建及其高效表达(英文)

介绍一种快速、高效构建小肽多拷贝基因表达载体的策略 ,并构建了相应的表达载体pETE coT .用人工合成的编码 2 8个氨基酸残基的胸腺素α1基因为模型 ,采用限制酶EcoT14I识别序列CCAAGG为小肽基因两末端序列 ,利用其酶切后可产生非镜相对称粘性末端 ,一次连接反应就构建出一系列不同基因拷贝数的表达载体 ;在小肽基因两端分别引进编码FactorXa和羟胺蛋白切割位点的序列 ,表达出的融合蛋白可被FactorXa和羟胺剪切出不残留任何外源氨基酸的小肽 .不同拷贝数的小肽融合蛋白在大肠杆菌BL2 1(DE3)中均获得高效表达 .     

小拟南芥chitinase基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

以野生资源小拟南芥(Arabidopsis pumila)chitinase基因的cDNA为基础,采用基因重组技术,将该基因按正确的阋读框架定向克隆于原核表达载体pET-30a( )中,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE分析.结果表明:重组小拟南芥chitinase基因在大肠杆菌中获得高效表达,其分子量约为40 KD.小拟南芥chitinase基因原核表达载体的成功构建和重组小拟南芥chitinase蛋白在大肠杆菌中的高效表达,为进一步研究其生物学功能奠定了基础.     

氨基酸转运载体LAT1研究进展

哺乳动物氨基酸的跨膜运输由多种氨基酸转运载体蛋白介导,其中L型氨基酸转运载体1（LAT1）属于L系统,主要转运大分子支链氨基酸和芳香族中性氨基酸。研究表明,LAT1广泛存在于哺乳动物肝脏、骨髓、大脑、胎盘、心脏和睾丸组织中,LAT1在恶性肿瘤中大量表达,对其不断的增殖起着重要的作用。目前国内对氨基酸转运载体LAT1的研究仍是空白,鉴于LAT1的研究在医学、营养等生命科学领域的研究意义,本文就氨基酸转运载体蛋白LAT1的表达、调节及其相关研究进展作一综述。     

穿膜肽介导的新型基因转运载体的功能研究

目的：借助穿膜肽TAT高效跨膜的特性和LacI前头肽突变体（LacI HPM）高亲和力结合DNA的特性,建立-种安全高效、无基因插入片段大小限制的基因转导系统。方法：在TAT-LacI HPM片段C端和N端分别添加GST标签,构建pET-28a（＋）-TAT-LacI HPM-GST和pGEX-GST-TAT-LacI HPM重组表达载体,可溶性表达TAT-LacI HPM-GST及GST-TAT-LacI HPM融合蛋白并纯化,获得TAT-LacI HPM二聚体,免疫荧光检测TAT-LacI HPM融合蛋白穿过HeLa细胞膜的情况,观察EGFP的表达,用免疫印迹检测TAT-LacI HPM融合蛋白介导质粒DNA进入细胞的能力。结果：表达、纯化并获得二聚体融合蛋白,体内实验表明其具有跨膜能力,能介导带有LacI结合序列的DNA质粒进入细胞,并在转染细胞里检测到了目的蛋白。结论：初步证实TAT-LacI HPM融合蛋白作为-种新型通用性非病毒DNA转运载体的可行性,为评价这种新型DNA疫苗载体在提高免疫效果方面的可行性奠定了前期实验基础。     

甘蓝型油菜γ-TMT基因的克隆及其植物表达载体的构建

应用聚合酶链式反应技术(PCR)扩增了甘蓝型油菜γ-TMT基因,并将其克隆到pMD18-T vector载体上,对重组子进行PCR检测和限制性内切酶分析,并测定了DNA全序列.结果表明,克隆片段全长为1 044 bp.将甘蓝型油菜γ-TMT基因定向克隆到植物表达载体pCambia1300的35S启动子下游,构建了该基因的植物超表达载体.     

肽抗生素及其基因工程研究

抗生素的滥用带来严重的病菌抗药性问题。肽抗生素能杀死多种微生物及特异性杀死癌细胞,通过穿膜打洞的方式使细胞死亡,不会导致抗药菌株的产生。从昆虫及高等动物中分离纯化了许多种类的肽抗生素,寻找到一些杀菌和杀癌细胞能力强的种类。由于分离天然产物产量极微,采用人工合成则成本太高,科研人员致力于用基因克隆与表达的技术研究与开发肽抗生素。     

中国人肥胖基因真核表达载体的构建

为研究肥胖（ｏｂｅｓｉｔｙ）的病因及肥胖基因（ｏｂ）的表达与调控,根据文献报道的ｈｏｂ序列设计引物,经ＲＴ－ＰＣＲ扩增中国人的ｏｂ基因（包括信号肽在内的ｃＤＮＡ全长５４０ｂｐ）,ＰＣＲ产物采用Ｔ－Ａ克隆法首先连接到克隆载体ｐＵＣ１１９,然后定向转移到经改造的真核表达载体ｐＳＶ－β－ｌａｃＺ,酶谱分析表达克隆基因为的人肥胖基因。     

抗真菌肽CGA-N46基因多顺反子表达载体的构建与鉴定

目的:为提高抗真菌肽CGA-N46表达量,对该基因多顺反子表达进行研究.方法:以pEASY-Blunt为克隆栽体,以“pET-30a rbs序列-起始密码子-CGA-N46编码序列-终止密码子”为外源片段,利用同尾酶Nhe I、Spe I和Xba I,构建了含有上述外源片段1、3、5、8拷贝的重组载体pT-CAN46、...     

长江中下游三个湖泊中鳜消化道寄生蠕虫群落的组成与多样性

鱼类在食物网中的营养位置对其消化道寄生蠕虫的群落结构有重要作用。本研究调查了梁子湖、洞庭湖、鄱阳湖中鳜(Siniperca chuatsi)消化道寄生蠕虫群落的组成和多样性。在3个湖泊中共发现11种寄生蠕虫, 优势种均为范尼道佛吸虫(Dollfustrema vaneyi), 频率分布中感染有12种寄生虫的样本占65%, 单个样本中最大物种数为6。3个湖泊中平均物种丰富度为1.532.13, Brillouin多样性指数为0.120.33, 其中鄱阳湖中的多样性最高。梁子湖和洞庭湖之间的Jaccard相似度和百分比相似指数最高。通过比较食物网中不同营养位置鱼类的消化道寄生蠕虫群落结构, 发现鳜的消化道寄生虫群落的物种丰富度与多样性水平都高于植食性和杂食性鱼类。研究还讨论了宿主食物组成对消化道寄生蠕虫群落结构的影响。       

翘嘴鳜miR-222的表达特征

为了解翘嘴鳜miR-222的时空表达规律, 研究利用实时荧光定量PCR的方法检测miR-222在翘嘴鳜不同组织、胚胎发育及胚后发育中的相对表达丰度。研究结果显示, miR-222在肌肉相关的组织中表达较高, 特别是在成年翘嘴鳜的白肌中表达最高; 胚胎发育阶段结果显示, miR-222在胚胎发育的2细胞期就有表达, 而表达量在心动期达到最高。不同组织及不同发育阶段的差异性表达结果表明, miR-222很可能参与调控鳜鱼肌肉的生长发育。为研究合成代谢过程中miR-222在肌肉生长调控中的表达规律, 通过对翘嘴鳜幼鱼在饥饿一周后饱食一餐的实验处理下, 利用实时荧光定量的方法测定miR-222在骨骼肌中的相对表达变化。结果显示, miR-222的表达量在恢复喂食后的1h显著上升(P0.05), 表明miR-222很可能是调节鱼类骨骼肌生长过程中, 参与快速应答信号系统的一类miRNA。研究为miR-222在鱼类发育中的调控作用提供一些理论依据。       

拟穴青蟹两种新C-型凝集素基因的克隆与表达分析

为研究拟穴青蟹(Scylla paramamosain)中C-型凝集素(C-lectin)的功能, 从其肝胰腺中克隆获得全长858 bp和598 bp的两个C-型凝集素分子, 分别命名为Sp-lectin3和Sp-lectin4, 其推导的氨基酸序列含有信号肽和一个CRD, 其中Sp-lectin4还具有糖类结合的特征性基序QPD。Sp-lectin3和Sp-lectin4的开放阅读框分别由5个和4个外显子编码。在正常养殖青蟹的肝胰腺中该两个基因表达量最高, 其次是射精管(Sp-lectin3)或肠(Sp-lectin4); 除脑和储精囊外的所检测组织/器官中, Sp-lectin4表达量均高于Sp-lectin3。随着胚胎的发育, 该两个基因表达量逐渐升高, 峰期为溞状幼体, 而大眼幼体期的表达量急剧下降, 仔蟹期再回升; 在胚胎发育阶段除囊胚期外, Sp-lectin4表达量极显著高于Sp-lectin3(P0.01), 相反, 在胚后发育阶段除大眼幼体II期外, Sp-lectin3表达量却极显著高于Sp-lectin4(P0.01)。副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus) 人工感染, 可诱导Sp-lectin3在储精囊和射精管中的表达, 分别在感染后12h和6h显著上调(P0.05); 同时, 可诱导Sp-lectin4在肝胰腺中的表达, 并在感染后12h和18h显著上调(P0.05)。结果表明, Sp-lectin3和Sp-lectin4可能参与拟穴青蟹的抗细菌感染免疫反应, Sp-lectin3侧重于生殖系统如射精管和储精囊中发挥作用, 而Sp-lectin4侧重于在肝胰腺。       

青虾咽侧体抑制激素基因全长cDNA序列的克隆及表达分析

咽侧体抑制激素(Allatostatin, AST)是一类由几至几十个氨基酸构成的神经肽类激素, 在甲壳动物中刺激下颌器官合成甲基法尼酯, 影响甲壳动物的蜕皮和生殖。然而AST基因在甲壳动物中的克隆和表达却罕见报道。研究克隆了青虾的AST基因全长cDNA序列, 在甲壳动物中使用荧光定量PCR技术检测了AST基因在不同组织中的表达。青虾AST基因cDNA全长2995 bp, 包括242 bp的5′非编码区(UTR), 647 bp的3′UTR, 2106 bp的开放阅读框(ORF)。开放阅读框编码701个氨基酸, 可转录翻译出35个AST多肽, 在C末端都具有相同的Y/FXFGL-amide结构, 属于A型-AST。氨基酸序列比对显示保守氨基酸为Tyr、Ala、Phe、Gly、Leu。蛋白相似度比对显示, AST多肽在无脊椎动物的进化中是相对保守的。系统进化树分析表明, 青虾AST多肽与罗氏沼虾聚在一起, 具有最近的亲缘关系。荧光定量PCR检测显示, AST基因在所有被检测组织中均有表达, 由高到低依次为: 肝胰脏>肠道>精巢>脑>心脏>卵巢。对青虾AST基因全长cDNA序列克隆和表达的研究为更进一步的了解AST多肽在青虾中的重要功能奠定了基础。     

两种鳜病毒的共感染现象及引起感染细胞的超微变化

借助细胞培养和电镜技术,揭示了鳜球形病毒(Siniperca chuatsi spherical virus,SCSV)与鳜弹状病毒(Siniperca chuatsi rhabdovirus,SCRV)在草鱼鳍细胞(Grass carp fins,GCF)中共感染的现象。在筛选到敏感鱼类细胞系和建立了 鳜病毒体外增殖系统的基础上,取息典型病毒感染出血症的鳜组织,制备组织悬液,接种到GCF细胞中传代培养, 在攻毒后间隔不同时间收集细胞,对攻毒细胞的超薄切片进行电镜观察。揭示两种形态的鳜病毒可在同一个GCF 细胞中增殖,并描述和分析了病毒复制引起感染细胞的超微病变。本研究结果有助于阐明鱼类重要病毒病害的发 生过程及致病机理。     

鳜肝脏和心脏生物钟基因表达节律分析

在12h光照、12h黑暗交替(Light-Dark; LD)光制下,研究分析了褪黑素和皮质醇水平在鳜血清中的昼夜变化规律,以及13个生物钟基因(Arntl1、Clock、Cry1a、Cry3、Cry-dash、Npas2、Npas4、Nr1d1、Nr1d2、Per1、Per3、Rora和Tim)在鳜(Siniperca chuatsi)肝脏和心脏中的昼夜表达规律。试验在一昼夜内的ZT0(06:00)、ZT3(09:00),ZT6(12:00),ZT9(15:00),ZT12(18:00),ZT15(21:00),ZT18(24:00),ZT21(03:00,2nd d),ZT24(06:00,2nd d) (Zone time,ZT) 9个时间点随机抽取3尾鳜采集其血清、肝脏和心脏。经SPSS 单因素方差分析和Matlab余弦分析,结果显示: 鳜血清中褪黑素和皮质醇含量均呈现出昼夜节律性振荡,褪黑素含量白天显著降低(P0.05),夜间显著上升,皮质醇含量白天缓慢降低,夜间ZT15(21:00)-ZT18(24:00)显著升高,随后开始缓慢降低; 两种激素最低相位都为ZT15(21:00)。在13个生物钟基因中,Cry-dash、Npas4、Nr1d1、Per1和Tim 5个基因在鳜肝脏内具有明显的昼夜节律性,其中Npas4、Nr1d1、Per1、Tim的表达规律相似,皆呈现出光照阶段表达降低,黑暗阶段表达升高的趋势; 但Cry-dash则表现出光照阶段先升高后降低,黑暗阶段先降低后升高的规律。在鳜心脏中,Arntl1、Clock、Cry1a、Npas2、Nr1d1、Nr1d2、Per3、Rora和Tim 9个基因都表现出明显的昼夜节律,表达趋势分为两种: Arntl1、Clock、Nr1d2的表达量在光照阶段降低,黑暗阶段升高; 而Cry1a、Npas2、Nr1d1、Per3、Rora和Tim的表达量在ZT0(06:00)-ZT15(21:00)持续低水平,ZT15(21:00)-ZT18(24:00)表达量显著上升,ZT18(24:00)-ZT21(03:00)表达量降低。研究结果表明: 生物钟基因在鳜肝脏和心脏中所表达的昼夜节律不同。     

赤眼鳟MyD88基因cDNA克隆与表达特性研究

实验使用RACE-PCR技术获得了赤眼鳟(Squaliobarbus curriculus)髓样分化因子88 (Myeloid differentiationfactor 88, MyD88)的cDNA全长, 命名为ScMyD88。ScMyD88的cDNA全长为1779 bp, 其中开放阅读框855 bp, 共编码284个氨基酸残基, 推导的蛋白质分子量为33.053 kD, 理论等电点为5.66。赤眼鳟MyD88具有典型的MyD88结构特征, 包括死亡结构域和TIR结构域(Toll-IL-1 receptor domain, TIR), 其氨基酸序列和鲤科鱼类具有高度保守性, 相似性达到了90%以上, 特别是和武昌鱼相比, 相似性达到了98%。在检测的9个赤眼鳟组织和器官中均有MyD88表达, 其中肝脏、头肾和体肾中表达水平最高, 在脑中表达量最低。在草鱼呼肠弧病毒(Grass carp reovirus, GCRV)感染初期(12h内), MyD88在赤眼鳟免疫组织中表达水平急剧上升, 特别是在脾脏和体肾中尤为明显, 随后恢复正常水平。研究表明, MyD88在赤眼鳟抵抗GCRV入侵的免疫应答反应初期发挥了重要作用。     

鲫Dmrt3基因的克隆和表达分析

DMRT家族是一个与性别决定相关的转录因子家族。为了研究家族成员之一的Dmrt3在我国重要养殖鱼类鲫胚胎发育、性别分化中的功能以及在育种中的作用,我们克隆了鲫Dmrt3基因的cDNA全长,并对Dmrt3基因在发育早期和不同组织中的表达进行了分析。结果显示:鲫Dmrt3基因cDNA全长为2182 bp,其中5￠端非编码区408 bp,3'端非编码区427 bp,开放阅读框1347 bp,编码448个氨基酸。蛋白结构预测显示DMRT3除了正常的DM结构域外,还有DMA结构域,在进化上与DMRT4和DMRT5的亲缘关系更近。巢式RT-PCR分析结果表明Dmrt3直到尾芽期才开始有微量表达,表达量在15体节期有明显增加但仍然处在一个较低的水平;在成体组织中只在精巢中检测到表达。这种表达时空模式提示Dmrt3可能在早期器官发生和雄性性腺发育调控中起作用。对Dmrt3启动子CpG岛的甲基化分析表明所检测的组织和配子中并不发生甲基化,说明这种雌雄特异性和组织特异性差异表达并不是通过对该基因启动子的差异甲基化修饰来调控的。此外,我们还发现了鲫Dmrt3的一个由逆转录产物形成的假基因pDmrt3。这些结果为进一步研究鲫Dmrt3在性别分化中的作用和评估其在鲫性别控制育种中的价值,以及分析DMRT家族的进化关系提供了基础资料。       

鳜鱼的耗氧率及其池塘养殖

本文较详细地报道了鳜鱼的耗氧率和窒息点,并对鳜鱼和作其饲料的鱼同池饲养的可能性进行了探讨。结果表明,鳜鱼耗氧量和体重正相关（ｒ＝０．９９）,耗氧率与体重反相关（ｒ＝－０．９７）;在水温２０℃,鱼种耗氧率约为０．１４ｍｇ／ｇ．ｈ．,成鱼约为０．１２ｍｇ／ｇ．ｈ．;耗氧量和耗氧率均与水温正相关（ｒ＝０．９０,ｒ＝０．９４）,水温１３—３０℃时,体重２３０±１１．７ｇ的鳜鱼。耗氧量为１４．３１—４２．１３ｍｇ／尾。ｈ．,耗氧率为０．０５９—０．１７５ｍｇ／ｇ．ｈ．;鳜鱼耗氧率昼夜变化与家鱼相反,黄昏至凌晨是高峰期,为０．１２—０．１５ｍｇ／ｇ．ｈ．（Ｔ＝２０℃）,白天是低谷期,为０．０７—０．１０ｍｇ／ｇ．ｈ;;鳜鱼的窒息点与家鱼类较接近,变化范围为０．４５—０．７６ｍｇ／Ｌ;鳜鱼和作其饲料的鱼在同一池塘中饲养,既可持续不断地提供鳜鱼充足的适口饵料,又简单易行,成本低,效益高,有较大的价值。     

鳜脑干组织学与重建研究

采用银浸染,美蓝及Ｈ．Ｅ染色技术对５尾鳜成鱼的脑干进行了组织学研究,并在此基础上对春各主要神经核团及神经束空间构型及走向进行了探讨,旨在为研究鳜脑的功能提供生资料。鳜脑干结构与其它硬骨鱼相似,囊括了除第１对脑神经之外的９对脑神经中枢。并且感觉中枢多集中于脑干背侧;运动中枢集中于脑干腹侧。