鲫Kaiso基因cDNA的克隆和表达分析

在爪蟾和斑马鱼中, Kaiso是一种在整个基因组范围内与甲基化CpG序列特异性结合的转录抑制因子, 在调控被甲基化基因表达的时间模式中起重要的作用。为深入研究DNA甲基化对我国重要养殖鱼类生殖和发育的影响, 我们克隆了鲫Kaiso基因的cDNA序列, 并对其时空表达模式进行了分析。该cDNA全长3145 bp, 5′-非翻译区132 bp, 3′-非翻译区1117 bp, 开放阅读框1896 bp, 编码631个氨基酸。鲫Kaiso蛋白与其他物种Kaiso蛋白的同源性分析表明, 与其他物种一样, 其 N端和C端分别有高保守性的BTB/POZ结构域和锌指结构域。整胚原位杂交结果显示, Kaiso mRNA在早期胚胎发育的各个时期均广泛表达, 信号均一, 但从尾芽期开始出现组织特异性表达差异。对不同发育阶段胚胎的实时定量PCR检测结果表明: 卵子中有高丰度的母源Kaiso mRNA存在; 在卵裂期至囊胚中期胚胎中Kaiso mRNA的丰度逐渐降低; 从囊胚中期至原肠早期都维持在最低水平状态; 原肠后期其表达水平又逐渐升高, 至尾芽期达到与未受精卵中相当的高水平后在器官发生期的整体水平又稍有下降。Kaiso mRNA丰度在胚胎发育早期的这种变化过程提示在卵裂期检测到的mRNA可能都是母源mRNA, 合子核Kaiso基因可能是在囊胚晚期后才开始转录。对成体不同组织的实时定量PCR检测结果表明Kaiso的表达存在明显的组织特异性差异, 在鲫肌肉、视网膜、心脏和脑中表达水平较高, 而在肾、胰、肝等器官中表达水平很低。Kaiso表达的时间和组织特异性提示其作为甲基化基因的转录抑制因子参与了胚胎和成体基因表达时空模式的调控。这些结果为进一步研究Kaiso和DNA甲基化修饰在鲫发育调控和遗传育种中的作用提供了基础资料。     

向日葵V-ATPasea3亚基基因的克隆及表达分析

采用RACE技术,从向日葵P50中克隆V-ATPase a3亚基基因c DNA全长,并进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR分析不同浓度、不同时间的Na Cl、ABA和PEG模拟干旱胁迫条件下V-ATPase a3亚基基因的表达特征,以及相同胁迫条件下该基因在向日葵不同器官的表达特征。序列分析表明,该基因c DNA全长2 873bp,含5'-UTR 109bp、3'-UTR 295bp及编码区2 469bp,编码822个氨基酸,其编码蛋白质的理论分子质量为204.55k Da,等电点为6.29,Gen Bank登录号为KU315054。该基因编码的蛋白质为疏水性的跨膜蛋白,亚细胞定位预测其在质膜上。向日葵V-ATPase a3亚基与已报道的10种植物的V-ATPase a3亚基的同源蛋白有高度相似的保守区域,在进化上与朝鲜蓟的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果表明,向日葵受到Na Cl、ABA和PEG模拟干旱三种非生物胁迫后,V-ATPase a3亚基基因均上调表达,但表达模式不同,不同器官存在特异性表达差异。研究认为,V-ATPase a3亚基基因响应了向日葵非生物胁迫的应答,为加强对V-ATPase基因的利用奠定基础。     

胡子鲇Dmrt1基因全长cDNA克隆及其表达分析

以胡子鲇(Clarias fuscus)为研究对象,利用RT-PCR技术和SMART RACE技术克隆获得Dmrt1基因cDNA全长,并利用生物信息学分析其结构及功能;利用半定量RT-PCR技术检测胡子鲇性腺(精巢/卵巢)、肌肉、肠、肝脏、心脏、头肾、鳃丝、脑和眼等10种组织以及Ⅱ—Ⅴ期精巢中Dmrt1基因表达。结果表明:胡子鲇Dmrt1基因cDNA全长为1417 bp,其中5′非编码区(5′-UTR)为35 bp,3′非编码区(3′-UTR)为516 bp,开放阅读框(ORF)包含864 bp,编码287个氨基酸(aa),预测所编码DMRT1为主要位于细胞核内的不稳定性亲水蛋白。氨基酸序列比对显示,胡子鲇DMRT1与已公布的非洲胡子鲇、蟾胡子鲇、黄颡鱼等鲇形目鱼类的相似性为83.3%—96.1%。胡子鲇DMRT1中具有DMRT基因家族共有的、保守性很高的DM结构域,此结构域具有典型的"C2H2C4"锌指结构,与上述鲇形目鱼类的相似性达100%,与斑马鱼、青鳉、虹鳟等鱼类的相似性为91.9%—97.3%,而与鸡、鼠、猪人等的相似性达80%以上。组织表达显示,胡子鲇Dmrt1基因仅在精巢中表达,且Ⅱ期精巢(即精子发生期)中Dmrt1基因表达量显著高于Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ期精巢(P<0.05),而卵巢及其他8种组织中均无表达,表明Dmrt1是胡子鲇精巢特异性表达基因,可能与胡子鲇的雄性性别决定、精子发生及精巢发育密切相关。     

油菜profilin基因的克隆和表达分析

profilin是高等植物中的一种与肌动蛋白结合的蛋白,采用RT-PCR技术克隆了油菜（Brassica napus L.cv.canadian tween)花粉中的一个369bp的cDNA片段,序列分析结果表明,该cDNA与已报道的其他植物的profilin基因具有较高核酸序列同源性,与玉米（Zea maysL.)基因同源性为82%,拟南芥（Arabidopsis)基因同源性为85%,水稻（Oryza sativa L.)基因同源性为81%,烟草（Nicotiana tabacum L.)基因同源性为82%,结论5′RACE和3′RACE技术,获得了全长cDNA,其为672bp。该cDNA包含一个开放密码框。5′未翻译区和一个带有Poly(A)的3′区域。Northern杂交结果显示它主要在花粉和花药中表达。     

中华鳖Dmrt1基因的克隆、表达及在性逆转中的变化分析

在大部分脊椎动物中,Dmrt1基因在雄性性别决定和性腺分化中起重要的调控作用.本文从m RNA和蛋白水平分析Dmrt1基因的组织差异性表达、在不同发育阶段性腺中的细胞定位及在性逆转中的表达变化,研究Dmrt1基因在中华鳖性别分化中的调控作用.Rapid-amplification of c DNA ends(RACE)结果显示,Dmrt1基因c DNA序列全长2409 bp,其中5′非编码区为230 bp,3′非编码区为1072 bp,开放阅读框为1107 bp,编码368个氨基酸,具有一个高度保守的DM结构域.荧光定量PCR和免疫组化结果显示,Dmrt1在性腺分化之前的第16期雄性性腺中开始表达,先于Amh和Sox9基因表达.随着性腺的发育,Dmrt1蛋白主要定位于性腺Sertoli细胞的细胞核上,在雌性性腺发育过程中并未见其表达.此外,在雌二醇诱导的雄性转雌性性逆转胚胎性腺中,Dmrt1表达显著下调;在芳香化酶抑制剂诱导的雌性转雄性性腺中,Dmrt1表达则显著上升.上述研究表明,Dmrt1基因是中华鳖雄性特异性基因,参与雄性性腺的发育过程,可能在中华鳖早期性别决定中起重要的调控作用.     

鼻咽癌中差异表达基因的分析和克隆

为了验证通过ＣＤＮＡ代表性差性分析法（ｃＤＮＡ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ,ｃＤＮＡ ＲＤＡ）分离的ＣＤＮＡ序列在鼻咽癌活给组织中的差异表达,并进一不克隆鼻咽癌差异表达基因,采用ＲＴ－ＰＣＲ方法并结合Ｎｏｔｔｈｅｒｎ杂交确定其转录本的大小,进而充分利用生物信息学对有差异表达ＣＤＮＡ全长进行克隆,并对其基因产物进行了结构和功能预测。结果显示,ＡＦ０９１５     

甘草肌动蛋白基因GuActin2的克隆和表达分析

以乌拉尔甘草根为材料,从中提取总RNA,根据植物肌动蛋白的5’和3＇末端设计简并引物。采用RT-PCR技术和5’RACE试剂盒,从乌拉尔甘草根中克隆到一个肌动蛋白基因编码区全长cDNA序列（GenBank登录号GQ404511）,长度为1137bp。该基因编码一个由377个氨基酸残基组成的蛋白质。甘草GuActin2具有肌动蛋白（YVGDEAQs．KRG和WISKgEYDE）和肌动蛋白类似物（LLTEApLNPkaNR）的特征信号序列。Northern blot分析表明,GuActin2在甘草的根、茎、叶组织中都有表达,在根中,尤其在胚根中的表达强于茎和叶中的表达。该基因属于营养型亚类。     

中华绒螯蟹Dmrt基因保守区段的克隆和序列分析

Dmrt基因家族是一个与性别决定和发育相关的基因家族,在不同进化类型的生物中具有相当的保守性。采用PCR技术,扩增了中华绒螯蟹Dmrt基因的DM结构域。经序列分析,获得了Dmrt基因家族的4个成员基因EsDmrt2a、EsDmrt2b、EsDmrt2c和EsDmrt5。结果表明,不同进化地位动物的Dmrt2和Dmrt2基因DM域编码序列存在高度的同源性,显示Dmrt基因在系统进化上高度保守,序列上的相似性可能暗示着它们在功能上的保守性。     

鲫鱼Dnmt1基因cDNA的克隆及表达分析

研究克隆了编码鲫鱼Dnmt1蛋白的cDNA序列,并对Dnmt1基因的时空表达模式和表达丰度差异进行了分析。该cDNA全长4912bp,编码1503个氨基酸。鲫鱼Dnmt1蛋白与其他物种Dnmt1蛋白的同源性分析表明,N端调节区的保守性较低,但C端的催化区是高度保守的。整胚原位杂交显示,Dnmt1 mRNA在胚胎发育早期是广泛分布的,随着胚胎的发育,Dnmt1 mRNA在眼睛、脑部和已成熟体节的信号较强烈,显示了明显的区域性差异。实时定量PCR结果显示在鲫鱼胚胎发育早期有丰富的母源Dnmt1 mRNA存在,在早期发育过程中其丰度逐渐降低,在胚胎发育至2d后,Dnmt1 mRNA丰度又升到较高水平。RT-PCR检测表明在肝、心、脾、肾、脑、肌肉、视网膜等成体组织中都有Dnmt1的表达,但实时定量PCR结果显示在细胞分裂增殖旺盛的组织中表达水平明显较高。上述结果提示鲫鱼Dnmt1可能参与了胚胎基因组DNA甲基化的重编程,甲基化表观遗传学式样的确立和合子核基因正确时空表达模式形成的调节控制。       

金鱼对铅和镉的吸收蓄积

研究了铅、镉暴露实验中金鱼不同器官经有收积累铅、镉的过程及蓄积量。结合到金鱼鳃上的铅、镉可用Langmuir吸附等温式描述。最大结合容量Bmax为：铅0.9424mmol/kg干重;镉17662μmol/kg条件稳定常数logK为：铅7.80;镉6.38。Hill结合特征常数为：铅1.012;镉1.175,表明金鱼鳃上仅有一种类型的Pb^2 或Cd^2 结合位点。鳃中铅、镉含量与血液含量以及血液铅、镉含量与肾、肝中的含量呈正相关关系。肾脏对铅、镉的蓄积量高于其他器官。     

马氏珠母贝Sox11基因的克隆及时序表达模式分析

为探究Sox(SRY-related HMG-box genes)基因家族在马氏珠母贝个体发育及性别分化中的作用, 研究首先利用兼并引物从马氏珠母贝基因组中克隆到一个HMG框(high mobility group box), 利用RACE-PCR技术从SMART cDNA文库中克隆到一个Sox基因的cDNA全长, 通过Clustal X和MEGA 4软件对该序列进行比对分析并构建系统进化树; 通过荧光定量PCR技术对该基因在不同组织及发育不同时期性腺中的表达情况进行分析。结果显示, 马氏珠母贝该Sox基因的cDNA全长为1579 bp, 其中开放阅读框(ORF)为1008 bp, 编码336个氨基酸, 5'非编码区为126 bp, 3'非编码区为445 bp。同源性分析表明, 马氏珠母贝Sox基因与太平洋牡蛎Sox11基因的同源性(Identity)最高, 为80%, 故命名为pmSox11; 系统进化树分析也显示pmSox11与太平洋牡蛎Sox11基因的亲缘关系最近。荧光定量PCR分析组织表达特异性显示, pmSox11在马氏珠母贝神经节分布较多的组织如外套膜、鳃、足、消化盲囊等大量表达, 在神经节相对较少的闭壳肌和卵巢中表达量较少; 时序表达图谱显示, pmSox11在3月龄幼贝性腺和1年龄发育早期精巢中表达量最高, 在2年龄成熟精巢和2年龄性转换性腺中表达量降低, 而在2年龄卵巢中表达量最低。研究表明, pmSox11基因可能在马氏珠母贝早期神经系统发育和性别发育的调控方面起到重要作用。     

赤眼鳟MyD88基因cDNA克隆与表达特性研究

实验使用RACE-PCR技术获得了赤眼鳟(Squaliobarbus curriculus)髓样分化因子88 (Myeloid differentiationfactor 88, MyD88)的cDNA全长, 命名为ScMyD88。ScMyD88的cDNA全长为1779 bp, 其中开放阅读框855 bp, 共编码284个氨基酸残基, 推导的蛋白质分子量为33.053 kD, 理论等电点为5.66。赤眼鳟MyD88具有典型的MyD88结构特征, 包括死亡结构域和TIR结构域(Toll-IL-1 receptor domain, TIR), 其氨基酸序列和鲤科鱼类具有高度保守性, 相似性达到了90%以上, 特别是和武昌鱼相比, 相似性达到了98%。在检测的9个赤眼鳟组织和器官中均有MyD88表达, 其中肝脏、头肾和体肾中表达水平最高, 在脑中表达量最低。在草鱼呼肠弧病毒(Grass carp reovirus, GCRV)感染初期(12h内), MyD88在赤眼鳟免疫组织中表达水平急剧上升, 特别是在脾脏和体肾中尤为明显, 随后恢复正常水平。研究表明, MyD88在赤眼鳟抵抗GCRV入侵的免疫应答反应初期发挥了重要作用。     

虹鳟spindlin基因克隆及不同倍性的表达分析

spindlin基因是减数分裂纺锤体相关因子,为了研究spindlin基因在二倍体和三倍体雌性虹鳟减数分裂过程中出现的差异,通过cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得spindlin基因cDNA 4529 bp(GenBank登录号:MN378564),其中3′非编码区(UTR)和5′非编码区(UTR)分别长3662 bp和141 bp,开放阅读框(ORF)长726 bp,编码241个氨基酸,该蛋白质序列的相对分子量为28.3 kD,理论等电点值为5.94,无跨膜结构。同源性分析表明,虹鳟(Oncorhynchus mykiss)与银大马哈鱼(Oncorhynchus kisutch)同源最高,高达99.59%。系统发育进化树显示,虹鳟与大鳞大马哈鱼(Oncorhynchus tshawytscha)和红点鲑(Salvelinus alpinus),聚为一支。实时荧光定量(RT-PCR)结果显示, spindlin基因在二倍体雌性虹鳟卵巢、肾、肝、脾、肌、鳃、心、眼、肠和鳍组织中均有表达,其中,在卵巢中的表达量极显著高于其他组织(P<0.01)。对于二倍体雌性虹鳟,在受精后24...     

鲫两种不同生长激素cDNA的分子克隆和分析

从鲫脑垂体组织提取总RNA ,采用 3′RACE PCR的方法 ,从单一垂体总RNA中扩增出编码两种不同类型鲫生长激素的cDNA :生长激素Ⅰ (GrowthhormoneⅠ ,GHⅠ )和生长激素Ⅱ (GrowthhormoneⅡ ,GHⅡ )。将两种类型的鲫GHcDNA分别克隆到pGEM TEasyVector上进行序列测定和分析。克隆的鲫GHⅠ和GHⅡcDNA均包括编码 188个氨基酸残基的GH成熟肽序列和 3′端的非翻译区 ,但不含信号肽序列和 5′端非编码区。序列分析结果表明 ,鲫GHⅠ的碱基序列和推测的氨基酸序列与国外已经发表的金鱼GHⅠ的同源性分别为 98 7%和 97 9% ;GHⅡ的碱基序列和推测的氨基酸序列与金鱼GHⅡ的同源性分别为 99 1%和 99 5% ,虽然同源性较高 ,但仍具有一定的差异     

赤眼鳟Toll样受体3基因cDNA全长克隆及表达分析

为探究赤眼鳟（Squaliobarbus curriculus）Toll样受体3（Toll-like receptor 3,ScTLR3）基因是否参与抗病毒免疫反应,实验运用RACE技术,克隆得到ScTLR3基因cDNA全长序列,并进行了生物信息学分析;通过Real-Time qPCR技术,检测了ScTLR3 mRNA在健康赤眼鳟10个组织中的分布以及感染草鱼呼肠孤病毒（GCRV）后肝脏、脾脏、体肾和头肾中的表达特征。结果表明:ScTLR3基因cDNA序列全长4043 bp,包括5-非编码区（UTR）216 bp,开放阅读框（ORF）2715 bp和3-UTR 1112 bp;ScTLR3共编码904个氨基酸残基,推导的蛋白分子量102.67 kD,理论等电点8.76;SMART结构域预测显示,ScTLR3由N端的信号肽（SP）、富亮氨酸结构域（LRRs）、跨膜结构域（TM）和C端的Toll/白介素-1受体结构域（TIR）组成。实时荧光定量结果显示,ScTLR3mRNA在检测的各组织中均有表达,肝脏中的相对表达量极显著高于其他组织（P0.01）;感染GCRV后,肝脏、脾脏、体肾和头肾组织中ScTLR3 mRNA均上调表达,肝脏、脾脏和体肾组织中的相对表达量在24h达到峰值,分别为对照组的5倍、7倍和6倍。研究表明,ScTLR3具有TLRs家族基因的典型结构特征,并能被GCRV诱导表达,推测其在赤眼鳟抗GCRV入侵免疫反应中发挥了重要作用。     

金鱼不同组织器官及胚胎发育不同时期蛋白水解酶的种类和活性变化

采用复性电泳方法研究了金鱼组织器官蛋白水解酶及个体发生过程中蛋白水解酶的种类和活性变化,主要结果表明：⑴金鱼各组织器官蛋白水解酶种类差异不大,大多数组织器官都具有１１３、６９、２０、１６ｋＤ四条带,但不同组织器官常具有其特异性蛋白水解酶;肠道蛋白水解酶种类最多、活性最强。⑵蛋白水解酶的活性受ｐＨ值影响和制约,大多数组织器官蛋白水解酶活性最适ｐＨ值为８．５。⑶在金鱼胚胎发育早期（从卵裂到心跳期）多数     

草鱼cadm2b基因的克隆及在成体组织中的表达分析

为研究CADMs（Cell adhesion molecules）在草鱼构建抵御病害感染的第一道防线中发挥的作用,用RT-PCR和RACE方法结合测序分析,在草鱼脑组织中检测到了该基因家族成员cadm2b基因的4条不同的cDNA全长序列。序列比对结果表明这4条全长cDNA在5'端的序列完全相同,在3'端的3个局部区域有不同片段的缺失。因此,可以确定这4条不同的mRNA是cadm2b的不同剪接体。这4条不同的剪接体被分别命名为cadm2b、cadm2bX2、cadm2bX3和cadm2bX6。cadm2b的cDNA序列全长1669 bp,开放阅读框（ORF）1203 bp,编码400个氨基酸。cadm2bX2的cDNA序列全长2783 bp,开放阅读框长1323 bp,编码440个氨基酸;cadm2bX3的cDNA序列全长2755 bp,开放阅读框1296 bp,编码431个氨基酸;cadm2bX6基因的cDNA序列全长2649 bp,开放阅读框1161 bp,编码386个氨基酸。根据碱基序列所进行的氨基酸序列和蛋白结构预测显示这4个CADM2b蛋白亚型都具有CADM家族保守的4个功能区,但其C端的蛋白结合位点存在差异。CADM2b具有近膜4.1蛋白结合位点和Ⅱ型PDZ蛋白结合位点,CADM2bX2、X3缺失了PDZ蛋白结合位点,而CADM2bX6则同时缺失4.1蛋白和PDZ蛋白的结合位点。实时定量RT-PCR检测结果显示cadm2b剪接突变体是该基因mRNA的主要形式。半定量RT-PCR和套式PCR实验检测结果表明cadm2b基因在草鱼成体脑中高水平表达,在肝、肾、心脏和肌肉组织中有微量表达。这种表达模式提示草鱼中CADM2b主要是由非免疫细胞,而不是由免疫肥大细胞合成分泌的细胞黏附因子,可能通过介导免疫肥大细胞与病原靶细胞的黏附而起非特异性抵御病害感染的作用。