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烟草β—1,3—葡聚糖酶cDNA克隆,大肠杆菌表达及植物表达载体的 … 总被引:2,自引:0,他引:2
用0.15%乙烯利诱导烟草幼苗后,提取叶片总RNA,并通过反转录及多聚酶链式反应(RT-PCR)扩增出β-1,3-葡聚糖酶基因的cDNA。将其克隆至载体pBluescript SK后,完成了此基因的全序列分析。测序结果表明:所克隆的cDNA除第1008位碱基与所报道的不同外,其它序列完全一致。为制备抗血清,构建了此基因的大肠杆菌表达载体,并在表达宿主菌BL21(DE3)plyS中得到表达,进行了W 相似文献
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烟草Ⅰ类几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶cDNA在大肠杆菌中的表达 总被引:8,自引:0,他引:8
对经过修饰的烟草Ⅰ类几丁质酶(Ⅰchitinase,ⅠChi)和β1,3葡聚糖酶(Ⅰglucanase,ⅠGlu)cDNA分别构建了原核表达载体,并转化大肠杆菌BL21。经IPTG诱导表达,SDSPAGE法证明表达产物ⅠChi和ⅠGlu的分子量分别约为30kDa和31kDa,在菌内以包涵体形式存在。经包涵体的收集、洗涤、裂解和复性,两种表达产物在体外均表现出较强的抑病原真菌活性,且ⅠChi的抑菌活力大于ⅠGlu,二者具有很强的体外抑菌协同性 相似文献
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对经过修饰的烟草Ⅰ类几丁质酶(Ⅰ—chitnaseⅠ-Chi)和β-1,3-葡聚糖酶(Ⅰ—gIu—canase,Ⅰ-Glu)cDNA分别构建了原核表达载体,并转化大肠杆菌BL2l。经IPTG诱导表达,SDS-PAGE法证明表达产物Ⅰ—Chi和Ⅰ—Glu的分子量分别约为30kDa和31kDa,在菌内以包涵体形式存在。经包涵体的收集、洗涤、裂解和复性,两种表达产物在体外均表现出较强的抑病原真菌活性,且Ⅰ-chi的抑菌活力大于ⅠI—Glu,二者具有很强的体外抑菌协同性。 相似文献
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燕麦β-1,3-葡聚糖酶Ⅱ基因 3'端cDNA的克隆及分析 总被引:1,自引:0,他引:1
实验利用3'-RACE技术进行燕麦β-1,3-葡聚糖酶Ⅱ(Oglc13Ⅱ)3'末端cDNA的快速扩增并进行序列分析.将0.01%的HgCl2诱导处理24h之后的燕麦(Avena Sativa)幼叶作为材料,利用RT-PCR技术得到Oglc13Ⅱ的部分cDNA片段,根据此片 段设计一条特异性上游引物,反转录引物中的部分序列即3'sites Adaptor Primer作为下游引物,按3'RACE试剂盒(Takara)操作流程进行Oglc13Ⅱ3'末端cDN A的快速扩增,成功获取837bp的3'-RACE反应产物,通过BLAST技术,发现该片段与 许多植物β-1,3-葡聚糖酶基因具有较高的相似性(50.0%~72.0%).因此认为成功 克隆了Oglc13ⅡcDNA的3'末端序列. 相似文献
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燕麦β-1,3-葡聚糖酶Ⅱ基因 3'端cDNA的克隆及分析 总被引:2,自引:1,他引:1
实验利用3'-RACE技术进行燕麦β-1,3-葡聚糖酶Ⅱ(Oglc13Ⅱ)3'末端cDNA的快速扩增并进行序列分析.将0.01%的HgCl2诱导处理24h之后的燕麦(Avena Sativa)幼叶作为材料,利用RT-PCR技术得到Oglc13Ⅱ的部分cDNA片段,根据此片段设计一条特异性上游引物,反转录引物中的部分序列即3'sites Adaptor Primer作为下游引物,按3'RACE试剂盒(Takara)操作流程进行Oglc13Ⅱ3'末端cDNA的快速扩增,成功获取837bp的3'-RACE反应产物,通过BLAST技术,发现该片段与许多植物β-1,3-葡聚糖酶基因具有较高的相似性(50.0%~72.0%).因此认为成功克隆了Oglc13ⅡcDNA的3'末端序列. 相似文献
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实验利用3′-RACE技术进行燕麦β-1,3-葡聚糖酶Ⅱ(Oglc13Ⅱ)3′末端cDNA的快速扩增并进行序列分析。将0.01%的HgCl2诱导处理24h之后的燕麦(Avena Sativa)幼叶作为材料,利用RT-PCR技术得到Oglc13Ⅱ的部分cDNA片段,根据此片段设计一条特异性上游引物,反转录引物中的部分序列即3′sites Adaptor Primer作为下游引物,按3′RACE试剂盒(Takara)操作流程进行Oglc13Ⅱ3′末端cDNA的快速扩增,成功获取837bp的3′-RACE反应产物,通过BLAST技术,发现该片段与许多植物β-1,3-葡聚糖酶基因具有较高的相似性(50.0%~72.0%)。因此认为成功克隆了Oglc13ⅡcDNA的3′末端序列。 相似文献
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β—1,3葡聚糖酶与糖体失活蛋白融合基因的制备及表达载体的构建 总被引:2,自引:0,他引:2
将大豆的β-1,3葡聚糖酶基因与玉米的核糖体失活蛋白基因通过一个6个氨基酸的柔性短肽链连接起来,形成1个融合蛋白。编码区基因长1830bp,共编码609个氨基酸和1个终止密码子。经过使用蛋白质分析软件Antheprot4.3和Prosis(v5.00)对融合蛋白的二级结构、理化特性、潜在信号肽断裂位点等方面进行分析表明:融合蛋白较好的保持了原来的两个蛋白的各项理化特性,维持了两种蛋白的二级结构。将此基因克隆质粒PBI121上,构建成植物表达载体PBI/GR。 相似文献
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淀粉液化芽孢杆菌β1-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的克隆及表达 总被引:2,自引:0,他引:2
为了比较不同的表达系统对β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(bgl)的效果,本研究将高产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的淀粉液化芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens BS5582的bgl基因(GenBank Accession No.EU623974)克隆到3种不同的质粒载体中,即构建pEGX-4T-1-bgl、pET20b(+)-bgl和pET28a(+)-bgl重组质粒.比较了pEGX-4T-1-bgl,在不同Escherichia coli宿主中表达效果,以及pET20b(+)-bgl和pET28a(+)-bgl在E coli BL21(DE3)中的表达效果.结果表明,E. coli BL21(DE3)-pET28a(+)-bgl能够表达最高的重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶活,其总酶活可达(322.0±8.8)U/mL,是出发菌在最适摇瓶发酵条件下产酶活的40.1%.对该重组菌的产酶条件进行了分析,结合IPTG和乳糖协同的诱导作用,在基础产酶培养基中产最高总酶活为(1883.3±45.8)U/mL,表明其具有良好的工业应用价值. 相似文献
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β-1,3-葡聚糖酶在植物抗真菌病基因工程中的研究进展 总被引:3,自引:0,他引:3
β-1,3-葡聚糖酶是植物抗真菌病的重要抗性物质之一,植物β-1,3-葡聚糖酶可由病原物(如Mg)、化学因子(如水杨酸、乙烯、赤霉素)或物理因子(如紫外线照射、机械损伤)等多种生物因子和非生物因子诱导产生.将外源β-1,3-葡聚糖酶基因导入植物,可提高植物的抗真菌病害的能力;而将β-1,3-葡聚糖酶基因与其他防卫蛋白基因同时导入植物,将更大程度的提高植物的抗真菌病能力,是植物抗真菌病防治的有效新途径.文章中主要对β-1,3-葡聚糖酶的生物学特性、植物β-1,3-葡聚糖酶基因在转基因植株中的独立表达及其与其他抗真菌病基因的协同表达等进行了综述. 相似文献
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β-1,3-葡聚糖酶基因高效表达载体的构建及对小麦的转化 总被引:10,自引:0,他引:10
利用PCR方法设计引物,进行特异扩增,在得到的BG2基因片段的两端引入可以与表达载体多克隆位点相匹配的酶切位点,将该基因插入高效表达载体质粒pATC940中,获得表达质粒pATCBG2。通过基因枪转化法,将pATCBG2转化优质小麦品种龙辐麦10、龙辐麦3号,获得抗卡那霉素(Kanamycin)的再生植株,经PCR,PCR—Southern和Dot—blotting检测,结果表明,有5个转基因植株在以上各项检测中全为阳性,证明目的基因已整合人这些转基因小麦基因组中。田间接菌发病检测结果表明,转基因植株比对照的抗病性提高1~2级。 相似文献
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淀粉液化芽孢杆菌b-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的克隆及表达的优化 总被引:1,自引:0,他引:1
为了比较不同的表达系统对β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(bgl)的效果,本研究将高产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的淀粉液化芽孢杆菌Bacillus amylolique faciens BS5582的bgl基因(GenBank Accession No.EU623974)克隆到3种不同的质粒载体中,即构建pEGX-4T-1-bgl、pET20b(+)-bgl和pET28a(+)-bgl重组质粒。比较了pEGX-4T-1-bgl在不同Escherichiacoli宿主中表达效果,以及pET20b(+)-bgl和pET28a(+)-bgl在E.coliBL21(DE3)中的表达效果。结果表明,E.coliBL21(DE3)-pET28a(+)-bgl能够表达最高的重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶活,其总酶活可达(322.0±8.8)U/mL,是出发菌在最适摇瓶发酵条件下产酶活的40.1%。对该重组菌的产酶条件进行了分析,结合IPTG和乳糖协同的诱导作用,在基础产酶培养基中产最高总酶活为(1883.3±45.8)U/mL,表明其具有良好的工业应用价值。 相似文献
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为探明β-1,3-葡聚糖酶基因(β-1,3-glucanase)对油菜(Brassica campestris)抵御低温胁迫能力的作用,通过蛋白质谱分析得到β-1,3-葡聚糖酶蛋白,采用RT-PCR技术克隆白菜型冬油菜(B.rapa)陇油6号和天油4号β-1,3-葡聚糖酶的c DNA序列;并对该序列进行生物信息学分析;进而采用实时荧光定量PCR及半定量PCR检测β-1,3-葡聚糖酶基因在低温胁迫下的表达模式。结果获得长度为1 032 bp的陇油6号β-1,3-葡聚糖酶基因开放阅读框,编码343个氨基酸,相对分子量为38.102k Da,理论等电点为6.63,其与菜心(B.rapa subsp.chinensis)和甘蓝型油菜(B.napus)的蛋白质氨基酸序列同源性高达93.94%。该基因编码的酶是一个主要由α-螺旋组成的亲水性稳定蛋白,含有1个信号肽,存在2个跨膜结构域。该基因在进化上高度保守,其保守序列属于植物的糖基水解酶家族17特有的保守结构域。β-1,3-葡聚糖酶基因表达模式分析显示,4°C时该基因上调表达,继续低温(–4°C)胁迫处理,该基因上调表达至峰值,至–8°C时其表达下调。研究表明从白菜型冬油菜中克隆的β-1,3-glucanase在冬油菜品种陇油6号抗寒过程中发挥作用。 相似文献
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为了探索反应温度对产物组分的影响,利用自制连续变化的温度梯度实验装置,研究了22 ℃~60 ℃ (±0.1 ℃) 区间内温度对一内切β-1,3-葡聚糖酶酶解酵母β-葡聚糖的影响,获得了酶解过程多点温度特性数据。分析表明:该酶酶解酵母β-葡聚糖的活化能为84.17 kJ/mol;以产物积累表示的最适酶解温度随时间延长呈指数下降;酶解产物组分受温度的影响,低温较高温获得的寡糖链长,高温区大于46 ℃可以获得以昆布二糖、昆布三糖为主的组分,而低温区小于30 ℃可以获得昆布五糖及更大分子量的产物。研究结果可为寡糖 相似文献
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产β-1,3-葡聚糖酶植物内生放线菌的筛选及抑菌活性研究 总被引:3,自引:0,他引:3
本研究采用透明圈法, 对217株植物内生放线菌产β-1,3-葡聚糖酶进行了检测, 结果表明: 45.6%的菌株能够产生β-1,3-葡聚糖酶, 黄瓜内生放线菌中的产酶菌株最多为38个; 不同植物来源的内生放线菌中具有产β-1,3-葡聚糖酶能力的菌株比例不同, 其中黄精中的产酶菌株比例最高, 达到88.9%。产酶菌株粗酶液对油菜菌核病菌的抑菌活性测定结果发现, 36个产酶菌株的粗酶液表现出不同程度的抑制作用, 占总产酶菌株的36.4%, 其中菌株gCLA4的粗酶液能够完全抑制病菌菌丝生长。对gCLA4菌株产酶 相似文献
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天麻球茎几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶的初步研究 总被引:3,自引:0,他引:3
天麻(Gastrodia elata)是真菌寄生植物。密环菌侵入初生球茎并在其皮层被消化,营养物供次生球茎生长需要;密环菌不能侵染生长小的次生球茎。我们从初生球茎分离并纯化了几丁质酶和β—1,3—葡聚糖酶,分子量各为31.5 kD和94kD,得率各为0.8和0.4 mg/100 g鲜重。纯化几丁质酶的内切酶比活为208 nmol GlcNAc s~(-1)mg~(-1),外切酶比活为4.1 nmol GlcNAcs~(-1)mg~(-1);纯化葡聚糖酶比活为546 nmol Glc s~(-1)mg~(-1)。以相同鲜重计,初生球茎中二种酶的总活性各为次生球茎的34和56倍;这主要是由于次生球茎的酶比活性很低。二种酶对平板上培养的木霉菌丝的生长均有抑制作用,但抑菌活性均较天麻抗真菌蛋白(GAFP)低。我们认为这两种酶在天麻初生球茎消化密环菌菌丝的过程中起重要作用,而对天麻球茎阻止和限制密环菌侵染的抗菌作用贡献甚少,后者主要属于天麻抗真菌蛋白。 相似文献
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提取了台湾家白蚁总RNA并反转录获得eDNA,PCR扩增出白蚁内切葡聚糖酶的基因,并将目的基因分别克隆到大肠杆菌和酿酒酵母载体中,构建了产内切-β-1,4-葡聚糖酶的基因工程菌。由于大肠杆菌会有少量的泄漏表达,而所用的酿酒酵母表达载体是本实验室构建带有INU信号肽的表达载体,故都可采用刚果红平板染色法筛选具有羧甲基纤维素酶(CMCase)活性的重组转化子。利用金属镍亲和层析对大肠杆菌表达的内切-β-1,4-葡聚糖酶进行纯化,CMC酶活检测显示纯化酶的最适温度和最适pH值分别为42℃、6.5;内切-β-1,4-葡聚糖酶的Vmax为0.071mg/mL·min,Km值为80.2712mg/mL。 相似文献