鸡γ干扰素的可溶性表达及纯化产物的抗病毒活性

【目的】克隆鸡γ-干扰素（chIFN-γ）基因,大肠杆菌表达及产物纯化与活性检测。【方法】通过RT-PCR方法用ConA刺激的20日龄SPF鸡的脾脏淋巴细胞中扩增出chIFN-γ成熟蛋白基因cDNA,克隆至原核表达载体pET-32a (+),构建重组表达质粒pET-32a (+)-chIFN-γ,在大肠杆菌BL21（DE3）中经IPTG诱导表达,利用镍柱亲和层析法纯化可溶性蛋白,并进行SDS-PAGE、Western blot鉴定。利用MDCK-VSV系统测定抗病毒活性。【结果】克隆得到456 bp 的chIFN-γ成熟蛋白编码基因,大肠杆菌中成功表达chIFN-γ蛋白,分子量约为31.0 kDa,能与抗His的单克隆抗体和兔源多抗血清发生特异性反应。表达蛋白一部分形成包涵体,另一部分以可溶形式存在,可溶性蛋白经镍柱在天然条件下的纯化得率为3.0 mg/mL。生物学活性试验表明,1:32 稀释纯化的重组chIFN-γ （rchIFN-γ）孵育MDCK细胞后能抵抗100TCID50的VSV攻击。【结论】通过镍柱天然纯化获得的rchIFN-γ具有较好的抗病毒活性,为研制新型抗病毒干扰素制剂奠定基础。     

重组人干扰素λ1的表达、纯化及生物活性研究

目的:利用大肠杆菌系统表达重组人Ⅲ型干扰素λ1(rhIFN-λ1),并进行纯化,以比较其与重组人干扰素-α2b(rhIFN-α2b)生物学活性的差异。方法:密码子优化的rhIFN-λ1基因与pET-44a载体连接构建原核表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,表达产物经系列层析纯化;采用细胞病变抑制法比较纯化的rhIFN-λ1与rhIFN-α2b、市售rhIFN-λ1的抗病毒活性;采用MTS法比较这些干扰素的抗肿瘤细胞增殖活性。结果:基因优化后的rhIFN-λ1在大肠杆菌中得以高效表达,用所建立的纯化工艺可制备得到纯度达95.7%的rhIFN-λ1;rhIFN-λ1的抗病毒比活性为3.2×105 U/mg,比市售rhIFN-λ1的比活性(1.1×105 U/mg)略高,抗肿瘤细胞增殖活性为rhIFN-α2b的1.7倍。结论:获得的rhIFN-λ1具有剂量依赖的抗病毒活性和抗增殖活性,其抗病毒活性比市售rhIFN-λ1略高,抗细胞增殖活性高于rhIFN-α2b,提示rhIFN-λ1有较大的应用前景。     

干扰素-tau的原核表达、纯化和活性测定

干扰素-tau (IFN-tau)是一种新发现的I型干扰素,为了更清楚的研究它的生物学功能,在已克隆IFN-tau cDNA的基础上,PCR扩增出IFN-tau ORF,与原核表达载体pBV220重组后,成功的构建了IFN-tau的原核表达质粒pBV220/IFN-tau。重组质粒转化大肠杆菌BL21,该菌经过诱导,用凝胶过滤色谱层析的方法获得了纯化的目的蛋白,该蛋白经过氨基酸序列分析证实是IFN-tau ;用细胞病变抑制法测定IFN-tau经过透析复性后的活性为2.09×106IU/ml,比活性为2.35×106IU/mg。     

一种人新型基因工程干扰素rh-IFNα-m的高效表达、纯化和活性检测

为实现干扰素 (IFNα m)的高表达与纯化 ,研究其抗病毒、抗增殖活性。应用PCR技术将已构建的IFNα m的高表达基因亚克隆到原核表达载体pBV2 2 0上 ,构建表达质粒 pBV2 2 0 /IFNα m ,转化大肠杆菌DH5α进行表达。表达产物经初步检定以包涵体形式存在 ,包涵体进行变性、复性 ,然后经CM Sepharose FF、DEAE Sepharose FF离子交换层析和Sephacryal HR10 0分子筛纯化 ,获得较纯的干扰素IFNα m。以IFNα 1b为对照 ,在VSV Wish系统上采用细胞病变抑制法 ,测定纯品IFNα m的抗病毒活性。在Hela细胞上用MTT法进行抗增殖实验。结果表明包涵体含量占菌体总蛋白 4 0 % ,纯化的目的蛋白IFNα m纯度在 95 % ,比活高达 1 2 6× 10 7IU/mg ,纯化收率34 4 % ,IFNα m抗病毒活性和IFNα 1b相当 (P >0 0 5 ) ,抗增殖活性高于IFNα 1b(P <0 0 1)。     

干扰素-β1b的高效表达、纯化及抗病毒活性研究

IFN-β1b是大肠杆菌产生的17位Cys被Ser替换的人IFN-β的类似物,为了获得高表达,使用了大肠杆菌的偏爱密码子,人工合成了IFN-β-1b基因,插入质粒pBV220中,转化大肠杆菌DH5α.IFN-β1b的制备过程,包括发酵和一系列的纯化步骤.经修饰,IFN-β1b基因在启动子PRPL控制下发酵表达,合成的蛋白质以包涵体的形式存在.培养的细菌经收集、裂解后,将包涵体释放出来,包涵体经含SDS的溶液溶解,DTT还原.纯化过程包括有机溶剂抽提、分子筛层析、脱盐、氧化复性和反相层析,并用旋转蒸发除去有机溶剂.IFN-β-1b在不同种系来源的细胞上显示不同的抗病毒活性.     

融合干扰素-BLA（IFN-BLA）的构建、表达、纯化及抗病毒活性测定

干扰素-BLA(IFN-BLA)由干扰素-beta-1b(IFN-beta-1b)和干扰素-alpha-2b（IFN-alpha-2b）通过连接肽-GGGS-融合而成。优化了其在大肠感菌BL21 CodonPlus (DE3)-RIL中的实验室表达条件,表达的目的蛋白占菌体总蛋白的35％以上并且主要以包涵体的形式存在。对包涵体的复性条件进行了摸索,建立了IFN-BLA的复性及纯化方法,纯化后的蛋白产量约为45 mg/L, 纯度在90％以上。抗病毒活性分析表明这一新的融合蛋白可能具有协同或加成活性。     

新型猫源干扰素FeIFN-ω与干扰素FeIFN-α的表达及抗病毒活性比较

ω型干扰素(IFN-ω)与α型干扰素(IFN-α)同属于Ⅰ型干扰素,都具有抗病毒,抗增殖和免疫调节的功能,但它们之间的活性却存在较大差异.通过PCR扩增猫ω型干扰素基因(FeIFN-ω),根据GenBank公布的猫α型干扰素基因序列,合成猫α型干扰素基因(FeIFN-α).分别构建原核表达载体pET-His/FeIFN-α和pET-His/FeIFN-ω,转化大肠杆菌Rosetta(DE3)进行表达.表达产物经Ni-NTA亲和层析纯化,复性后蛋白用细胞病变抑制法进行抗病毒活性测定.结果显示,重组猫ω型干扰素(FeIFN-ω)抗病毒活性明显高于重组猫α型干扰素(FeIFN-α),尤其对H9N2亚型禽流感病毒(AIV),FeIFN-ω的活性是FeIFN-α的160倍,对犬瘟热病毒(CDV),FeIFN-ω的活性是FeIFN-α的4倍,而日本同类产品Intercat 对CDV和AIV均未表现活性.以上研究为以ω型干扰素为基础的抗病毒药物应用奠定了重要的理论基础.     

重组人TNF-α在大肠杆菌表达、纯化及生物学活性鉴定

[目的]获得人TNF-α蛋白,并鉴定其生物学活性。[方法]通过对人源TNF-α序列进行密码子优化构建了p Cold-TNFα原核表达载体,完成了TNF-α重组蛋白的表达,建立了两步分离纯化方案,并利用Western Blot和细胞刺激实验检测了重组人TNF-α蛋白抗原性和生物学活性。[结果]利用大肠杆菌成功表达重组人TNF-α蛋白,经酶切纯化后的人TNF-α蛋白不含标签序列,纯度达95%,收率约70%,并具有良好的生物学活性。[结论]获得具有生物学活性的人TNF-α蛋白,为进一步的中和抗体研究奠定了基础。     

猪α-干扰素的原核表达及活性测定

目的：表达并纯化出具有生物学活性的重组猪α-干扰素。方法：根据前期合成的猪α-干扰素基因序列设计引物,用PCR方法扩增出猪α-干扰素基因,并将其定向克隆入原核表达载体pET28中,酶切及测序鉴定正确后,转化大肠杆菌BL21进行诱导表达,对表达产物通过镍琼脂糖凝胶柱亲和层析纯化、透析法复性后,采用微量细胞病变抑制法测定重组猪α-干扰素的活性。结果：测序结果表明构建了猪α-干扰素原核表达载体pET28-poIFN-α;诱导表达后经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约21×10^3的位置出现明显的诱导蛋白条带,与目的蛋白大小相近;经分析表达产物主要以包涵体形式存在,约占菌体总蛋白的36%,纯化后的目的蛋白纯度约为90%;采用微量细胞病变抑制法测定其活性约为1.67×10^6U/mg。结论：获得了纯度较高并具有较高活性的重组猪α-干扰素,为下一步研究猪α-干扰素药物价值及其生物制剂的生产、应用奠定了基础。     

rPA(K)的原核表达及其产物的初步纯化

rPA(K)是经过缺失/定点突变技术所获得的t-PA突变体。本实验以IPTG诱导,实现了rPA(K)在原核系统中的表达。实验证明目的产物的表达形式为包涵体,且当以IPTG诱导3h时,表达量最高,为41%。此后对该表达产物进行了初步纯化,即通过对不同超声破碎次数,包涵体洗涤液(脲,Triton X-100,乙醇)的不同浓度对纯化的影响因素进行了摸索。结果表明,超声2次,2M脲,0.5%Triton X-100,20%乙醇对目的蛋白纯化的效果最好,从而为进一步的纯化和复性奠定基础。     

IGFBP-3高效可溶表达、纯化及生物学活性初步研究

克隆胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP-3)的cDNA片段,构建原核表达载体pET-DsBA-IGFBP3。将该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS中,诱导表达IGFBP-3融合蛋白(简称D-IGFBP3)。经检测融合蛋白主要以可溶形式表达。表达产物用His亲和层析柱纯化,获得了纯度超过95%的重组IGFBP-3融合蛋白。Western-blot结果表明在相应分子量处有一条特异性条带。细胞活性研究显示它对MCF-7细胞生长具有一定的抑制作用,且在体外具有与IGF-I结合的活性。     

人干扰素和脑啡肽融合蛋白的表达和生物学活性

以INFα-m基因为模版,采用overlapping PCR技术构建甲硫氨酸脑啡肽干扰素表达质粒pBV220/Enk-/Met-INFα-m,转化大肠杆菌DH5α表达,产物以包涵体形式存在.包涵体经分离、变性、复性,然后经CM-Sepharose-FF、DEAE-Sepharose-FF离子交换层析和Sephacryal-HR100分子筛纯化,获得较纯的Enk-IFNα-m融合蛋白.生物活性检测表明,融合蛋白不仅具有干扰素的抗病毒、抗增殖、增强NK细胞功能的活性,而且具有脑啡肽的脑内镇痛作用.     

切胶纯化表达蛋白包涵体的可行性分析

目的:高效率地纯化以包涵体形式表达的蛋白。方法:将SDS-PAGE电泳后的目的蛋白用4mol/L的乙酸钠显现出来,切割下来的目的蛋白可直接用于免疫,将切割下来的目的蛋白装在透析袋中,在电场中将游离的目的蛋白洗脱下来可用于ELISA检测。结果:用该法得到的蛋白经ELISA和Western blot检测均能保持其原有的抗原性,并用该法纯化的蛋白成功制备了相应的多抗和单抗。结论:证实了回收的蛋白仍能保留原有的抗原性,与传统的方法比较,方法简单且比较经济实用特别是包涵体,为切胶纯化蛋白提供了一个新的方法。     

重组人RGD-sTRAIL的表达、纯化及抗肿瘤活性研究

利用PCR技术构建RGD短肽与人肿瘤坏死因子凋亡配体(胞外区114-281)的融合基因,将该DNA片段克隆到原核表达载体pET-11a中。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后可表达相对分子质量约为20000的目的蛋白,占菌体蛋白的20％左右,且大多数重组蛋白以不溶的包涵体形式存在。Western印迹表明目的蛋白具有人sTRAIL的抗原性。表达产物经变性、复性、离子交换层析和分子筛等步骤,可以得到纯度大干95％的RGD-sTRAIL重组蛋白。肿瘤细胞体外实验发现,纯化后的RGD-sTRAIL重组蛋白能明显抑制人肺癌细胞A549生长,并呈剂量依赖性。研究结果表明,通过复性,包涵体中的RGD-sTRAIL蛋白得到正确的折叠,并在体外具有杀伤肿瘤细胞的活性,从而为进一步研究体内靶向性杀伤肿瘤细胞奠定了基础。     

北极狐g-干扰素cDNA的克隆、表达及活性测定

为研究狐g-干扰素的生物学活性, 应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从北极狐外周血淋巴细胞中扩增出g-干扰素(VuIFN-g)cDNA。序列分析表明VuIFN-g cDNA全长501 bp, 编码23个氨基酸的信号肽和144个氨基酸的成熟肽蛋白, 与已发表的银黑狐和犬IFN-g 核苷酸序列同源性为99.8%和99.4%; 氨基酸同源性均为100%。应用原核表达系统高效表达北极狐g-干扰素成熟肽蛋白, SDS-PAGE和Western blotting分析表达的融合蛋白分子量约为19 kD, 以不溶性的包涵体形式存在。重组蛋白经纯化和复性, 在Vero和MDCK细胞上可明显抑制VSV病毒的复制, 并测出北极狐重组g-干扰素的活性单位分别为1.0×106 u/mg和1.56×105 u/mg, 为进一步开发基因工程狐干扰素奠定基础。     

蓝藻抗病毒蛋白-N基因的克隆、表达、纯化及活性鉴定

蓝藻抗病毒蛋白-N(Cyanovirin-N,CVN)具有强效抗HIV及其他包膜病毒活性,该蛋白序列特殊,难以重组制备,在大肠杆菌细胞质中形成包涵体。本研究根据大肠杆菌密码子偏好性对CVN原始核苷酸序列进行优化,通过多次PCR合成SUMO-CVN的全长DNA序列,构建pET3c-SUMO-CVN重组表达质粒,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),获得表达菌株。通过对诱导剂浓度和诱导时间的优化,发现以0.5mmol/LIPTG在20℃诱导24h可获得最高表达,SDS-PAGE结果显示,SUMO-CVN为可溶性表达,表达量占菌体总蛋白的28%;经特异性的SUMO蛋白酶对融合蛋白进行酶切及两步Ni-NTA凝胶亲和层析可以得到纯度较高的重组CVN蛋白。ELISA结果表明,重组蛋白CVN与gp120蛋白有较高的亲和力。体外抗病毒活性实验表明,重组蛋白CVN在纳摩尔浓度具有很好的抗HSV-1和HIV-1/ⅢB活性;这为开发基于CVN的新型、高效抗病毒药物打下了基础。     

人精氨酸酶在毕赤酵母的高效表达、纯化和活性研究

目的：人精氨酸酶（Arginase, Arg）的基因arg在毕赤酵母高效分泌表达,建立相应纯化工艺路线,研究重组人精氨酸酶的活性。方法：将人精氨酸酶基因arg按正确的阅读框架插入到毕赤酵母表达载体pPIC9α信号肽基因后,构建得到重组毕赤酵母表达质粒。转化毕赤酵母GS115筛选高表达菌株。结果：成功构建了酵母表达载体pPIC-Arg,转化毕赤酵母GS115后筛选到分泌表达目的蛋白Arg的菌株,目标蛋白可以分泌到培养基中。经过膜过滤和凝胶过滤层析对培养基上清进行纯化,即可获得纯度达到95%的活性产物。活性测定表明,纯化的Arg比活性为310 IU/mg。结论：成功构建了Arg的毕赤酵母高效表达菌种,建立了目标物质的分离纯化工艺。     

可溶性人TNFR75的表达、纯化及活性鉴定

将编码可溶性人TNFR75 (shTNFR75 )的cDNA与酵母整合载体pPICZαA重组 ,构建的重组质粒线性化后转染酵母细胞GS 115 ,获得了shTNFR75在酵母细胞中遗传性稳定表达酵母工程细胞 .甲醇诱导的pPICZαA shTNFR75 GS115重组酵母工程细胞培养上清 ,经CNBr活化的TNF Sepharose4B亲和层析柱纯化 ,纯化产物纯度为 92 % ;经Western印迹分析 ,可被TNFR75单克隆抗体特异性识别 ,分子量约为 31kD ;受体配体结合试验 ,shTNFR75纯化产物与rhTNFα和rhTNFβ的结合能力与其阳性对照基本相同 ;中和试验显示 ,该shTNFR75可完全阻断TNF对L92 9细胞的细胞毒活性 .表明酵母系统分泌表达的shTNFR75产物具有良好的结合TNF的能力 .     

人CNTF突变体(CNTFM)基因的克隆、表达和产物纯化及活性鉴定

采用PCR的方法对睫状神经营养因子(CNTF)基因进行改造,获得CNTF突变体基因(CNTFM) ,将CNTFM基因克隆入表达载体pBV2 2 0 ,在大肠杆菌BL 2 1(Gold)中进行了表达.目的蛋白占细胞总蛋白5 5 %左右,以包涵体形式存在,经Superdex 75凝胶过滤柱一步纯化和复性,获得纯度达90 %目的蛋白.纯化的重组CNTFM蛋白能促进培养的鸡胚背根神经节长出神经突起,能明显减轻实验小鼠的体重,表明CNTFM具有良好的体内、体外生物学活性,为开发新型高效的减肥药奠定了基础.