代谢工程改造甘油代谢途径提高β-胡萝卜素产量

甘油是生物柴油的副产物,因其价格低廉和高还原性,成为生物发酵的重要碳源。为了进一步提高工程菌对甘油的利用能力,从而提高萜类化合物的合成能力,本研究从β-胡萝卜素高产菌CAR015出发,对其甘油代谢途径的多个基因进行了调控。首先敲除了编码3-磷酸甘油抑制子的glp R基因,然后分别用M1-37、M1-46和M1-93三个不同强度的人工调控元件对glp FK、glp D和tpi A三组基因进行单基因调控和多基因组合调控。研究发现用M1-46调控glp D基因后β-胡萝卜素产量达到了64.82 mg/L,是CAR015的4.86倍,甘油消耗速率也提高了100%;调控tpi A基因后β-胡萝卜素产量略有提高;调控glp FK基因后β-胡萝卜素产量略有降低。说明Glp D是甘油代谢途径中的关键限速步骤。Q-PCR结果表明,降低甘油代谢途径的glp D和glp FK基因转录水平,增加tpi A基因转录水平,可以增加细胞生长速度、提高β-胡萝卜素产量,可能是因为减少了丙酮醛毒性所致。组合调控glp D和tpi A基因,获得β-胡萝卜素产量最高菌株Gly003,其β-胡萝卜素产量达72.45 mg/L、产率达18.65 mg/g每克干细胞,分别是出发菌株CAR015的5.23倍和1.99倍。总之,Glp D是甘油代谢途径中的关键限速步骤,适当强度调控glp D,可以有效提高重组大肠杆菌的β-胡萝卜素产量。     

RBS文库调控重组大肠杆菌β-胡萝卜素合成途径关键基因提高β-胡萝卜素合成能力

β-胡萝卜素属于类胡萝卜素家族的一员,在药品、保健品、化妆品和食品行业有广泛的应用。本研究通过用RBS文库对重组大肠杆菌CAR005中β-胡萝卜素合成途径的关键基因dxs、idi和crt操纵子进行调控来提高β-胡萝卜素合成能力。研究发现3个基因分别用RBS文库调控后,与起始菌株相比β-胡萝卜素产量最高分别有7%、11%和17%的提高,表明使用RBS文库调控比使用多个固定强度启动子调控能筛选到更有利于目标产品合成的基因表达强度。三基因组合调控后,β-胡萝卜素产量相对于CAR005菌株提高了35%。同时发现,单基因文库筛选到的最优强度对于组合调控来说,未必是最优强度。本研究为利用基因表达调控优化目标产物合成途径提供了一种新的方案。     

酿酒酵母中高效积累β-胡萝卜素的代谢途径构建

β-胡萝卜素是一种橘黄色的脂溶性色素,属于类胡萝卜素家族,基于其丰富的生物学活性,在食品、医药、化妆品等领域具有广泛的应用。国内外对β-胡萝卜素市场需求量巨大,特别是天然来源的β-胡萝卜素具有广阔的市场前景,建立适合天然β-胡萝卜素生产的微生物细胞工厂显得尤为重要。本研究利用基因工程手段克隆了β-胡萝卜素生物合成途径中的三个基因,分别是来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的香叶基香叶基焦磷酸合成酶基因(ScBTS1)、红法夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)的八氢番茄红素脱氢酶基因(XdCrtI)以及同时具有八氢番茄红素合成酶和番茄红素环化酶的双功能酶基因(XdCrtYB),构建组成型表达载体pYES2-Kan-CrtI-CrtYB-BTS1,并转化至酿酒酵母MKP-o中,最终筛选获得能够生产β-胡萝卜素的酿酒酵母基因工程菌株。结果显示,此工程菌摇瓶产量达到14.53 mg/g细胞干重(DCW)且发酵周期短,不仅可以稳定高效地积累β-胡萝卜素,同时发酵过程中无需添加诱导剂,有利于节约生产成本。因此,可以将其作为一株具有较高β...     

多个调控元件调控萜类合成途径基因表达提高β-胡萝卜素的生产

强启动子对于获得目标产物最大代谢流量来说并不一定是最优的;相比之下,使用多个具有不同强度的调控元件对基因表达进行调控更有可能获得最优的表达强度.为了对比使用多个调控元件和使用强启动子调控萜类合成途径基因表达对β-胡萝卜素生产的影响,并通过对关键基因的组合调控提高β-胡萝卜素的生产.文中使用6个强度差异很大的人工调控元件,对萜类合成途径的8个基因进行调控.对于不同的基因,其最适的调控元件强度各不相同.对8个基因的调控使β-胡萝卜素产量提高1.2～3.5倍.和以前报道不一样的是,文中发现用适当强度的调控元件对dxr、ispG和ispH基因进行调控后,也能提高β-胡萝卜素的生产.对dxs和idi基因的组合调控将β-胡萝卜素产量提高了8倍,最终β-胡萝卜素产量达17.59 mg/g干重细胞.结果表明使用多个不同强度的调控元件对基因表达进行调控比仅使用强启动子调控更为有效,为提高目标产品合成能力提供了一种新的基因表达调控方案.     

β-胡萝卜素合成的代谢工程研究进展

β-胡萝卜素是自然界中最重要的商业化生产的植物色素之一,具有多种生理功能和生物活性。自上世纪60年代开始,随着系统生物学概念的提出以及对类胡萝卜素合成途径研究的不断深入,系统代谢工程在提高类胡萝卜素产量方面发挥了重要作用。文中在介绍β-胡萝卜素传统生产方法的基础上,重点介绍了如何运用系统代谢工程手段构建β-胡萝卜素高产菌株,并分析了进一步提高工程菌β-胡萝卜素产量所面临的主要问题及可能的解决方案,为β-胡萝卜素的高效生产提供了思路。     

植物β-胡萝卜素羟化酶研究进展

-β胡萝卜素羟化酶是植物类胡萝卜素合成代谢中的关键酶,它催化了植物中β-胡萝卜素经中间产物β-隐黄素合成玉米黄素的过程。β-胡萝卜素羟化酶广泛存在于植物、蓝藻和细菌等生物中,其基因在植物中成对出现,在原核生物中则处于基因簇内。该酶是一种非血红素双铁单加氧酶,分子中有富含组氨酸的模体。多种生物的β-羟化酶基因已被克隆并分别在细菌、蓝藻或植物中表达。玉米黄素能帮助植物抵御胁迫环境,β-隐黄素对癌症等人类疾病有抑制作用。采用基因工程手段改造β-羟化酶基因,将为培养高抗逆性作物和大规模生产β-隐黄素提供新途径。     

代谢工程改造酿酒酵母生产β-胡萝卜素

β-胡萝卜素在食品、药品和化妆品领域有广泛用途。为获得生产β-胡萝卜素的微生物细胞工厂,本研究首先在酿酒酵母BY4742中过表达甲羟戊酸(MVA)途径的限速酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)基因及二萜化合物合成的关键酶牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶(GGPS)基因,来提高牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)的供给。在酿酒酵母底盘菌BY4742-T2的基础上整合来源于成团泛菌和红法夫酵母的β-胡萝卜素合成基因,比较酿酒酵母工程菌生产β-胡萝卜素的差别。结果表明提高酿酒酵母中HMGR和GGPS酶基因的表达能将工程菌中β-胡萝卜素的产量提高26.0倍。另外,来源于真核生物红法夫酵母的合成基因相比成团泛菌,更有利于酿酒酵母生产β-胡萝卜素。最终获得的酿酒酵母工程菌BW02能生产1.56 mg/g细胞干重的β-胡萝卜素,为进一步获得高产β-胡萝卜素细胞工厂提供基础。     

通过转基因提高β-胡萝卜素生物合成量

在黄花龙胆 (Getianalutea)花瓣中获得了植物类胡萝卜素生物合成途径中的 5个基因GGPS、PSY、ZDS、LycB、LycE ,它们分别位于类胡萝卜素合成途径中生成α 和 β 胡萝卜素的上游 .将其中的主要酶基因PSY、ZDS与 35S启动子和NOS终止子相连 ,通过根癌农杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens)转入烟草 ,并通过RT PCR ,Northern分子杂交 ,Western分子杂交等证实这些基因在RNA、蛋白质水平能较好转录及表达 .高效液相层析法分析显示 ,这些基因的翻译产物具有酶的活性 .结果表明 ,PSY可使 β 胡萝卜素含量提高 1 0 8% .     

稳定表达MVA途径基因提高番茄红素产量

萜类化合物的直接前体物质异戊烯焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸酯(DMAPP)可以由2-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸途径(MEP途径)和甲羟戊酸途径(MVA途径)合成。在已经优化MEP合成途径、番茄红素合成途径关键基因表达的重组大肠杆菌LYC101中,引入MVA途径基因,进一步提高重组大肠杆菌合成萜类化合物的能力。质粒pALV23和pALV145是本实验室在研究MVA途径基因协调表达时,用核糖体结合位点(RBS)文库连接MVA途径各基因构建质粒文库,而筛选到的有效提高β-胡萝卜素产量的质粒。首先比较了两个质粒分别在低产和高产番茄红素的菌株中对番茄红素合成的影响。结果表明,两个质粒在高、低产番茄红素的菌株中都可以有效提高番茄红素产量。在高产菌LYC101中pALV23比pALV145使番茄红素产量更高。然后,用CRISPR-Cas9系统辅助同源重组的方法,将MVA途经基因和启动子一共6.7kb的条带整合到LYC101菌株的染色体上,得到遗传稳定的菌株LYC102。LYC102的番茄红素产率达40.9mg/g,是出发菌株LYC101产率的2.19倍,比用质粒表达MVA途径基因的菌株提高了20%。在重组大肠杆菌中同时表达MVA途径和MEP途径,可以有效提高萜类化合物产率;文中构建了不含质粒的、遗传稳定的高产番茄红素菌株,为产业化合成番茄红素提供基础;同时构建平台菌株,可以用于其他萜类化合物合成。     

基因crtI对重组酿酒酵母β-胡萝卜素产量的影响

本文研究了在一株表达红法夫酵母色素合成相关基因crtE、crtYB、crtI和酿酒酵母HMG1功能域的重组酿酒酵母菌株Sc-EYBIH中,再表达一个拷贝crtI基因,对重组酵母Sc-EYBIH中β-胡萝卜素产量的影响。结果表明再表达crtI基因后,重组酿酒酵母Sc-EYBIH+I中β-胡萝卜素产量达到1136.17μg/g,是出发菌株Sc-EYBIH产量(358.82μ/g)的3倍。且重组菌株Sc-EYBIH+I的死亡率明显要低于不产色素的对照菌株Sc-vector。。这些结果显示,本研究所构建的重组菌ScEYBIH+I有着较好的色素产量和优异的生长性能,无论是用来生成色素类物质还是生产其他生物制品都有着广泛的应用前景。     

盐藻β-胡萝卜素异构体胁迫积累的HPLC研究

采用HPLC技术分析了盐藻在胁迫条件下积累β-胡萝卜素异构体的规律.结果表明：胁迫条件增强,有利于全反式异构体积累,胁迫条件减弱有利于顺式异构体的积累.即: 32℃,10 000 lx,18%盐度积累的全反式异构体含量最多(2.593 mg/L),25℃,自然光照射,24%盐度积累的顺式异构体含量最多(0.630 mg/L);顺式异构体种类及数量随不同的胁迫条件而不同,25℃,自然光照射,24%盐度,培养30 d测到全反式异构体及2种顺式异构体,32℃,10 000 lx,18%盐度培养30 d测到全反式异构体及一种顺式异构体;相同胁迫条件不同时间异构体积累也不同.在18%盐度,25℃,10 000 lx光照条件下,0 d只测到全反式异构体,8 d,19 d分别测出全反式异构体及2种顺式异构体,34 d测到全反式异构体及一种顺式异构体.     

培养方式对盐藻生长和积累β-胡萝卜素的影响

盐藻细胞生长和积累β-胡萝卜素的最佳条件存在差异,通过正交实验获得盐藻生长最适浓度C、N、P的分别为15、2．0、0．2mmol／L,累积β-胡萝卜素最适浓度分别为15、1．0,0．1mmol／L。比较了一次添加型、分次添加型、不完全更换型和完全更换型4种培养方法对生长和累积β-胡萝卜素的影响,发现完全更换型培养方式有利于β-胡萝卜素的积累。中途补给10mmol／L NaHCO3也有利于藻细胞积累β-胡萝卜素。在实验最佳条件下藻液中的β-胡萝卜素含量是对照的1．43倍。可采用先快速培养盐藻细胞、后更换培养基、添加NaHCO3分段培养方式以促进细胞大量合成β-胡萝卜素。     

植物β-胡萝卜素羟化酶的生物信息学分析

采用生物信息学方法对GenBank中的拟南芥、玉米、龙胆、福寿草和水仙等植物β-胡萝卜素羟化酶(BCH)的核苷酸和氨基酸序列进行了比对分析,进而对其组成成分、理化性质、信号肽、亚细胞定位、疏水性/亲水性、跨膜结构域、功能结构域、基序及蛋白质二级结构等重要参数进行了预测和分析。结果表明,BCH基因全长约为1256bp,具有完整的开放阅读框,长约为943bp,编码313个氨基酸,分子量为34.82kD,理论等电点为9.18,含量最丰富的氨基酸都包含Ala(10.34%)、Leu(8.7%)和Gly(8.1%);无信号肽,定位于叶绿体中的亲水性不稳定蛋白,含有3-4个跨膜结构域,一个功能结构域,二级结构均以α-螺旋和无规则卷曲为主要构件。     

产β-胡萝卜素酿酒酵母工程菌的构建

以酿酒酵母SaccharomycescereviaiaeBY4742为宿主菌,利用DNA组装（DNAassemble）技术,向宿主菌导入了β-胡萝卜素合成途径,表达了源自Xanthophyllomycesdendrorhous的CrtE,Cn馏和CrtI3个基因,获得了一株染色体整合型工程菌株HCCB08531,β-胡萝卜素产量达3．68mg／g干重。     

组合代谢调控提高大肠杆菌对氨基苯甲酸产量

对氨基苯甲酸是一种重要的有机合成中间体,广泛应用于医药、染料等行业。近年来对氨基苯甲酸作为一种潜在的高强度共聚物单体越来越受到重视。对氨基苯甲酸作为叶酸合成的前体之一,其合成在大肠杆菌体内由叶酸合成途径的pabA、pabB和pabC三个基因负责,催化分支酸合成对氨基苯甲酸。本研究以实验室构建的酪氨酸高产工程菌TYR002作为出发菌株,首先弱化双功能分支酸突变酶/预苯酸脱氢酶TyrA的表达,以减少酪氨酸积累,然后利用3种不同强度的组成型启动子分别调控pabA、pabB和pabC的表达。摇瓶发酵表明不同的组合调控模式下大肠杆菌发酵培养基中的对氨基苯甲酸积累量存在显著差异,最高可获得0.67 g/L的摇瓶发酵产量。进一步通过发酵条件优化和分批补料发酵,在5L发酵罐中获得了6.4g/L的对氨基苯甲酸产量。本研究为改善对氨基苯甲酸生物合成效率提供了重要理论参考。     

大肠杆菌角鲨烯合成途径的构建与调控

角鲨烯因其具有良好的抗氧化功能而被广泛应用于食品、医药、化妆品、工业应用等领域。本实验在大肠杆菌中构建角鲨烯合成途径,通过对其合成途径中关键限速酶(1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶和异戊烯基二磷酸异构酶)过表达的方法进行初步调控,使角鲨烯的产量提升了近三倍。之后采用单因素试验对其发酵培养基和培养条件进行优化,以此来提高角鲨烯的产量。优化发酵条件后,使用最优发酵培养基——TB培养基,在最佳发酵条件:37℃,220r/min培养至OD600约为1.2时加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG诱导剂,25℃条件下诱导48h,角鲨烯产量可达73.88mg/L。     

β-胡萝卜素对阿魏蘑菌体形态及其产漆酶的影响

前期研究发现β-胡萝卜素为阿魏蘑和胶红酵母共培养过程中提高漆酶活性的关键因子。本文研究β-胡萝卜素的最佳添加量、添加时间和消耗情况,以及胶红酵母和β-胡萝卜素对阿魏蘑的形态的影响。结果表明,在阿魏蘑单培养中β-胡萝卜素的最佳添加量为10 mg(0.067%),最优添加时间为48 h,漆酶酶活达到7 083 U/L,为单培养的2.9倍。在形态研究中发现中小型菌球和粗糙型菌球都有利于产漆酶。结果显示通过添加β-胡萝卜素和控制阿魏蘑的菌体形态均可提高漆酶的产量,为漆酶的工业化生产提供了新的尝试和方法。     

β-胡萝卜素的生物合成与发酵促进剂

本文论述了β－胡萝卜素的生物合成途径及某些发酵助剂对微生物产β－胡萝卜素的影响。据对甘些植物和真菌产生β－胡萝卜素的研究,认为β－胡萝卜素及相关类胡萝卜素是一类自己酰ＣＯＡ开始的次生代谢产物。通过大量的研究实例表明,添加合适的发酵促进剂是提高β－胡萝卜素产量和降低生产成本非常有效的工艺学途径。     

南丰蜜橘β-胡萝卜素羟化酶基因内含子的鉴定和分析

植物β-胡萝卜素羟化酶(简称β-羟化酶)是玉米黄素合成过程中的关键酶。柑橘、拟南芥、大白菜等多种植物β-羟化酶基因都已被克隆。柑橘中合成玉米黄素的中间产物β-隐黄素的含量远远高于其它植物,推测柑橘与其它植物的β-羟化酶基因相比有一些特殊的差异。本研究以南丰蜜橘为材料,克隆了柑橘β-羟化酶全长基因,并对该基因内含子进行定位和分析,结果表明南丰蜜橘β-羟化酶基因具有6个内含子,其中内含子6的长度远大于拟南芥和大白菜中相应的内含子。进一步研究发现内含子6中有两段特殊序列,一段长122 bp,另一段长95 bp。特别是122 bp序列两端具有反向重复序列,全序列中含有许多不同的转录起始原件。二级结构预测其对应RNA二级结构能构形成较稳定的发夹结构。     

螺旋藻中β-胡萝卜素高效液相色谱测定方法的研究

采用高效液相色谱法直接测定螺旋藻中β-胡萝卜素组分的含量.色谱柱为YMC-pack ODS(4.6mm i.dx 150 mm,5μm),流动相为甲醇-乙腈-二氯甲烷(体积比60:30:10),在435nm波长处检测.研究结果表明:β-胡萝卜素的检测限为20ng,线性范围在4.60～36.80 mg/L,相关系数为0.9996,加样平均回收率为96.61%.方法准确、简便、快速,适用于螺旋藻及螺旋藻制品中β-胡萝卜素组分的检测.