基于结构B因子分析指导的头孢菌素C酰化酶动力学稳定性改造

【目的】筛选Pseudomonas sp.SE83 acy Ⅱ定点饱和突变库,获得动力学稳定性提高的头孢菌素C(CPC)酰化酶突变体,并对突变酶进行初步的结构-功能关系分析。【方法】靶标酶Pseudomonas sp.SE83 acy Ⅱ与Pseudomonas diminuta N176具有较高的同源性,通过分析N176的结构B因子,构建CPC酰化酶SE83定点饱和突变库;基于pH指示剂显色法,采用Biomek FX~P自动工作站建立CPC酰化酶高通量筛选方法,获得优良突变酶,对其活性、稳定性等酶学性质进行表征;利用SWISS-MODEL对突变体进行同源建模,探讨突变体结构与功能的关系。【结果】通过B因子分析和同源结构比对,共找出9个靶标位点;经过3轮筛选,发现R218及K226位点突变显著提高酶的热稳定性,其中最显著的R218Q和K226V在40°C的半衰期分别为野生型的3.77和2.77倍,催化效率k_(cat)/K_m分别为野生型的1.8和3.1倍。同源建模分析表明氢键作用和疏水相互作用的增加可能是突变体稳定性提高的原因。【结论】B因子指导的酶分子改造是一种高效可靠的动力学稳定性改造策略,突变体R218Q和K226V均可提高CPC酰化酶的稳定性和催化效率,对进一步的CPC酰化酶分子改造具有一定的参考价值和指导意义。     

亚热带山区土壤未培养微生物L-赖氨酸脱羧酶Ldc1E中关键氨基酸残基的功能鉴定

本研究旨在探讨L-赖氨酸脱羧酶Ldc1E关键氨基酸在底物识别和催化过程中的作用;通过生物信息学方法选择突变位点,并利用直接定点突变技术,完成了6个关键氨基酸残基突变和功能鉴定研究。突变酶D692N最适温度和pH值分别为40℃和6.5。突变酶D692N比野生型Ldc1E对高温具有更强的耐受性,在40℃～55℃温浴1 h后剩余酶活力达到35%以上,在60℃温浴1 h后仍然保留20%的酶活力;而野生型酶Ldc1E在50℃以上温浴1 h后几乎失活。此外,50 mmol/L DMSO、5 mmol/L Al~(3+)和Ca~(2+)对突变酶的酶活力有激活作用,而Al3+对野生型酶Ldc1E具有明显抑制作用。突变酶D692N的分子动力学常数K_m升高了1.78倍,k_(cat)下降了20.2倍。突变酶S221A、H245A、D330A、H366A、F607Y经检测酶催化活性丧失。研究结果表明氨基酸残基位点D692对酶与底物的结合具有重要影响;而S221、H245、D330、H366、F607是Ldc1E酶活性能够体现的关键氨基酸位点,不可替换。本研究为探究L-赖氨酸脱羧酶的结构与功能关系提供理论参考。     

定向进化-易错PCR方法提高华根霉Rhizopus chinensis CCTCC M201021脂肪酶的活力

运用定向进化-易错PCR的方法,提高了华根霉Rhizopus chinensis CCTCC M201021脂肪酶的活力。经过两轮易错PCR和pNPP顶层琼脂法筛选,从第一轮和第二轮突变库中分别筛选获得最佳突变株1-11和2-28,脂肪酶酶活与野生菌株相比分别提高2倍和4倍。基因比对结果表明,突变脂肪酶2-28有4个氨基酸发生了突变:A129S、K161R、A230T、K322R。蛋白质分子空间结构模拟显示,突变A129S、K161R、A230T位于脂肪酶分子表面。突变A230T增强了α-螺旋盖结构的稳定性。突变K322R处在loop上,靠近脂肪酶底物结合区域,与邻近的Asp(带负电)形成盐桥。静电引力将该loop向底物进入酶活性中心的通道口反方向牵引,使底物分子更易进入酶活性中心。酶学性质研究表明,突变株2-28脂肪酶的Km值比出发菌株下降了10%,Kcat值提高为原来的2.75倍。     

持续性内切酶EG5C-1的改造及酶学性质

为了提高glycosyl hydrolase 5 (GH5)家族的持续性内切酶EG5C-1的催化活性,对EG5C-1进行同源建模和分子对接,分析确定了活性架构区域内的23个关键氨基酸残基,并通过丙氨酸扫描、饱和突变和组合突变等方法最终获得催化活性显著提高的突变体D70Q/S235W,并分析其酶学性质。结果表明：D70Q/S235W的最适反应温度为60℃,最适pH为6.0。以羧甲基纤维素钠(CMC)和微晶纤维素(Avicel)为底物进行水解产物分析,突变体D70Q/S235W的主要水解产物为纤维二糖和纤维三糖。本研究筛选获得催化活性和酶学性质显著提高的突变体,可为纤维素酶的蛋白质工程改造奠定基础。     

人类线粒体肌酸激酶uMtCK的底物结合位点分析

研究人类线粒体肌酸激酶u Mt CK的结合位点,将其与底物肌酸和ATP结合有关的关键氨基酸进行突变,并对突变体进行酶动力学和圆二色谱数据分析,探讨这些关键氨基酸在底物识别和催化过程中的作用。结果显示,与野生酶相比,突变体Q313A和R336A的K_m~(Cr)分别提高了2.6和2.9倍,k_(cat)下降了19%和55%;同样地,与ATP结合相关的突变体R125A和R287A分别使得K_m~(ATP)升高了3.2和4.2,k_(cat)下降了72%和38%。以上结果表明突变体R125A、R287A、Q313A和R336A影响对底物的结合,同时也降低了酶促反应的速度。利用圆二色谱比较野生酶与不同突变体的二级结构并无明显变化,但进一步的结构模拟表明底物结合位点氨基酸在与底物之间的氢键对底物的识别和酶催化过程中发挥着重要作用。     

大肠杆菌β—D—半乳糖苷酶的定位突变及突变酶的动力学性质

利用人工合成的寡核苷酸探针,将编码大肠杆菌β-D-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)的Lac Z基因中537位Glu密码子GAA分别用GAC(Asp)、CAA(Gln)、GTC(Val)来替代,替代后的突变酶的催化活性显著降低.同天然β-D-半乳糖苷酶相比,作用于ONPG底物时,突变酶的k_(cat)值分别为0.13%(Asp-537)、0.0006%(Gln-537)、0.0035%(Val-537),但它们的K_m值并无明显改变.无论是天然酶还是突变酶,底物类似物IPTG是一个强有力的抑制剂,而过渡态类似物2-脱氧-2-氨基-半乳糖和L-核糖只对突变酶有微弱的抑制作用.活化剂叠氮钠的激活作用小于β-D-半乳糖苷酶的Glu-461突变酶.催化甲醇成酯反应的能力小于天然酶.突变酶对热更不稳定.以上结果表明Glu-537残基是该酶催化反应的必需基团.     

大肠杆菌β-D-半乳糖苷酶的定位突变及突变酶的动力学性质

利用人工合成的寡核苷酸探针,将编码大肠杆菌β-D-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)的Lac Z基因中537位Glu密码子GAA分别用GAC(Asp)、CAA(Gln)、GTC(Val)来替代,替代后的突变酶的催化活性显著降低.同天然β-D-半乳糖苷酶相比,作用于ONPG底物时,突变酶的k_(cat)值分别为0.13%(Asp-537)、0.0006%(Gln-537)、0.0035%(Val-537),但它们的K_m值并无明显改变.无论是天然酶还是突变酶,底物类似物IPTG是一个强有力的抑制剂,而过渡态类似物2-脱氧-2-氨基-半乳糖和L-核糖只对突变酶有微弱的抑制作用.活化剂叠氮钠的激活作用小于β-D-半乳糖苷酶的Glu-461突变酶.催化甲醇成酯反应的能力小于天然酶.突变酶对热更不稳定.以上结果表明Glu-537残基是该酶催化反应的必需基团.     

一个新的L-半胱亚磺酸脱羧酶基因的分析和突变

【目的】完成一个来源于碱性污染土壤宏基因组文库的新的L-半胱亚磺酸脱羧酶基因undec1A的鉴定,研究其酶学性质并利用非理性设计技术对其进行分子改造。【方法】以p ETBlue-2为表达载体构建包含undec1A基因的重组表达质粒,转化至宿主细胞E.coli Tuner(DE3)p Lac?中构建重组表达克隆,采用镍亲和层析完成了酶蛋白的分离纯化,完成其生化特征研究,利用连续易错PCR技术对Undec1A蛋白进行分子改造。【结果】生物信息学分析结果揭示Undec1A蛋白与已知的L-半胱亚磺酸脱羧酶存在类似的辅酶结合位点和底物识别催化基序等。分子对接结果显示氨基酸残基Val237、Asp239、Asp266、Ile267、Ala268和Lys298等决定了与底物分子L-半胱亚磺酸的识别和结合催化。以L-半胱亚磺酸作为底物,重组Undec1A蛋白的最适作用p H为7.0,最适作用温度为35°C;分子动力学常数K_m为(1.557±0.015)mmol/L,V_(max)为(49.07±3.19)μmol/(L·min),k_(cat)为(45.80±1.32)/min。利用连续易错PCR技术完成了亲本酶的分子改造,分离筛选到了一个酶活力更高的突变酶Undec1A-1180。在优化条件下,Undec1A-1180的比活力较亲本酶提高了约5.62倍。【结论】本研究为构建牛磺酸的生物合成工艺提供了理论参考,因而具有重要的实践意义。     

理性设计二硫键提高华根霉脂肪酶热稳定性

【背景】华根霉脂肪酶的工业应用前景广泛,但是受到酶热稳定性较差的限制。【目的】对华根霉Rhizopus chinensis CCTCC M201021脂肪酶r27RCL分子结构进行理性设计,以提高该酶热稳定性。【方法】以Disulfide by design软件筛选r27RCL分子表面能够形成二硫键的突变位点,共得到7对二硫键突变。利用全质粒PCR进行定点突变,并在毕赤酵母中表达获得突变酶。【结果】最佳突变酶m9/10 (S85C-Q145C)与野生型酶r27RCL相比,60°C下的半衰期分别提高了4.5倍,T_m值提高了4.2°C,而催化活性保持不变。蛋白质晶体结构模拟显示,位于β2折叠上的85C和位于α4螺旋上的145C可形成二硫键,从而提高酶的热稳定性。【结论】酶分子中引入新增二硫键可以显著提升酶的热稳定性。     

不依赖油水界面激活的黑曲霉脂肪酶突变体的构建

为获得不依赖油水界面激活的黑曲霉脂肪酶 (ANL) 突变体,在生物信息学分析基础上,对黑曲霉脂肪酶盖子结构域两侧铰链区的氨基酸残基进行了置换突变,获得两个黑曲霉脂肪酶突变体 (ANL-Ser84Gly和ANL-Asp99Pro)。对不同浓度对硝基苯丁酸酯的水解活性检测结果表明：ANL-Ser84Gly的催化活性仍依赖油水界面,而ANL-Asp99Pro的催化活性不再依赖油水界面。底物特异性检测结果表明：较ANL而言,ANL-Ser84Gly的比活力显著降低,其水解对硝基苯棕榈酸酯、对硝基苯豆蔻酸酯、对硝基     

六种藓类植物茎的比较解剖学研究

通过对6种藓类植物,即褶叶青藓(Brachythecium salebrosum(Web.et Mohr.)B.S.G.)、湿地匐灯藓(Plagiomnium acutum(Lindb.)Kop.)、侧枝匐灯藓(Plagiomnium maximoviczii(Lindb.)Kop.)、大凤尾藓(Fissidensnobilis Griff.)、大羽藓(Thuidium cymbifolium(Doz.et Molk.)B.S.G.)和大灰藓(Hypnum plumaeforme Wils.)嫩茎和老茎的石蜡切片和显微观察发现,同一藓类植株的嫩茎和老茎,茎结构稳定,不同种藓类植物茎横切面具有不同特征.植物体茎横切面形状、表层细胞的层数、细胞大小和细胞壁厚薄、皮层细胞大小和形状、中轴的有无以及比例等特征可以作为藓类植物的分科分类依据之一.     

真菌类遗传学分析的知识结构教学

本文以认知结构理论为指导,讨论了真菌类遗传分析与高等动植物遗传分析的内在联系,认为利用这种内在联系进行教学可收到好的效果并说明了作者的具体教学过程。 Abstract:In the paper, the relationship between genetic analysis of Fungi and genetic analysis of high animal and plant was discussed.A good results were obtained when we adopted this method in the teaching.     

医疗机构合理用药评价模型的构建研究

目的 针对医疗机构的合理用药水平进行评价研究。方法 根据医疗机构合理用药的具体要求,构建医疗机构合理用药评价指标体系,采用基于模糊群决策的方法和多指标评价分析法构建医疗机构合理用药评价模型。结果 构建了基于模糊群决策的医疗机构合理用药评价模型,并通过实例分析证明了评价模型的可行性。结论 建立的基于模糊群决策的医疗机构合理用药评价模型能够对医疗机构的合理用药水平进行科学评价,为提高医疗机构合理用药水平奠定基础。     

Cause of Senescence of Nine Sorts of Flowers

The levels of endogenous phytohormones and respiratory rate in nine sorts of flowers such as Cymbidium faberi Rolfe, Nopalxochia ackermannii Kunth and others were investigated both at full bloom and senescence and meanwhile the effect of exogenous phytohormones on prolonging the blossoms and promoting ethylene production were tested. There is a high content of endogenous ethylene in all the long-lived flowere, about 3–16 folds higer than the short-lived ones. There is a high level of ABA at full blooming flowers of short-lived flowers, in which there is no or only some cytokinins in it, but the ratio of CTK (6BA+zeatin)/ABA is smaller(l.7). The endogenous ABA reached a much higher level at senescence in all nine sorts of flowers, so it is reasonable to consider that it is ABA which plays an important role of regulation in controlling flower's senescence. There is a much higher level of GA3 and zeatin in the long-lived flowers which is not demonstrated in the shortlived ones. The respiratory rate is one of the factors controtling the longevity of flowers, but it does not play a decided role. Application of 6BA and zeatin prolongs distinctly orchid’s longevity, however exogenous IAA through the promotive action on ethylene production, evidently extends the longevity of the flowers of the Nopalxochia ackermannii Kunth.     

棉铃虫钙粘蛋白N端多肽多克隆抗体制备及对Bt抗性的初步检测

用重组表达的棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)中肠钙粘蛋白N端多肽片段制备兔多克隆抗体,并利用其对Bt抗性进行鉴定。通过RT-PCR方法对棉铃虫中肠钙粘蛋白N端多肽的基因片段Cad285进行PCR扩增,将其克隆到pET-30a原核表达载体中,在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,得到35ku的重组融和蛋白,融合表达的包涵体经过变性、Ni-NTA柱亲和纯化、复性等方法处理包涵体,获得可溶性纯化蛋白,用纯化后蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体,ELISA检测其效价高于1∶16000;利用最终获得的多克隆抗体对室内纯合Bt抗/感品系的棉铃虫中肠钙粘蛋白进行Western blot分析,结果显示敏感和抗性品系之间有明显差异,表明其能够应用对Bt抗性进行初步检测。     

Photoregulation of seed germination of wild-type and of an aurea-mutant of tomato

Seed germination of an aurea mutant of tomato ( Lycopersicon esculentum Mill.) is promoted by continuous irradiation with red, far-red or long-wavelength far-red (758 nm) light as well as by cyclic irradiations (5 min red or 5 min far-red/25 min darkness). Far-red light applied immediately after each red does not change the germination behaviour. Seed germination of the isogenic wild-type, cv. UC-105, is promoted by continuous and cyclic red light while it is inhibited by continuous and cyclic far-red light and by continious 758 nm irradiation. Far-red irradiation reverses almost completely the promoting effect of red light. The promoting effect (in the aurea mutant) and the inhibitory effect (in the wild-type) of continuous far-red light do not show photon fluence rate dependency above 20 nmol m⁻² s⁻¹. It is concluded that phytochrome controls tomato seed germination throgh low energy responses in both the wild type and the au mutant. The promoting effect of continuous and cyclic far-red light in the au mutant can be attributed to a greater sensitivity to P_fr.     

龙胆科药用植物化学成分的研究现状

龙胆科植物在我国的分布范围很广,且多数为药用植物,其多数种属的药用植物,至今其化学成分尚未被系统研究。综述了目前龙胆科药用植物的化学成分的研究现状及一般提取方法,对近年来发现的环烯醚萜及裂环烯醚萜类化合物进行了总结,为本科药用植物的更深入研究提供了参考。