高效体积排阻色谱法定量检测口蹄疫疫苗中146S的疫苗预处理方法

旨在建立一种口蹄疫灭活病毒疫苗的处理方法,去除尺寸排阻色谱法(HPSEC)检测146S抗原过程中的杂质干扰,获得最佳的检测信号并实现146S抗原含量的准确测定。分别考察了超速离心法、PEG沉淀法、核酸酶消化法对两批疫苗样品中的HPSEC检测干扰杂质的去除效果。在优化条件下,超速离心法处理后146S检测结果分别为7.1、7.6μg/mL,PEG沉淀法为9.7、10.4μg/mL;酶消化法处理后的检测值最高,分别为10.5、10.4μg/mL,且杂质去除完全、处理速度快、操作条件温和。通过响应面法确定最优酶消化处理条件如下:200μL水相中添加终浓度421 U/mL的Benzonase,25.1℃下反应1.29 h。在该最优条件下,对4家企业各3种不同血清型共12批疫苗样品进行146S含量检测,结果表明建立的方法对不同疫苗均有良好适用性,且重复性好(RSD5.3%,n=3)。通过该处理方法,解决了杂质对146S定量检测的干扰,扩大了HPSEC检测技术的应用范围,进一步确保了检测结果的准确可靠。     

体积排阻液相色谱法质粒的含量测定

首次以体积排阻液相色谱法进行质粒提取液浓度的测定研究,通过纯质粒溶液在260 nm处的紫外吸峰面积与质粒浓度之间数据的线性最小二乘拟合,得到了反映质粒浓度和紫外吸收峰峰面积之间关系的标准曲线:Y=2×10~(-5) X,通过验证实验,确定了质粒提取液中不同组分,如核糖核酸,蛋白质等在色谱图中的出峰位置.结合标准曲线测定了自制的质粒提取液的质粒浓度为0.32 mg/mL.该方法方便,快捷,准确.     

应用高效体积排阻色谱偶联多角度激光散射鉴定猪圆环病毒2型灭活疫苗及病毒样颗粒疫苗抗原

本文旨在建立基于高效体积排阻色谱(high-performance size-exclusion chromatography,HPSEC)偶联多角度激光散射仪(multi-angle laser light scattering,MALLS)的猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)疫苗抗原检测方法。以纯化的PCV2灭活病毒及病毒样颗粒(virus-like particles,VLP)为参照,对4家生产企业的2种PCV2灭活病毒疫苗(a、b)及VLP疫苗(c、d)破乳后进行HPSEC-MALLS检测及分子量分析;结合PCV2抗原检测卡、Western blotting和透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM),鉴定了特征色谱峰;考察了方法的重复性和检测线性。结果表明,两家企业生产的PCV2灭活病毒疫苗破乳液水相经HPSEC分离,在保留时间约13.3 min处出现抗原特征峰;MALLS计算该色谱峰分子量分别为2.61×10⁶(±4.34%) Da和2.40×10⁶(±2.51%) Da。两种VLP疫苗也在13.3 min处出现抗原特征峰,分子量分别为2.09×10⁶(±2.94%) Da和2.88×10⁶(±11.85%) Da,接近PCV2的理论分子量;同时在保留时间约11.4 min处也出现色谱峰,经检测分子量为4.37×10⁶(±0.42%) Da,TEM表征显示为VLP二聚体。取疫苗d和PCV2 VLP纯品进行重复检测,抗原色谱峰面积的RSD(n=3)均小于1.5%,重复性好;将PCV2 VLP纯品梯度稀释检测,VLP及其多聚体的色谱峰面积与浓度均呈良好的线性关系,R²分别为0.999及0.997,能够满足定量及多聚体含量分析。该方法有望成为一种准确、高效的PCV2疫苗的体外评价方法,用于质量评价与提升。     

新型冠状病毒灭活疫苗抗原含量检测方法的建立

目的 建立新型冠状病毒(新冠病毒)灭活疫苗抗原含量检测的双抗体夹心ELISA方法,并对该方法检测2家企业疫苗的适用性进行验证。方法 使用羊抗S蛋白抗体作为包被抗体,兔抗S蛋白抗体作为显示抗体,建立了双抗体夹心ELISA方法,并对方法的准确度、精密度进行验证;分别使用该方法及企业自建方法对2家企业生产的各20批次疫苗产品进行检测,评价方法的一致性。结果 成功建立了新冠病毒灭活疫苗抗原含量检测方法,该方法线性良好,R²>0.99。方法验证结果显示,对于2家企业疫苗回收率均在80%～120%范围内,试验内与试验间CV均<10%。方法比对结果显示,该方法与企业方法检测结果比值对于A企业比值在0.83～1.22之间,平均为1.02;与B企业比值在0.91～1.07之间,平均为0.99;不同方法检测结果差异无统计学意义(P>0.05)。结论 成功建立了新冠病毒灭活疫苗抗原含量检测方法,该方法的准确性与精密度良好,并且对国内2家企业生产的疫苗具有较好的适用性。     

酶标抗原火箭免疫电泳法及其在蛇毒抗原成分含量测定中的应用

为解决目前蛇毒成份检测困难以及寻找一种可用于蛇伤快速鉴别诊断的方法,本研究建立了酶标抗原火箭免疫电泳法。本法结合了酶标法灵敏度高和火箭电泳操作简单的特点,对待测的同种抗原标记辣根过氧化物酶(酶标抗原),检测时把微量的酶标记抗原掺入被测样品中,在含多价抗血清的免疫电泳板进行电泳。最后用辣根过氧化物底物3.3′-二氨基联苯胺在板上直接显色,显色后观察到的免疫沉淀线高度与被测抗原含量呈正相关(r=+0.98)。采用本方法检测眼镜蛇毒细胞毒素和限镜王蛇毒 L-氨基酶氧化酶,细胞毒素的最低检测浓度为110ng/ml,氨基酸氧化酶为60ng/ml。比单向火箭免疫电泳法灵敏度高30倍。用同一原理的酶标记抗原融合电泳法监测L-氨基酸氧化酶的层析分离时,比酶活性法检测灵敏度高20倍。全部检测只需30分钟。初步观察商品眼镜蛇毒抗血清可对蛇毒15种成分产生免疫沉淀线,眼镜蛇的细胞毒与同科异科蛇毒的细胞毒素无交叉免疫反应。因此,采用本法可以确定不同蛇种蛇毒中所含的特异性抗原,获得蛇伤鉴别诊断的依据。     

气相色谱法测定抗毒素中的间甲酚含量

采用气相色谱法测定抗毒素中的间甲酚含量。样品用苯甲醇作内标,经高氯酸沉淀蛋白、氯仿抽提后,通过HP-INNO-WAX柱,以氢火焰检测器测定间甲酚含量。内标峰与样品峰的分离度大于1.5,平均回收率及变异系数分别为100.067%和1.93%,测定线性范围0.0202~1.7588mg/ml,最小检测限为0.01272mg/ml,该方法准确快速,比化学方法好。     

组织蛋白酶S在抗原提呈过程中的作用

效应T细胞激活需要两个或以上的信号诱导.抗原肽结合MHC-Ⅱ分子的溶酶体途径（第一信号）包括两个重要的步骤：不变链（invariant chain Ii）降解和抗原加工.目前所知的溶酶体蛋白酶中,组织蛋白酶S（cathepsin S,cat S）被认为以非冗长的作用参与了上述两步过程,其还参与了降解细胞外基质（extracellular matrix,ECM）的过程.因此被认为在调节免疫、自身免疫性疾病、抗肿瘤免疫、组织重塑等方面是具有潜力的研究靶点.     

高效液相色谱法测定茶叶中的氟含量

建立了一种高效液相色谱法快速、准确测定茶叶中氟。样品经浸泡提取后,以邻苯二甲酸为背景吸收,以Agilent ZORBAX-ODS柱（4.6mm×250mm,5μm）,流动相为乙腈-0.1mol/L邻苯二甲酸溶液（15∶85,V∶V）,柱温35℃,检测波长294nm,流速1.0mL/min的条件进行实验。结果表明：氟在0.5～10.0μg/mL范围内线性关系良好,平均回收率为101.0%。建立的方法准确、可靠,可以用于茶叶中氟的含量检测。     

电导率仪在测定发酵液体积中的应用

本文简要介绍了用电导率仪测定发酵罐中液体培养基体积的方法。该方法准确、快速、方便,是测定发酵液体积的较好方法。     

白细胞介素-21与乙型肝炎病毒前S2S抗原融合蛋白在293T细胞中的表达

目的:构建白细胞介素-21(interleukin-21,IL-21)和乙型肝炎病毒前S2S抗原(S2S)的融合表达质粒,并研究其在293T细胞中的表达。方法:采用PCR方法扩增IL-21和HBV前S2S基因片段,分别克隆入pcDNA3真核表达质粒,用分子克隆方法构建融合表达质粒,并以脂质体2000转染293T细胞,分别应用ELISA法和Western Blot法检测细胞上清及细胞中IL-21和HBsAg的表达水平。结果:经酶切鉴定及DNA序列证实重组质粒内插入片段序列正确,三种重组质粒分别命名为pcDNA-IL-21、pcDNA-S2S和pcDNA-IL-21-S2S,并且重组质粒能在293T细胞内表达并分泌相关蛋白。结论:成功构建IL-21和乙型肝炎病毒前S2S抗原的融合表达质粒,重组质粒能在真核细胞内表达。     

一种新型T细胞免疫原的原核表达及对口蹄疫疫苗的免疫增强作用

主要探讨了T细胞免疫原TI对口蹄疫疫苗的免疫增强作用。设计并原核表达产生了一种包含口蹄疫病毒VP1,VP4,3A和3D蛋白上多个T细胞表位与两个通用T细胞表位的T细胞免疫原,命名为TI;同时表达了O和Asia 1两个型口蹄疫病毒 VP1 蛋白的串联编码基因,表达产物命名为OA-VP1。将上述T细胞免疫原分别与OA-VP1和口蹄疫灭活疫苗按不同剂量组合免疫小鼠,于免疫后不同时间测定各组小鼠的体液与细胞免疫应答情况。采用微量中和试验检测小鼠O型和Asia1型中和抗体,采用流式细胞检测技术和测定γ-干扰素的水平来分析不同免疫组小鼠细胞免疫的水平。结果显示,与灭活疫苗或OA-VP1单独免疫组相比,添加TI抗原后灭活疫苗 (P＜0.01) 和OA-VP1免疫组(P＜0.05)小鼠均能产生高水平的特异性中和抗体;且CD4+ T细胞数量显著增多,IFN-γ产生水平显著升高 (P＜0.01)。说明TI抗原具有很好的诱导特异性体液与细胞免疫应答的作用,是一种很好的免疫增效剂,可作为口蹄疫蛋白亚单位疫苗和灭活疫苗中的一种有效成分,以提高疫苗的免疫效果。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3AB双抗体夹心ELISA方法的建立

抗原纯净度是口蹄疫(Foot-and-mouthdisease,FMD)灭活疫苗质量检验的一项重要内容,一般采用疫苗2–3次免疫动物后,检测非结构蛋白(Non-structuralprotein,NSP)抗体是否阳转,判断疫苗抗原的纯净度。文中旨在建立定量检测FMD灭活疫苗抗原中NSP3AB含量的ELISA方法,为疫苗质量控制提供参考方法。利用口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdiseasevirus,FMDV)NSP3A单克隆抗体和辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)标记的3B单克隆抗体,建立定量检测NSP3AB含量的双抗体夹心ELISA检测方法。采用原核表达并纯化的3AB蛋白作为标准品,标准品系列稀释,绘制标准曲线,以标准品与未加抗原的阴性对照吸光值(OD)的比值大于2.0的标准品最低浓度为最低检测限。标准品浓度介于4.7–600.0 ng/mL之间时,测得的OD值与浓度呈线性相关,回归曲线呈直线,相关系数R2=0.99,确定最低检测限为4.7ng/mL。检测12份未纯化灭活抗原中3AB蛋白含量介于9.3–200.0ng/mL之间;而纯化后的...     

Effect of the extract made from Cochinchina momordica seeds on the humoral immune responses of mice to a commercial foot-and-mouth disease vaccine (serotypes O and Asia 1)

The extract from ECMS was investigated for its effect on the humoral immune responses to foot-and-mouth disease vaccination. Fifty-six mice were randomly divided into seven groups with eight animals in each. Mice in groups 5 to 7 were subcutaneously (s.c.) injected with 0.5 mg DEX daily for 4 days to induce immunosuppression. The animals were then orally given ECMS (200 μg in 250 μl saline) in groups 3 and 6 or 250 μl saline in group 2, or s.c. injected with ECMS (50 μg in 100 μl saline) in groups 4 and 7 or 100 μl saline in group 5. After that, the animals in groups 2 to 7 were s.c. immunized twice with 100 μl of commercial oil-adjuvanted bivalent FMDV vaccine (serotypes O and Asia 1) at intervals of 21 days. Mice in group 1 received injection of 100 μl saline only. After 2 weeks, blood was sampled to determine FMDV-specific IgG and isotype IgG1, IgG2a, IgG2b and IgG3. Results indicated that oral administration or s.c. injection of ECMS augmented responses of specific IgG and most IgG isotypes. Giving ECMS tended to enhance serum-specific IgG and IgG isotype responses of mice immunosuppressed by s.c. injection of DEX. Considering the safety and immunomodulatory effect of ECMS in both normal and immunosuppressed mice demonstrated in the present study, this extract deserves further investigation to evaluate its potential in improving FMD vaccination in farm animals such as pigs, sheep and cattle.     

Recombinant Bivalent Vaccine against Foot-and-Mouth Disease VirusSerotype O／A Infection in Guinea Pig

Foot-and-mouth disease (FMD) is a highly contagiousdisease of cloven-hoofed animals such as cattle and pig.The disease causes explosive epidemics and heavyeconomic losses in the agriculture worldwide [1]. FMDvirus (FMDV) shows a high genetic and antigenicvariability, and has seven serotypes: O, A, C, AsiaI, SAT1,SAT2 and SAT3 [2]. The FMDV control is mainly imple-mented using chemically inactivated virus vaccines, whichmay contain residual living virus and pose a risk of virusreleas…     

Modelling studies to estimate the prevalence of foot-and-mouth disease carriers after reactive vaccination

Foot-and-mouth disease (FMD) is a highly contagious and economically significant viral disease of cloven-hoofed animals. Vaccination can be used to help restrict the spread of the infection, but evidence must be provided to show that the infection has been eradicated in order to regain the FMD-free status. While serological tests have been developed, which can identify animals that have been infected regardless of vaccination status, it is vital to know the probable prevalence of herds with FMD carriers and the within-herd prevalence of those carriers in order to design efficient post-epidemic surveillance strategies that establish freedom from disease. Here, we present the results of a study to model the expected prevalence of carriers after application of emergency vaccination and the impact of this on the sensitivity of test systems for their detection. Results showed that the expected prevalence of carrier-containing herds after reactive vaccination is likely to be very low, approximately 0.2%, and there will only be a small number of carriers, most likely one, in the positive herds. Therefore, sensitivity for carrier detection can be optimized by adopting an individual-based testing regime in which all animals in all vaccinated herds are tested and positive animals rather than herds are culled.     

高效液相尺寸排阻色谱-多角度激光散射定量检测灭活禽流感病毒抗原中完整病毒颗粒

本研究旨在建立一种灭活禽流感病毒原料液中完整病毒颗粒准确定量的方法。针对直接采用高效液相尺寸排阻色谱法（high performance size exclusion chromatography,HPSEC）检测灭活禽流感病毒原液存在杂质干扰的问题,首先以H5N8型抗原为对象,分别考察了聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）沉淀和离子交换色谱法（ion exchange chromatography,IEC）进行预处理。在优化条件下,经DEAE FF阴离子交换层析纯化预处理,杂蛋白去除率为86.87%,病毒血凝回收率为100%。HPSEC分析预处理后的样品,8.5–10.0 min处色谱峰样品电泳检测显示主要为H5N8病毒蛋白,动态光散射分析平均粒径为127.7 nm,推测为完整病毒特征峰;在IEC预处理后的样品中加入抗体进行HPSEC检测,8.5-10.0 min处特征峰消失,显示IEC预处理有效去除了杂质干扰。通过将HPSEC与多角度激光散射技术（multi-angle laser scattering technique,MALLS）联用,可以准确获得样品中完整病毒颗粒的数量,且病毒颗粒数与色谱峰面积具有良好线性关系（R²=0.997）。建立的IEC预处理-HPSEC-MALLS检测方法应用于其他亚型（H7N9）、批次和浓度的病毒原液中完整病毒颗粒数的准确检测,均具有良好适用性,且重复性好,相对标准偏差（relative standard deviation,RSD）<5%,n=3。